本發(fā)明屬于癌癥標(biāo)記物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種根據(jù)辣根過氧化物酶(HRP)與沉淀型3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)反應(yīng)在紙芯片上遷移距離不同，通過免疫法定性半定量檢測抗原的方法。

背景技術(shù)：

紙質(zhì)微流控芯片(μPADs)首次被Whitesides提出，由于其具有成本低、操作簡單、化學(xué)相容性好等特點(diǎn)，為紙芯片的發(fā)展提供了廣闊的平臺。紙芯片是集固定、反應(yīng)、分離、檢測于一體的微型分析平臺，方便快捷，已大量用到疾病標(biāo)記物的檢測，如前列腺蛋白、免疫球蛋白、癌胚抗原、甲胎蛋白等。對于紙芯片自身來說，它是一種常見的纖維材料，表面含有大量的羥基官能團(tuán)，很容易進(jìn)行功能化處理，修飾其它基團(tuán)，比如傳統(tǒng)的殼聚糖-戊二醛交聯(lián)法、高碘酸鈉改性法等，因此，比較易實(shí)現(xiàn)抗體或者蛋白質(zhì)的固定，可以高效的用于生物分析和各種疾病檢測。

紙質(zhì)微流控芯片可以直接用于檢測，目前檢測方法中，常見的有比色分析法、熒光、電化學(xué)、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光的方法。在這些分析方法中，比色法是其最常見的方法，通過紙芯片上顏色的改變來測定樣品的含量，但該方法需要眼睛對顏色做出靈敏的辨別，而人眼睛的分辨率不超過4K，檢測的靈敏度低，不利于低含量樣品的測定，很難達(dá)到定性和定量的要求，且需要特定圖片處理軟件達(dá)到對樣品檢測的目的。熒光分析法靈敏度高，但在紙芯片中很難克服高的背景信號。電化學(xué)檢測法中需要電極，成本高，操作復(fù)雜。化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光的方法都需要特殊檢測儀器和專業(yè)技術(shù)操作人員。因此，近年來新興的距離檢測法因其無需檢測儀器、專業(yè)技術(shù)操作人員、操作簡單、成本低廉等特點(diǎn)而受到了青睞，并發(fā)展成為紙芯片上的新興檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種操作簡便、成本低、無需復(fù)雜儀器，根據(jù)HRP與沉淀型TMB反應(yīng)產(chǎn)生距離長短變化對抗原進(jìn)行定性半定量檢測的方法。

解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案由下述步驟組成：

1、利用畫圖軟件設(shè)計(jì)出紙芯片模型，然后利用刻字機(jī)的切割刀按照紙芯片模型在Whatman濾紙上切割出紙芯片。

2、將紙芯片經(jīng)氧等離子體處理，使其表面生成用于固定抗體的醛基。

3、將捕獲抗體溶液滴加到紙芯片的檢測區(qū)，室溫孵育30分鐘后，用pH＝7.4的PBS緩沖液洗滌，除去未反應(yīng)的捕獲抗體；然后在檢測區(qū)滴加牛血清蛋白溶液，室溫反應(yīng)15分鐘后，用pH＝7.4的PBS緩沖液洗滌，除去未反應(yīng)的牛血清蛋白；再將抗原溶液滴加到檢測區(qū)，室溫孵育15分鐘后，用pH＝7.4的PBS緩沖液洗滌，除去未反應(yīng)的抗原；最后在檢測區(qū)滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體溶液，室溫孵育15分鐘，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。

4、將步驟3形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物的檢測區(qū)剪下固定在長60～80mm、寬2～3mm的Whatman濾紙條一端，用pH＝7.4的PBS緩沖液沖洗后，在檢測區(qū)加入藍(lán)色沉淀型TMB顯色液，反應(yīng)2～3分鐘后，測量剩余辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體與TMB反應(yīng)后在Whatman濾紙條上的遷移距離。

5、按照上述步驟3～4測量實(shí)際血清樣品，根據(jù)剩余辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體與TMB反應(yīng)后在Whatman濾紙條上對應(yīng)的遷移距離，即可實(shí)現(xiàn)實(shí)際血清樣品中抗原的定性及半定量檢測。

