本發(fā)明涉及醫(yī)學檢測及體外診斷領(lǐng)域，一種組合定向劑優(yōu)化膠乳偶聯(lián)抗體檢測前白蛋白(PA)的方法。
背景技術(shù)：
：：前白蛋白(Prealbumin，PA)，又稱轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin)，分子量5.4萬，由肝細胞合成，在電泳分離時，常顯示在白蛋白的前方，其半衰期很短，僅約1.9天。因此，測定其在血漿中的濃度對于了解蛋白質(zhì)的營養(yǎng)不良、肝功能不全、比之白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白具有更高的敏感性。除了作為一種靈敏的營養(yǎng)蛋白質(zhì)指標，PA在急性炎癥、惡性腫瘤、肝硬化或腎炎時其血濃度下降。目前臨床尚無公認的血清PA測定的參考方法，臨床實驗室測定血清PA含量的方法主要有免疫比濁法，包括免疫散射比濁法和免疫透射比濁法。近年來，比濁法測定技術(shù)因其具有簡便、快速、自動、微量等特點，逐漸成為臨床實驗室測定血清PA的常規(guī)方法，又由于膠乳微球偶聯(lián)技術(shù)的興起及快速發(fā)展，漸漸使免疫比濁與膠乳微球結(jié)合，形成了普通免疫比濁技術(shù)的衍生，成為一種相較于免疫比濁法更簡便快速，靈敏度更高，信號更強的檢測方法，但該方法也存在其局限性，及偶聯(lián)效果的不可控性，使得膠乳微球的利用率不高，因此，找到一種提升抗體與膠乳微球間偶聯(lián)效果的方法，提高膠乳微球的利用率，增強反應效果是本領(lǐng)域亟需解決的技術(shù)問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：：鑒于以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種組合定向劑優(yōu)化膠乳偶聯(lián)抗體檢測前白蛋白(PA)的方法，所述的方法基于膠乳增強免疫比濁法，其特點在于利用一種組合定向劑：定向劑1與定向劑2，按照定向劑1先結(jié)合PA抗體，形成PA抗體復合物，定向劑2再結(jié)合PA抗體復合物，最后分別與兩種不同粒徑的羧基膠乳微球偶聯(lián)形成PA膠乳微球顆粒。本發(fā)明的技術(shù)方案：將組合定向劑中的定向劑1與PA抗體結(jié)合，形成PA抗體復合物。將組合定向劑中的定向劑2與PA抗體復合物再結(jié)合。最后加入兩種不同粒徑的經(jīng)活化的羧基膠乳微球進行偶聯(lián)，形成PA膠乳顆粒。以此方法為基礎(chǔ)制備檢測試劑盒，試劑1包括緩沖液、穩(wěn)定劑和防腐劑，試劑2包括PA膠乳微球、緩沖液、保護劑、助懸劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。本技術(shù)方案所述的定向劑1為N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)或長臂活化生物素(BCNHS)，更優(yōu)選長臂活化生物素(BCNHS)。所述的定向劑2為鏈霉親和素。本發(fā)明試劑盒所述試劑1與試劑2中的緩沖液包括但不限于Tris-HCL緩沖液，PBS緩沖液，巴比妥鈉-鹽酸緩沖液，磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液中的一種或幾種，更優(yōu)選PBS緩沖液。PH范圍為7.0-8.0，更優(yōu)選PH7.5-8.0。本發(fā)明試劑盒所述試劑1中的穩(wěn)定劑包括但不限于聚乙二醇8000，蔗糖，甘油，葡萄糖，明膠，氯化鈉，氯化鉀，碳酸鈉，硫酸鈉，硫酸鉀中的一種或幾種，更優(yōu)選聚乙二醇8000與氯化鈉，濃度比為2∶1。本發(fā)明試劑盒所述試劑1與試劑2中的防腐劑包括但不限于疊氮鈉，proclin300，硫柳汞中的一種或幾種。本發(fā)明試劑盒所述試劑2中的保護劑為EDTA。本發(fā)明試劑盒所述試劑2中的助懸劑包括但不限于乙二醇，丙三醇，麥芽糖，蔗糖中的一種或幾種，更優(yōu)選丙三醇。