玉米鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了玉米鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5基因及其應(yīng)用。本發(fā)明從玉米中分離得到鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5基因，其cDNA序列為SEQIDNo.1所示。亞細(xì)胞定位表明，該鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體定位在細(xì)胞質(zhì)膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，在植物細(xì)胞中起到吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存鋅鐵以及參與鋅鐵離子的解毒等作用。定時(shí)定量RT-PCR表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，ZmZIP5對(duì)于胚和胚乳的發(fā)育起到重要的調(diào)控作用。酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，ZmZIP5具有轉(zhuǎn)運(yùn)鋅鐵的功能。本發(fā)明所分離的ZmZIP5基因?qū)τ谡{(diào)控植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存鋅鐵的能力，調(diào)控胚和胚乳的發(fā)育以及增加糧食作物籽粒中鋅鐵含量等方面具有重要的應(yīng)用潛力。
【專利說(shuō)明】玉米鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZI P5基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及從植物中分離的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，尤其涉及從玉米中分離的與鋅 鐵的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存有關(guān)的調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，本發(fā)明進(jìn)一步涉及該調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5基 因在調(diào)控植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存鋅或鐵能力，解除過(guò)量的鋅或鐵對(duì)植物毒害以及增加糧食 作物種子鋅或鐵含量中的應(yīng)用，屬于植物金屬離子調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的分離和應(yīng)用領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 鋅和鐵是生物體所必需的微量元素，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有著重要作用 (ffintz H, Fox T,Wu YY, et al.Expression profiles of Arabidopsis thaliana in mineral deficiencies reveal novel transporters involved in metal homeostasis. The Journal of biological chemistry2003, 278(48) :47644-47653.)。鋅是生物體300多 種酶和重要蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)輔助因子（Haydon MJ，Cobbett CS. A novel major facilitator superfamily protein at the tonoplast influences zinc tolerance and accumulation in Arabidopsis. Plant physiology2007, 143 (4) : 1705-1719.)。鋒不僅參與機(jī)體的各種 代謝，在生物膜穩(wěn)定和基因表達(dá)調(diào)控等生理機(jī)能中也擔(dān)負(fù)著重要的角色（Mathews WR，Wang FjEide DJjet al. Drosophila fear of intimacy encodes a Zrt/IRT-like protein (ZIP) family zinc transporter functionally related to mammalian ZIP proteins. The Journal of biological chemistry2005, 280 (I) :787-795.)。鋒的缺乏會(huì)導(dǎo)致葉綠素、月旨 質(zhì)、蛋白和質(zhì)膜的氧化破壞，適量增加植物體內(nèi)鋅的含量可提高作物產(chǎn)量，但是植物體內(nèi)鋅 離子的過(guò)度積累又會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害。
[0003] 鐵在細(xì)胞呼吸、光合作用和金屬蛋白的催化反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是重要的 電子傳遞體，因此，鐵元素在原核和真核生物的生命活動(dòng)中具有不可替代的功能。另外， 細(xì)胞內(nèi)過(guò)高的Fe 3YFe2+氧化還原勢(shì)會(huì)導(dǎo)致超氧化合物的產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞造成傷害（Briat JF, Lebrun M. Plant responses to metal toxicity. Comptes rendus de 1'Academie des sciences Serie III，Sciences de la viel999, 322(1) :43-54.)。因此，嚴(yán)格控制植物體 內(nèi)金屬離子的平衡是至關(guān)重要的。
[0004] 參與鋅鐵吸收的蛋白主要有三類(lèi)，都是以蛋白家族形式存在的，包括=ZIPJP 鋒調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體（Zinc-regulated transporter，ZRT)和鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體（Iron-regulated transporter，IRT)。酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)顯示ZIP家族基因能夠轉(zhuǎn)運(yùn)包括Zn 2+、Fe2+、 Cu2+、Cd2+在內(nèi)的多種金屬離子（Colangelo EP，Guerinot ML.Put the metal to the petal:metal uptake and transport throughout plants. Current opinion in plant biology2006, 9 (3) :322-330. )。ZIP-般由309-476個(gè)氨基酸殘基組成，有8個(gè)潛在的跨 膜結(jié)構(gòu)域和相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，第3和第4跨膜區(qū)之間有一長(zhǎng)的可變區(qū)，可變區(qū)位于胞內(nèi)，其 C、N末端位于胞外，該區(qū)富含組氨酸殘基，可能與金屬的結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)（Guerinot ML. The ZIP family of metal transporters. Biochim Biophys Acta2000, 1465(1-2):190-198.)〇
