一種單基因缺失粗糙型布魯氏菌及其疫苗的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種單基因缺失粗糙型布魯氏菌及其疫苗的生產(chǎn)方法。該重組菌株通過非抗性基因篩選技術(shù)，缺失布魯氏菌2308株菌WboA基因1-897bp之間的堿基序列，使其失去了光滑型布魯氏菌細(xì)胞壁LPS結(jié)構(gòu)中O鏈形成的條件，從而由光滑型轉(zhuǎn)變?yōu)榇植谛?。粗糙型重組菌株的安全性顯著提高，但仍保留了對布魯氏菌病良好的免疫效果，該重組牛種布魯氏菌被命名為布魯氏菌r2308-ΔWboA株(CGMCC?No.8885)。以此菌株生產(chǎn)疫苗將改變布魯氏菌疫苗免疫動(dòng)物與野毒株感染動(dòng)物難以區(qū)分的現(xiàn)狀，并有效提高現(xiàn)有疫苗的安全性。
【專利說明】一種單基因缺失粗糙型布魯氏菌及其疫苗的生產(chǎn)方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】本發(fā)明涉及一種單基因缺失粗糙型布魯氏菌及其疫苗的生產(chǎn)方法，該疫苗為牛、羊和豬對布魯氏菌病的預(yù)防用活疫苗，屬獸用生物制品領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]布魯氏菌病(布病)是由布魯氏菌或稱布氏菌(Brucella)引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的人獸共患病，嚴(yán)重地威脅著人和多種動(dòng)物的生命健康。本病不但對動(dòng)物的繁殖和生產(chǎn)性能具有嚴(yán)重危害，更重要的是，人感染布魯氏菌后，往往難以治愈，從而造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此在布魯氏菌流行的國家，消除布病一直是公共衛(wèi)生計(jì)劃中最重要的目標(biāo)之一。目前世界范圍內(nèi)消除該病的主要方法是撲殺與免疫相結(jié)合，對布病發(fā)生相對比較嚴(yán)重的中國，由于撲殺的成本高，疫苗預(yù)防成為本病主要控制手段。
[0003]根據(jù)布魯氏菌表型的差異，可將布魯氏菌分為光滑型(S)和粗糙型(R)兩類，目前在我國使用的布病活疫苗均為光滑型菌株，其免疫帶來的主要問題是使用后無法區(qū)分疫苗免疫與自然感染的動(dòng)物，這在很大程度上限制了布魯氏菌疫苗的使用和推廣，也給布病的有效防治和清除帶來了一定的難度。
[0004]雖然布魯氏菌存在兩種不同的表型，在凝集類抗體水平上無交叉反應(yīng)，但卻具有良好的交叉保護(hù)性，并且不同種來源的布魯氏菌相互之間同樣存在交叉保護(hù)能力。如果用粗糙型布魯氏菌疫苗免疫的動(dòng)物，其血清只與粗糙型抗原發(fā)生凝集反應(yīng)，而與光滑型血清不反應(yīng)，以此可以區(qū)分疫苗生產(chǎn)用菌株和野毒株?；谏鲜鲈颍藗儗Υ植谛筒剪斒暇呙缰甑难邪l(fā)從未間斷過。到目前為止，成功開發(fā)出具有良好免疫原性的粗糙型布魯氏菌疫苗株卻鮮有報(bào)道。
[0005]最早使用過的粗糙型布魯氏菌疫苗是用45/20菌株制備的，但該菌株極不穩(wěn)定，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)從R型到S型的變異，造成毒力返強(qiáng)，因而該疫苗已基本不再使用。90年代美國科學(xué)家通過人工誘變的方法獲得了粗糙型布魯氏菌RB51菌株，該菌株具有良好的免疫力，已在美國和拉美的多個(gè)國家廣泛使用。但目前該菌株在基因水平與原始菌株之間的的區(qū)別尚為完全弄清楚。