本發(fā)明試劑盒所述試劑2中的穩(wěn)定劑包括但不限于聚乙二醇8000，蔗糖，甘油，葡萄糖，明膠，氯化鈉，氯化鉀，碳酸鈉，硫酸鈉，硫酸鉀中的一種或幾種，更優(yōu)選蔗糖。本發(fā)明中，包括PA膠乳顆粒的制備及PA檢測試劑盒的制備。具體操作如下：PA膠乳顆粒的制備：1)定向劑1結(jié)合PA抗體取濃度為0.5-5μg/ml羊抗人前白蛋白單克隆抗體，與定向劑1：長臂活化生物素(BCNHS)用量比為1∶2(mg∶mg)，混合于PBS緩沖液(200mmol/L，PH7.5)中，按BCNHS與二甲基甲酰胺(DMF)投料比為40∶1(w/v)加入DMF，37℃恒溫振蕩反應60min后，通過superdex200層析分離去除多余BCNHS，PBS緩沖液(200mmol/L，PH7.5)，37℃恒溫振蕩反應20min重懸，獲得PA抗體復合物。2)定向劑2結(jié)合PA抗體復合物按定向劑2：鏈霉親和素與PA抗體復合物的投料比為1∶2(w/v)混合于PBS緩沖液(200mmol/L，PH7.5)中，37℃恒溫振蕩反應30min，通過superdex200層析分離去除多余鏈霉親和素，PBS緩沖液(200mmol/L，PH7.5)，37℃恒溫振蕩反應30min重懸，獲得鏈霉親和素-PA抗體復合物。3)膠乳微球的活化取粒徑分別為50nm-100nm(2.5％w/v)與200nm-300nm(5.0％w/v)的羧基聚苯乙烯膠乳微球，按顆粒比例為80∶20分別用PBS緩沖液(200mmol/L，PH7.5)洗滌后，重新溶于PBS緩沖液(200mmol/L，PH7.5)中，分別加入1％(w/v)碳化二亞胺(EDC)活化，37℃恒溫振蕩反應20min，離心(12000rpm，30min)，去除上清液，用PBS緩沖液(200mmol/L，PH7.5)洗滌兩次后，分別溶于PBS緩沖液(200mmol/L，PH7.5)中37℃恒溫振蕩反應30min重懸，獲得活化的兩種粒徑的膠乳微球，。4)鏈霉親和素-PA抗體復合物與膠乳微球偶聯(lián)將步驟2)獲得的鏈霉親和素-PA抗體復合物按3-5∶1的體積比分別加入到步驟3)獲得的兩種粒徑的活化膠乳微球中，37℃恒溫振蕩反應2h，用0.5％(w/v)賴氨酸封閉20min后，分別進行高速離心(12000rpm，30min)，去除上清液，用PBS緩沖液(200mmol/L，PH7.5)洗滌三次，分別溶于PBS緩沖液(200mmol/L，PH7.5)中37℃恒溫振蕩反應30min重懸，最后將兩種粒徑的PA膠乳微球顆?；旌稀A檢測試劑盒的制備：以上述優(yōu)選材料配制試劑盒(液體雙試劑，R1∶R2為3∶1)，濃度分別為以本發(fā)明方法為基礎(chǔ)所配制的試劑盒，其檢測方法為膠乳增強免疫比濁法，測試條件及參數(shù)如下：1)檢測儀器：具有600nm波長、37℃恒溫裝置的生化分析儀。2)待測樣本：新鮮不溶血血清，可2-8℃保存。3)具體檢測程序：4)校準品的使用及曲線繪制方法：用2.0ml蒸餾水復溶，以蒸餾水對校準液進行倍比稀釋，采用多點定標校準模式。5)計算結(jié)果樣品中PA含量(mg/L)＝ΔAT/ΔAS×校準液濃度式中：ΔAT：以空白管吸光度為對照的樣品管吸光度ΔAS：以空白管吸光度為對照的校準管吸光度本發(fā)明的優(yōu)勢在于：利用兩種不同粒徑羧基聚苯乙烯膠乳微球，在提升靈敏度的同時，具有較好的線性，提高了產(chǎn)品性能。利用組合定向劑提升了抗體與膠乳微球間偶聯(lián)效果，提高了膠乳微球的利用率，增強反應效果。附圖說明：圖1為實施例1中的本發(fā)明線性相關(guān)曲線圖，采用AU480全自動生化分析儀，對5個梯度濃度的試劑進行測定，并對測定值進行相關(guān)分析。其中X軸表示的是稀釋濃度，Y軸表示的是測定值均值。相關(guān)系數(shù)：r2＝0.9931，線性方程為：y＝0.9932x-0.3201。圖2為實施例2中的本發(fā)明線性相關(guān)曲線圖，采用AU480全自動生化分析儀，對5個梯度濃度的試劑進行測定，并對測定值進行相關(guān)分析。其中X軸表示的是稀釋濃度，Y軸表示的是測定值均值。相關(guān)系數(shù)：r2＝0.9952，線性方程為：y＝0.9941x+1.5590。