上述步驟1中，優(yōu)選紙芯片至少有4個(gè)圓形檢測區(qū)，每個(gè)檢測區(qū)的直徑為5～6mm。

上述步驟2中，優(yōu)選氧等離子體處理的時(shí)間為3～5分鐘，氧等離子體的頻率為射頻13.56MHz、功率為100W。

上述的抗原為癌胚抗原、甲胎蛋白抗原、前列腺蛋白抗原、免疫球蛋白抗原等中的任意一種。

上述的捕獲抗體溶液是將捕獲抗體加入到pH＝7.4的PBS緩沖液中配制而成，其中捕獲抗體的濃度為15～25μg/mL。

上述的牛血清蛋白溶液是將牛血清蛋白加入pH＝7.4的PBS緩沖液中配制而成，其中牛血清蛋白的濃度為0.1～0.5mg/100mL。

上述的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體溶液是將辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體加入pH＝7.4的PBS緩沖液中配制而成，其中辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體的濃度為100～250μg/mL。

上述的藍(lán)色沉淀型TMB顯色液的加入量優(yōu)選為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體溶液體積的12～15倍。

上述的紙優(yōu)選Whatman 1號濾紙或Whatman 3號濾紙。

本發(fā)明根據(jù)競爭免疫反應(yīng)完全后，剩余辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體在Whatman濾紙條上與TMB反應(yīng)，導(dǎo)致毛細(xì)作用力不同而引起的遷移距離不同，首次提出HRP與沉淀型TMB反應(yīng)能產(chǎn)生距離長短變化，并且利用距離變化檢測抗原，無需檢測儀器即可實(shí)現(xiàn)不同濃度癌癥標(biāo)記物的定性及半定量檢測，該方法只需用普通測量長度的工具尺子測量不同濃度分析物質(zhì)產(chǎn)生的距離，即可對物質(zhì)性質(zhì)做出判斷，真正實(shí)現(xiàn)了簡單快速、成本低廉的分析，在普通的化學(xué)及生物相關(guān)實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行，克服了傳統(tǒng)比色分析法眼睛對顏色識別的局限性，以及熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)分析方法等需要昂貴檢測儀器、操作復(fù)雜、需要專業(yè)操作等不足，非常適合于個(gè)體對自我癌癥早期預(yù)防與監(jiān)測，在人們的日常生活中也展現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1設(shè)計(jì)的紙芯片的實(shí)際效果圖。

圖2是實(shí)施例1中經(jīng)過夾心免疫反應(yīng)后不同濃度癌胚抗原與沉淀型TMB反應(yīng)距離變化實(shí)際效果圖。

圖3是實(shí)施例1中經(jīng)過夾心免疫反應(yīng)后不同濃度實(shí)際血清樣品中癌胚抗原與沉淀型TMB反應(yīng)距離變化實(shí)際效果圖。

圖4是沉淀型TMB與HRP反應(yīng)產(chǎn)生距離變化圖。

圖5是非沉淀型TMB與HRP反應(yīng)產(chǎn)生距離變化圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1

1、利用CorelDraw X6畫圖軟件設(shè)計(jì)出紙芯片模型，如圖1所示，該紙芯片模型具有8個(gè)直徑為6mm的圓形檢測區(qū)、1個(gè)直徑為6mm的進(jìn)樣區(qū)和廢液區(qū)，各個(gè)區(qū)之間經(jīng)流通通道連接，流通通道寬為2mm、長為3mm；然后利用日圖CE5000-40-CRP刻字機(jī)的切割刀按照上述紙芯片模型在Whatman 1號濾紙上切割出紙芯片。

2、將紙芯片放入PDC-32G型氧等離子體清洗機(jī)中處理4分鐘，氧等離子體的頻率為射頻13.56MHz、功率為100W，處理完后紙芯片表面生成用于固定抗體的醛基。