[0006]已有的研究證實(shí)布魯氏菌細(xì)胞壁脂多糖(LPS)中的O鏈組成決定了其光滑型或粗糙型的表型，O鏈的某些成分缺失，會(huì)導(dǎo)致菌株由光滑型變成粗糙型。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個(gè)與布魯氏菌光滑型表型相關(guān)的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wbkC、wz和wbkC。本實(shí)驗(yàn)室曾構(gòu)建了 wbkC和wboA基因缺失的重組布魯氏菌疫苗株，并比較了它們之間的免疫效果。其后，又進(jìn)一步構(gòu)建了 wboA基因不完全缺失株，系統(tǒng)地研究了 wboA基因的不同缺失對重組菌的存活率、免疫保護(hù)性以及粗糙型表型等方面的特性，并最終確定了 wboA基因1-897之間的片段為缺失的靶片段。
[0007]雖然有報(bào)告通過插入抗性基因獲得重組粗糙型布魯氏菌，但由于抗性基因?qū)е碌臐撛谏锇踩[患限制了其作為疫苗開發(fā)的可能。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的目的是通過基因同源重組和蔗糖敏感基因的負(fù)篩選技術(shù)，構(gòu)建獲得了具有生物安全意義和良好免疫原性的粗糙型布魯氏菌，以該重組菌制備的布魯氏菌病活疫苗具有比A19更好的安全性，且該疫苗免疫動(dòng)物后不干擾布病的臨床檢測。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案
[0010]1.一種單基因缺失粗糙型布魯氏菌的疫苗生產(chǎn)菌株，該菌株是采用非抗性無痕缺失技術(shù)，缺失了布魯氏菌2308株wboA基因l-897bp之間的序列，構(gòu)建了能夠不干擾布病臨床診斷的粗糙型重組布魯氏菌r2308-AWboA株，用該菌制備的布魯氏菌病活疫苗免疫動(dòng)物后，其血清可用常規(guī)的凝集試驗(yàn)與自然感染相區(qū)分，該重組的牛種布魯氏菌(Brucellaabortus)r2308-Λ WboA菌株已于2014年05月20日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物保藏委員會(huì)普通微生物保藏中心，保藏號為=CGMCCN0.8885。
[0011]2.一種布魯氏菌病疫苗，該疫苗含有活的布魯氏菌CGMCC N0.8885株和獸用生物制品常用的凍干保護(hù)劑。
[0012]3.如權(quán)利要求2所述一種布魯氏菌病疫苗的制備方法，該疫苗是用胰大豆肉湯作為重組菌的培養(yǎng)基，滅菌后按培養(yǎng)基量的按1%~2%接入布魯氏菌CGMCC N0.8885株種子菌液，370C，按常規(guī)方法發(fā)酵培養(yǎng)28~38h，加入獸用生物制品常用的凍干保護(hù)劑，充分混勻、分裝疫苗瓶中后經(jīng)冷凍真空干燥，即成為單基因缺失粗糙型r2308-AWboA株布魯氏菌病疫苗。
[0013]4.一種基因缺失粗糙型布魯氏菌的鑒別診斷，是用如序列7和序列8所屬序列的一對特異性引物，通過PCR方法可以與非重組的原始菌相區(qū)分。
[0014]本發(fā)明是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的:
[0015]1.蔗糖敏感基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建將含有啟動(dòng)子序列的蔗糖敏感基因(SacBK，來自殺質(zhì)粒pKNGlOl，購自英國NCCB。)通過NdeB酶克隆進(jìn)pUC18載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-SacB。將WboA基因(I~897位)的上、下游同源臂(L和R)的PCR產(chǎn)物分別克隆進(jìn)pUC18載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-L-R。通過一對引物，以pUC-L-R為模板，將包含L和R的片段擴(kuò)增后通過Sal擴(kuò)和Sma擴(kuò)克隆進(jìn)pUC_SacB質(zhì)粒中，獲得重組穿梭質(zhì)粒pL_R_SacB。將重組穿梭質(zhì)粒按常規(guī)方法電轉(zhuǎn)化進(jìn)布魯氏菌2308株的感受態(tài)細(xì)胞中。