圖3為實施例3中的本發(fā)明與市售試劑盒A線性相關(guān)圖，分別采用本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒A，采用AU480全自動生化分析儀，對50份樣本(包含正常和異常樣本)，按各自參數(shù)進行測定。其中X軸表示的是本發(fā)明試劑盒的測定值，Y軸表示的是市售試劑盒A的測定值。相關(guān)系數(shù)：r2＝0.9940，線性方程為：y＝0.996x+2.497。圖4為實施例4中的本發(fā)明與市售試劑盒B線性相關(guān)圖，分別采用本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒B，采用AU480全自動生化分析儀，對50份樣本(包含正常和異常樣本)，按各自參數(shù)進行測定。其中X軸表示的是本發(fā)明試劑盒的測定值，Y軸表示的是市售試劑盒B的測定值。相關(guān)系數(shù)：r2＝0.9930，線性方程為：y＝1.007x+0.513。具體實施方式：以下通過實施例具體闡明本發(fā)明，僅作為說明本發(fā)明具體內(nèi)容而不用于限制本發(fā)明范圍。實施例1.前白蛋白(PA)檢測試劑盒的配制(1)PA膠乳顆粒的配制與技術(shù)方案中的所提到的過程相同。前白蛋白(PA)檢測試劑盒具體成分配制如下：1)精密度測定：同一樣品中連續(xù)抽取20次進行測定，計算測定值的均數(shù)、標準差和變異系數(shù)，表1精密度檢測結(jié)果變異系數(shù)CV通常用于衡量一項測定方法的精密度，CV值越小，表示該測定方法的結(jié)果精密度越好。對于臨床化學檢驗項目而言，CV小于5％的方法精密度公認是可以接受的。表1中CV值小于5％，表明本發(fā)明試劑盒具有優(yōu)良的精密度。2)準確度測定：用同一質(zhì)控品，重復測定3次，取平均值，與質(zhì)控品靶值相對偏差應在±15％范圍內(nèi)。表2準確度檢測結(jié)果表2中相對偏差CB＝5.32％，處于±15％范圍內(nèi)，表明本發(fā)明試劑盒具有優(yōu)良的準確度。3)線性測定：使用去離子水將試劑稀釋成5個梯度濃度，每個梯度濃度檢測3次，取平均值，對測定值與預期值作回歸分析，計算r值和相對偏差(結(jié)果見圖1，單位mg/L)。表3線性相關(guān)檢測結(jié)果稀釋濃度90.00150.00300.00450.00600.00測定值85.67155.48308.66430.73595.8682.62151.40321.38416.25624.9083.78155.26306.23409.11605.38均值84154312419609絕對偏差5.045.3914.4527.9213.12相對偏差5.66％-3.62％-4.86％6.25％-2.20％通過表3得到相關(guān)系數(shù)：r2＝0.9931，線性方程為：y＝0.9932x-0.3201，結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒相關(guān)性良好，具有很好的特異性和準確性。4)穩(wěn)定性測定：將本發(fā)明試劑盒分別放置在室溫和4℃冰箱，以新鮮配制的300mg/L前白蛋白標準品替代樣品，每隔1個月測定1次，記錄出現(xiàn)凝集所需時間，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，試劑盒在4℃冰箱放置至少6個月以上不會有明顯活性喪失，但不宜在室溫存放。表4穩(wěn)定性檢測結(jié)果室溫下出現(xiàn)凝集的時間(min)4℃下出現(xiàn)凝集的時間(min)新配制0.5新配制0.5存放1個月2存放1個月0.5存放2個月3存放2個月1存放3個月8存放3個月2存放4個月不凝集存放4個月2存放5個月不凝集存放5個月2存放6個月不凝集存放6個月25)特異性測定：選取進行干擾實驗測定，分別取5份質(zhì)控，其中一份做為對照，其他三份分別加入4種潛在干擾物：膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白、類風濕因子，用本發(fā)明試劑盒進行測定，均無抑制效果，表明該試劑盒有良好特異性，結(jié)果如表5所示：表5特異性檢測結(jié)果模擬干擾物加入濃度測定值對照組測定值準確(CB％)膽紅素342μmol/L296mg/L300mg/L-1.3％甘油三酯8.7mmol/L297mg/L300mg/L-1.0％血紅蛋白5.0g/L288mg/L300mg/L-4.0％類風濕因子75U/L307mg/L300mg/L2.3％實施例2.