[0005] 目前在擬南芥、水稻、蒺藜、苜蓿、大豆、野生型二粒小麥、葡萄等植物中鑒定出 ZIP基因并對(duì)其功能進(jìn)行了研究。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)16個(gè)ZIP家族基因，AtIRTl是通過(guò) 酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分離得到的第一個(gè)ZIP功能基因，其主要在根部表達(dá)，且該基因的過(guò)表達(dá) 可導(dǎo)致儀的過(guò)度積累（Eide D，Broderius M，F(xiàn)ett J，et al. A novel iron-regulated metal transporter from plants identified by functional expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Americal996, 93 (11) : 5624-5628 ；Henriques RjJasik JjKlein Mj et al.Knock-out of Arabidopsis metal transporter gene IRTlresults in iron deficiency accompanied by cell differentiation defects. Plant molecular biology2002,50(4-5):587-597 ; Varotto CjMaiwald DjPesaresi Pj et al. The metal ion transporter IRTlis necessary for iron homeostasis and efficient photosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant journal: for cell and molecular biology2002, 31 (5):589-599 ；Vert Gj Grotz N，Dedaldechamp F，et al. IRTlj an Arabidopsis transporter essential for iron uptake from the soil and for plant growth. Plant Cell2002, 14(6):1223-1233 ； Nishida Sj Tsuzuki C，Kato A，et al.AtIRTlj the primary iron uptake transporter in the root, mediates excess nickel accumulation in Arabidopsis thaliana. Plant&cell physiology2011，52(8) : 1433-1442.)。AtIRT2 主要在根部表達(dá)，定位在囊 泡，推測(cè)具有細(xì)胞內(nèi)過(guò)量金屬元素的解毒功能（Vert G，Briat JF，Curie C.Arabidopsis IRT2gene encodes a root-periphery iron transporter.The Plant journal: for cell and molecular biology2001, 26(2):181-189 ；Vert GjBarberon MjZelazny Ej et al.Arabidopsis IRT2cooperates with the high-affinity iron uptake system to maintain iron homeostasis in root epidermal cells.Planta2009, 229(6) :1171-1179. 14, 15)。AtIRT3能互補(bǔ)鋅、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)雙突變體，過(guò)表達(dá)AtIRT3會(huì)使鋅在地上部、鐵在地下部積 累（Lin YF，Liang HM，Yang SY，et al. Arabidopsis IRT3is a zinc-regulated and plasma membrane localized zinc/iron transporter. The New phytologist2009, 182(2):392-40 4.)。表達(dá)分析顯示，八七21?1、八七21?54七21?9^七21?12和八《訂3受缺鋅誘導(dǎo)，由此推測(cè)，這些 基因在缺鋒條件下可能增強(qiáng)鋒的吸收能力（Kramer U，Talke IN，Hanikenne Μ· Transition metal transport. FEBS Lett2007,581 (12):2263-2272·)。
[0006] 玉米（Zea mays)是中國(guó)重要的糧食、飼料和經(jīng)濟(jì)作物，增加玉米籽粒中鋅、鐵等 微量元素的含量，對(duì)提高飲食或飼料利用效率、促進(jìn)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人體健康尤為重要。目 前，已知許多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了植物體內(nèi)鋅鐵離子平衡網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，其中ZlPUinc-regulated transporters，Iron-regulated transporter-like proteins，ZIP)基因家方矣對(duì)鋒、鐵等二 價(jià)金屬離子的吸收、運(yùn)輸和儲(chǔ)存起著重要作用，在擬南芥、水稻、大麥、大豆上，已報(bào)道了一 些有關(guān)ZIP家族基因的研究，但對(duì)ZIP家族基因在植物體內(nèi)具體的作用機(jī)制尚未完全了解， 而關(guān)于玉米的ZIP家族基因的研究報(bào)道較少。了解Zn 2+、Fe2+在玉米中的吸收、運(yùn)輸方式， 分布規(guī)律和調(diào)節(jié)機(jī)制，將有助于改善玉米在鋅、鐵缺乏的環(huán)境中的生長(zhǎng)發(fā)育，為進(jìn)一步揭示 玉米中ZIP家族基因的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為玉米鋅、鐵高效轉(zhuǎn)基因育種提供候選基因，也 為人類(lèi)鋅鐵營(yíng)養(yǎng)提供良好的基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的之一是提供從玉米（Zea mays)中分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因；
[0008] 本發(fā)明的目的之二是提供鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因所編碼的蛋白質(zhì)；
[0009] 本發(fā)明的目的之三是將所述的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因應(yīng)用于調(diào)控植物對(duì)鋅鐵等金 屬離子的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存、解除過(guò)量的鋅鐵對(duì)植物的毒害或者增加糧食作物籽粒中鋅鐵 含量。