[0016] 2.重組菌的篩選與鑒定利用PUC18載體中的氨芐抗性(AmpK)以及克隆進(jìn)的蔗糖抗性(SacBK)基因進(jìn)行篩選。首先用50 μ g/ml Amp篩選出重組菌(第一次同源重組)，重組菌在不含氨芐的TSB培養(yǎng)后，再通過5%蔗糖TSA平板篩選出丟失氨芐抗性基因和蔗糖敏感基因全的重組菌(第二次同源重組)。通過一對PCR引物，鑒定wboA基因缺失的重組菌。對獲得的重組布魯氏菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)、血清學(xué)及基因水平檢測，并對重組菌安全性、免疫保護(hù)性進(jìn)行鑒定。
[0017]3.疫苗制備對安全性和免疫原性良好的重組菌，按布魯氏菌S2株作為生產(chǎn)菌株生產(chǎn)布魯氏菌活疫苗的常規(guī)方法(參照(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程二〇〇〇年版.化學(xué)工業(yè)出版社，2001，本發(fā)明簡稱《規(guī)程》)，接種于適宜培養(yǎng)基，收獲培養(yǎng)物，加適宜穩(wěn)定劑，經(jīng)冷凍真空干燥制成活疫苗。用于預(yù)防布魯氏菌病。
[0018]發(fā)明的詳細(xì)描述
[0019]本發(fā)明所涉及基因?yàn)榕c光滑型表型相關(guān)的布魯氏菌WboA基因。本發(fā)明所涉及基因重組技術(shù)包括:利用含蔗糖敏感基因的穿梭質(zhì)粒介導(dǎo)，篩選wboA基因缺失的重組布魯氏菌。
[0020]本發(fā)明通過2次同源重組，無痕缺失了光滑型牛種布魯氏菌2308株的wboA基因第l_897bp之間的序列，最終篩選獲得了粗糙型重組牛種布魯氏菌，命名為牛種布魯氏菌(Brucellaabortus) r2308- Δ WboA 株。
[0021]1.重組布魯氏菌的構(gòu)建及篩選 [0022]本發(fā)明利用同源重組及蔗糖敏感基因的負(fù)篩選技術(shù)，成功構(gòu)建了 WboA基因第l-897bp之間的序列缺失的重組牛種布魯氏菌r2308- Λ WboA株，該重組菌株由光滑型轉(zhuǎn)變?yōu)榱舜植谛汀Ｖ亟M菌在培養(yǎng)基上傳20代后，遺傳性狀穩(wěn)定。動(dòng)物試驗(yàn)表明重組菌的安全性不低于目前我國廣泛使用牛種布魯氏菌疫苗株Α19，該重組菌免疫動(dòng)物后產(chǎn)生的抗體不干擾布病的臨床診斷。
[0023]具體操作方法如下:
[0024](I)PCR擴(kuò)增wboA基因上、下游同源臂
[0025]引物設(shè)計(jì):
[0026]上游同源臂引物(序列I和序列2):
[0027]FffboaL 5，-CGCAGAGCTCGCATCCAGATACATTGAAC-3，(含 SacI 位點(diǎn))；
[0028]Rffboal 5，-CCGTTCTAGAACTGATTTCCCGTGTCAAC-3，(含 XbaI 位點(diǎn))。
[0029]下游同源臂引物(序列3和序列4):
[0030]Fmioa^f -ATGCTCTAGAGACAAGGAGTATGCGCAGC-3，(含 XbaI 位點(diǎn));
[0031]Rwt—5’ -CACGGCATGCTGACCTGATAACACGACTA-3’ (含 SphI 位點(diǎn))。
[0032]用TAKARA(大連寶生物工程公司)的細(xì)菌基因組提取試劑盒(Lot:9763)，參照說明書(見附件I)提取牛種布魯氏菌2308株菌基因組DNA，并以提取的基因組DNA為模板擴(kuò)增wboA上、下游的基因片斷。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C變性5min ；95°C 50s—54°C 50s—72°C lmin，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin。獲得的上游同源臂標(biāo)注為L，下游同源臂標(biāo)注為R。
[0033](2)構(gòu)建用于同源重組的穿梭質(zhì)粒。
[0034]I) pUC-L-R質(zhì)粒的構(gòu)建