前白蛋白(PA)檢測試劑盒的配制(2)PA膠乳顆粒的配制與技術(shù)方案中的所提到的過程相同。前白蛋白(PA)檢測試劑盒具體成分配制如下：1)精密度測定：同一樣品中連續(xù)抽取20次進行測定，計算測定值的均數(shù)、標準差和變異系數(shù)，表6精密度檢測結(jié)果變異系數(shù)CV通常用于衡量一項測定方法的精密度，CV值越小，表示該測定方法的結(jié)果精密度越好。對于臨床化學檢驗項目而言，CV小于5％的方法精密度公認是可以接受的。表6中CV值小于5％，表明本發(fā)明試劑盒具有優(yōu)良的精密度。2)準確度測定：用同一質(zhì)控品，重復測定3次，取平均值，與質(zhì)控品靶值相對偏差應在±15％范圍內(nèi)。表7準確度檢測結(jié)果表7中相對偏差CB＝8.68％，處于±15％范圍內(nèi)，表明本發(fā)明試劑盒具有優(yōu)良的準確度。3)線性測定：使用去離子水將試劑稀釋成5個梯度濃度，每個梯度濃度檢測3次，取平均值，對測定值與預期值作回歸分析，計算r值和相對偏差(結(jié)果見圖2，單位mg/L)。表8線性相關(guān)檢測結(jié)果稀釋濃度90.00150.00300.00450.00600.00測定值87.43142.89312.19434.63600.1082.69145.74323.77435.32586.5880.95143.72340.97455.60592.74均值84144326442593絕對偏差7.346.5625.857.064.89相對偏差8.06％4.35％-8.62％1.57％0.82％通過表8得到相關(guān)系數(shù)：r2＝0.9952，線性方程為：y＝0.9941x+1.5590，結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒相關(guān)性良好，具有很好的特異性和準確性。4)穩(wěn)定性測定：將本發(fā)明試劑盒分別放置在室溫和4℃冰箱，以新鮮配制的300mg/L前白蛋白標準品替代樣品，每隔1個月測定1次，記錄出現(xiàn)凝集所需時間，結(jié)果見表9。結(jié)果表明，試劑盒在4℃冰箱放置至少6個月以上不會有明顯活性喪失，但不宜在室溫存放。表9穩(wěn)定性檢測結(jié)果5)特異性測定：選取進行干擾實驗測定，分別取5份質(zhì)控，其中一份做為對照，其他三份分別加入4種潛在干擾物：膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白、類風濕因子，用本發(fā)明試劑盒進行測定，均無抑制效果，表明該試劑盒有良好特異性，結(jié)果如表10所示：表10特異性檢測結(jié)果模擬干擾物加入濃度測定值對照組測定值準確(CB％)膽紅素342μmol/L289mg/L300mg/L-3.7％甘油三酯8.7mmol/L305mg/L300mg/L1.7％血紅蛋白5.0g/L309mg/L300mg/L3.0％類風濕因子75U/L291mg/L300mg/L-3.0％實施例3.本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒A的性能指標比較：前白蛋白(PA)檢測試劑盒的配制：PA膠乳顆粒的配制與技術(shù)方案中的所提到的過程相同。前白蛋白(PA)檢測試劑盒具體成分配制如下：對照的市售試劑盒A，其信息如下：產(chǎn)品名稱：前白蛋白測定試劑盒(四川邁克科技有限責任公司)方法：免疫透射比濁法劑型：液體單一試劑(R：2×35ml)試劑盒組成：R：PA試劑羊抗人PA血清消脂劑STD：前白蛋白校準血清基本參數(shù)：方法：終點法；樣品/試劑：1/100；主波長：340nm；副波長：700nm；反應溫度：37℃；反應時間：10min。