3、將2.5μL 20μg/mL癌胚抗原的捕獲抗體溶液(將捕獲抗體加入到pH＝7.4的PBS緩沖液中配制而成)滴加到紙芯片的檢測區(qū)，室溫孵育30分鐘后，用pH＝7.4的PBS緩沖液在環(huán)爐(環(huán)爐結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)Ring-Oven Washing Technique Integrated Paper-based Immunodevice for Sensitive Detection of Cancer Biomarker(Anal.Chem.2015,87,7951-7957)中公開的相同)上洗滌5分鐘，除去未反應(yīng)的抗體；然后在檢測區(qū)滴加2.5μL 0.1mg/100mL牛血清蛋白溶液(將牛血清蛋白加入pH＝7.4的PBS緩沖液中配制而成)，室溫反應(yīng)15分鐘，以封閉紙芯片上未反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，減少非特異性吸附，反應(yīng)完后再用pH＝7.4的PBS緩沖液在環(huán)爐上洗滌5分鐘，除去未反應(yīng)的牛血清蛋白；再分別將濃度為0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的癌胚抗原溶液(癌胚抗原(CEA)來自癌胚抗原定量檢測試劑盒)滴加到檢測區(qū)，室溫孵育15分鐘后，用pH＝7.4的PBS緩沖液在環(huán)爐上洗滌5分鐘，除去未反應(yīng)的抗原；最后在檢測區(qū)滴加2.5μL 200μg/mL辣根過氧化物酶標(biāo)記的癌胚抗體溶液(將辣根過氧化物酶標(biāo)記的癌胚抗體加入pH＝7.4的PBS緩沖液中配制而成)，室溫孵育15分鐘，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。

4、將步驟3形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物的檢測區(qū)剪下固定在長70mm、寬2mm的Whatman1號濾紙一端，用10μL pH＝7.4的PBS緩沖液沖洗后，在檢測區(qū)加入20μL藍(lán)色沉淀型TMB顯色液，反應(yīng)2分鐘后，測量剩余辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體與TMB反應(yīng)后在Whatman濾紙條上的遷移距離，結(jié)果見圖2及表1。

表1

注：當(dāng)CEA含量≤5ng/mL時(shí)判為陰性；當(dāng)CEA含量在5ng/mL～20ng/mL時(shí)判為弱陽性；當(dāng)CEA含量≥20ng/mL時(shí)判為陽性。

5、按照上述步驟3和4的方法測定在1～6號實(shí)際血清樣品(其中癌胚抗原采用標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法測定的濃度分別為2.63ng/mL、18.55ng/mL、1.27ng/mL、14.28ng/mL、4.12ng/mL、19.26ng/mL)加入藍(lán)色沉淀型TMB顯色液后，剩余辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體與TMB反應(yīng)后在Whatman濾紙條上的遷移距離，結(jié)果見圖3。

由圖3的結(jié)果可見，1號、3號、5號對應(yīng)的遷移距離小于正常人體中癌胚抗原(CEA)對應(yīng)的遷移距離，即這三個(gè)實(shí)際血清樣品中癌胚抗原的濃度小于5ng/mL，說明該人體內(nèi)癌胚抗原的值在正常范圍內(nèi)，2號、4號、6號對應(yīng)的遷移距離大于正常人體中CEA對應(yīng)的遷移距離，但小于表1中癌胚抗原濃度為20ng/mL對應(yīng)的遷移距離，說明這三個(gè)實(shí)際血清樣品中癌胚抗原的濃度大于5ng/mL小于20ng/mL，建議定期動(dòng)態(tài)觀察。由此可見，本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了癌胚抗原的定性及半定量分析。

發(fā)明人分別采用沉淀型TMB、非沉淀型TMB與不同濃度的HRP進(jìn)行反應(yīng)，具體試驗(yàn)方法如下：

將酶標(biāo)板用二次水洗干凈并烘干，然后向一個(gè)酶標(biāo)板每孔加入100μL藍(lán)色沉淀型TMB顯色液和不同濃度HRP，另一個(gè)酶標(biāo)板每孔加入100μL非沉淀型TMB和不同濃度HRP(HRP的濃度分別為25μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、6μg/mL、1μg/mL、500ng/mL)，反應(yīng)20秒后，將得到的紙芯片用鑷子豎直插入到酶標(biāo)孔中，反應(yīng)30min觀察區(qū)別，結(jié)果見圖4和圖5。由圖可見，沉淀型TMB與HRP反應(yīng)可以產(chǎn)生距離長短變化，而非沉淀型TMB與HRP反應(yīng)不能產(chǎn)生距離長短變化。