[0035]將以上⑴項(xiàng)中PCR獲得的左側(cè)同源臂L，用SacI和XbaI酶雙酶切后，克隆進(jìn)同酶處理的PUC18質(zhì)粒中，按常規(guī)方法篩選重組質(zhì)粒pUC-L ;將其與(I)項(xiàng)中PCR獲得右側(cè)同源臂R均用XbaI和SphI雙酶切后，連接、轉(zhuǎn)化，篩選重組質(zhì)粒pUC-L-R。
[0036]2)穿梭質(zhì)粒pLR-SacB的構(gòu)建
[0037]設(shè)計(jì)引物F: 5’ -CGCAGTCGACGCATCCAGATACATTCAAC-3’ (含 SalT 位點(diǎn)，序列 5) ；R:5，-CAAAcccgggTGACCTGATAACACGTCTA-3，(含 SmaI 位點(diǎn)，序列 6)，以 pUC_L_R質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出包含上、下游同源臂(LR)的大小為1800bp的序列。將該P(yáng)CR產(chǎn)物用Sal和Sma酶切后，克隆進(jìn)同酶處理的PUC-SacB質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存)中，獲得重組質(zhì)粒pLR-SacB。
[0038](3)制備牛種布魯氏菌2308的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌
[0039]將單個(gè)CFU的2308株菌接種于含100mL TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)瓶中，37 °C培養(yǎng)至對數(shù)期中期，將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至冰水中充分冷卻。12000r/min離心10min，棄去培養(yǎng)基，再分別用100ml、50ml、10m、5m、2ml滅菌生理鹽水各離心洗漆一次。最后將獲得的菌體重懸于Iml 10%的甘油水溶液中，此即為待用的感受態(tài)細(xì)菌。
[0040](4)電轉(zhuǎn)化和篩選
[0041 ] I)電轉(zhuǎn)化將3 μ g pLR-SacB質(zhì)粒加入到50 μ I牛種布魯氏菌2308株菌感受態(tài)細(xì)菌中?；靹蚝筠D(zhuǎn)移到電極杯中。電擊電壓:2.5KV ;電擊時(shí)間:5毫秒。電擊完成后，加入1mlSOC培養(yǎng)基，置37°C搖振培養(yǎng)4h后，將全部菌落涂布到含50 μ g/ml氨芐青霉素的TSA平板上，37°C培養(yǎng)72h。
[0042]2)用于鑒定第二次同源重組成功的PCR引物
[0043]設(shè)計(jì)如下引物(序列7和序列8):
[0044]F389:5’ -AATGAGCTATTCCCGC-3’ (位于 WboA 閱讀框上游-44 到-28 位。)
[0045]R389:5’ -TAGCCGATAAACACGC-3’ (位于 WboA 閱讀框下游 1243 到 1258 反向互補(bǔ)位。)
[0046]陽性重 組菌的預(yù)期大小為389bp，非重組菌的PCR產(chǎn)物大小為1302bp。
[0047]3)篩選挑取平板上單個(gè)菌落(第一次重組菌)，接種到不含氨芐的TSB培養(yǎng)液中，37°C搖振培養(yǎng)6~8h，將菌液用生理鹽水進(jìn)行1:10、1:100和1:1000稀釋，每稀釋度各取菌液100 μ I涂布含5%蔗糖的TSA平板，37°C培養(yǎng)72h。挑取蔗糖平板上生長的菌落，用鑒定引物進(jìn)行菌落PCR，篩選陽性重組菌。對PCR篩選獲得的陽性菌，進(jìn)一步用凝集試驗(yàn)驗(yàn)證其粗糙型特性。提取重組菌的基因組DNA，以F389和R389為引物進(jìn)行PCR，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和序列測定，結(jié)果證實(shí)WboA基因l_897bp之間的序列已經(jīng)缺失，獲得的重組菌命名為布魯氏菌(Brucellaabortus) r2308_ Δ WboA株,本菌株已于2014年05月日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物保藏委員會(huì)普通微生物保藏中心CGMCC N0.。