測定步驟：計算：使用多點非線性/樣條函數(shù)校準模式由儀器自動生成校準曲線后測定樣品含量或以各標準管濃度值作為橫坐標，吸光度變化值作為縱坐標，手工繪制標準曲線圖，查閱該圖即可得樣品含量。市售試劑盒A按說明書操作。1)精密度測定：同一樣品中連續(xù)抽取20次進行測定，計算測定值的均數(shù)、標準差和變異系數(shù)，表11精密度檢測結(jié)果變異系數(shù)CV通常用于衡量一項測定方法的精密度，CV值越小，表示該測定方法的結(jié)果精密度越好。對于臨床化學檢驗項目而言，CV小于5％的方法精密度公認是可以接受的。表11中CV值小于5％，表明本發(fā)明試劑盒比市售試劑盒A具有更好的精密度。2)準確度測定：用同一質(zhì)控品，重復測定3次，取平均值，與質(zhì)控品靶值相對偏差應在±15％范圍內(nèi)。表12準確度檢測結(jié)果表12中本發(fā)明試劑盒相對偏差CB＝4.20％，處于±15％范圍內(nèi)，表明本發(fā)明試劑盒較市售試劑盒A具有更好的準確度。3)線性測定：分別采用本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒A，采用AU480全自動生化分析儀，對50份樣本(包含正常和異常樣本)，按各自參數(shù)進行測定，并對測定值進行相關(guān)分析(結(jié)果見圖3，X軸表示的是本發(fā)明試劑盒的測定值，Y軸表示的是市售試劑盒A的測定值)。相關(guān)系數(shù)：r2＝0.9940，線性方程為：y＝0.996x+2.497，結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒A相關(guān)性良好。表13線性相關(guān)檢測結(jié)果實施例4.本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒B的性能指標比較：前白蛋白(PA)檢測試劑盒的配制：PA膠乳顆粒的配制與技術(shù)方案中的所提到的過程相同。前白蛋白(PA)檢測試劑盒具體成分配制如下：對照的市售試劑盒B，其信息如下：產(chǎn)品名稱：前白蛋白測定試劑盒(美國西門子)方法：免疫比濁法劑型：液體單一試劑(R：4×30ml)市售試劑盒B按說明書操作。1)精密度測定：同一樣品中連續(xù)抽取20次進行測定，計算測定值的均數(shù)、標準差和變異系數(shù)，表14精密度檢測結(jié)果變異系數(shù)CV通常用于衡量一項測定方法的精密度，CV值越小，表示該測定方法的結(jié)果精密度越好。對于臨床化學檢驗項目而言，CV小于5％的方法精密度公認是可以接受的。表14中CV值小于5％，表明本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒B同樣具有較好的精密度。2)準確度測定：用同一質(zhì)控品，重復測定3次，取平均值，與質(zhì)控品靶值相對偏差應在±15％范圍內(nèi)。表15準確度檢測結(jié)果表15中本發(fā)明試劑盒相對偏差CB＝3.56％，處于±15％范圍內(nèi)，表明本發(fā)明試劑盒較市售試劑盒B具有更好的準確度。3)線性測定：分別采用本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒B，采用AU480全自動生化分析儀，對50份樣本(包含正常和異常樣本)，按各自參數(shù)進行測定，并對測定值進行相關(guān)分析(結(jié)果見圖4，X軸表示的是本發(fā)明試劑盒的測定值，Y軸表示的是市售試劑盒B的測定值)。相關(guān)系數(shù)：r2＝0.9930，線性方程為：y＝1.007x+0.513，結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒B相關(guān)性良好。表16線性相關(guān)檢測結(jié)果當前第1頁1 2 3