[0048]2.布魯氏菌r2308_ Λ WboA株的生物學(xué)特性
[0049](I)形態(tài)和生化特性布魯氏菌r2308_AWboA株菌為革蘭氏染色為陰性。菌體為球桿菌，單個(gè)散在，無鞭毛，不形成芽孢和莢膜，大小約0.6~2.5 μ m。生化試驗(yàn)為硫化氫試驗(yàn)陽性。
[0050](2)培養(yǎng)特性重組牛種布魯氏菌r2308-AWboA株菌，在ρΗ6.4~6.8的胰大豆瓊月旨(TAB)或其他適宜培養(yǎng)基(如馬丁湯、胰際瓊脂、肉肝湯等)上生長良好；靜止培養(yǎng)易出現(xiàn)沉淀，振搖后液體渾濁、不透明。
[0051](3)粗糙型特性牛種布魯氏菌r2308_ AWboA株菌的熱凝集試驗(yàn)、Π丫唳黃凝集試驗(yàn)、菌落結(jié)晶紫染色試驗(yàn)結(jié)果符合粗糙型牛種布魯氏菌的特點(diǎn)，即熱凝集試驗(yàn)陽性，吖啶黃凝集試驗(yàn)陽性，能被結(jié)晶紫染色。
[0052](4)血清學(xué)特性將牛種布魯氏菌2308株菌和重組牛種布魯氏菌r2308_ Δ WboA株菌培養(yǎng)物制成滅活抗原注射小鼠2次，間隔I個(gè)月，第二次接種I個(gè)月后采血分離血清。布魯氏菌2308株的抗血清與布魯氏菌M5株、M28株、A387株和A19株等光滑型布魯氏菌凝集反應(yīng)為陽性；與布魯氏菌r2308-Λ WboA株和Ml 11株等粗糙型布魯氏菌凝集反應(yīng)為陰性；而布魯氏菌r2308- Δ WboA株抗血清與2308株、M5株、M28株、A387株和A19株等光滑型布魯氏菌凝集反應(yīng)為陰性，與粗糙型布魯氏菌Mlll株凝集反應(yīng)為陽性(見表1)。結(jié)果表明布魯氏菌r2308-AWboA株菌免疫小鼠后，其血清不含有對光滑型布魯氏菌的凝集類抗體。
[0053]表1布魯氏菌r2308_ Δ WboA株血清學(xué)檢查結(jié)果[0054]
【權(quán)利要求】
1.一種單基因缺失粗糙型布魯氏菌的疫苗生產(chǎn)菌株，其特征在于采用非抗性無痕缺失技術(shù)，缺失了布魯氏菌2308株WboA基因l-897bp之間的序列，構(gòu)建了能夠不干擾布病臨床診斷的粗糙型重組布魯氏菌r2308-AWboA株，用該菌制備的布魯氏菌病活疫苗免疫動(dòng)物后，其血清可用常規(guī)的凝集試驗(yàn)與自然感染相區(qū)分，本牛種布魯氏菌(Brucella abortus)r2308-Λ WboA株已于2014年05月20日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物保藏委員會(huì)普通微生物保藏中心，保藏號為=CGMCC N0.8885。
2.一種布魯氏菌病疫苗，其特征在于該疫苗含有活的布魯氏菌CGMCC N0.8885株和獸用生物制品常用的凍干保護(hù)劑。
3.如權(quán)利要求2所述一種布魯氏菌病疫苗的制備方法，其特征在于用胰大豆肉湯作為重組菌的培養(yǎng)基，滅菌后按培養(yǎng)基量的按1%~2%接入布魯氏菌CGMCC N0.8885株種子菌液，370C，按常規(guī)方法發(fā)酵培養(yǎng)28~38h，加入獸用生物制品常用的凍干保護(hù)劑，充分混勻、分裝疫苗瓶中后經(jīng)冷凍真空干燥，即成為單基因缺失粗糙型r2308- Δ WboA株布魯氏菌病疫苗。
4.一種基因缺失粗糙型布魯氏菌的鑒別診斷，其特征在于用如序列7和序列8所述序列的一對特異性引物，通過PCR方法可以與非重組的原始菌相區(qū)分。
【文檔編號】C12R1/01GK104004697SQ201410241278
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月3日
【發(fā)明者】丁家波, 王楠, 李慧嬌, 王忠田, 王芳, 蔣卉, 顧進(jìn)華, 寧宜寶, 張廣川, 毛開榮, 戴志紅, 李寧, 印春生 申請人:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所