[0010] 本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 從玉米（Zea mays)中分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，其cDNA序列為（a)、（b)或（C) 所示：
[0012] (a)、SEQ ID No. 1 所示的核苷酸；
[0013] (b)、編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸的核苷酸；
[0014] (c)、與SEQ ID NO: 1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷酸，該核苷 酸所編碼的蛋白質(zhì)具有鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。
[0015] 所述"嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件"意指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強(qiáng)度和高溫的條件。通常， 在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測(cè)程度比與其它序列雜交的可檢測(cè)程度更高 (例如超過(guò)本底至少2倍。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境條件下將會(huì)不同， 較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性雜交。通過(guò)控制雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性或洗滌條件可鑒定與探針 100%互補(bǔ)的祀序列。對(duì)于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可參考有關(guān)文獻(xiàn)（Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, ^Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays.1993)〇 更具體的，所述嚴(yán)謹(jǐn)條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子強(qiáng)度pH下的熱熔點(diǎn)（Tm) 約5-10°C。Tm為在平衡狀態(tài)下50%與目標(biāo)互補(bǔ)的探針雜交到目標(biāo)序列時(shí)所處的溫度（在指 定離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下）（因?yàn)槟繕?biāo)序列過(guò)量存在，所以在Tm下在平衡狀態(tài)下50% 的探針被占據(jù)）。嚴(yán)謹(jǐn)條件可為以下條件：其中在PH7. 0到8. 3下鹽濃度低于約I. OM鈉離 子濃度，通常為約〇· 01到I. OM鈉離子濃度（或其它鹽），并且溫度對(duì)于短探針（包括（但 不限于）10到50個(gè)核苷酸）而言為至少約30°C，而對(duì)于長(zhǎng)探針（包括（但不限于）大于50 個(gè)核苷酸）而言為至少約60°C。嚴(yán)謹(jǐn)條件也可通過(guò)加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì) 于選擇性或特異性雜交而言，正信號(hào)可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。 例示性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可如下：50%甲酰胺，5XSSC和1% SDS，在42°C下培養(yǎng)；或5XSSC， 1% SDS，在65°C下培養(yǎng)，在0. 2XSSC中洗滌和在65°C下于0. 1%SDS中洗滌。所述洗滌可 進(jìn)行5、15、30、60、120分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。
[0016] 優(yōu)選的，本發(fā)明從玉米中所分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因是ZmZIP5基因，其cDNA序 列為SEQ ID No. 1所示。
[0017] 本發(fā)明目的之二是提供由上述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因所編碼的能夠吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ) 存鋅鐵的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列為（a)或（b)所示：
[0018] (a)、SEQ ID No. 2 所示的氨基酸；
[0019] (b)、將SEQ ID No. 2所示的氨基酸通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的蛋白變體；
[0020] 特別優(yōu)選的，本發(fā)明所述的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體的氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示。
[0021] 所述的"多個(gè)"通常意味著2-8個(gè)，優(yōu)選為2-4個(gè)，這取決于鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體三維 結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類(lèi)；所述的"替換"是指分別用不同的氨基酸殘基取 代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的"缺失"是指氨基酸殘基數(shù)量的減少，也即是分別缺少其 中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的"插入"是指氨基酸殘基序列的改變，相對(duì)天然分子而 言，所述改變導(dǎo)致添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
[0022] 本發(fā)明所述的蛋白變體可由遺傳多態(tài)性或人為操作產(chǎn)生，這些操作方法通常為本 領(lǐng)域所了解。例如，可通過(guò)DNA的突變來(lái)制備鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體的氨基酸序列變體或片段，其 中由于誘變或改變多核苷酸的方法為本領(lǐng)域所習(xí)知。其中，保守的取代是將一種氨基酸殘 基替換成具有相似性質(zhì)的另一種氨基酸。因此，本發(fā)明所述的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體及其編碼基 因包括天然存在的序列和變體兩種形式。"變體"意指基本相似的序列，對(duì)于多核苷酸，變 體包含天然多核苷酸中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、插入或/和替換。對(duì) 于多核苷酸，保守的變體包括由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不改變編碼的氨基酸序列的那些變 體。諸如此類(lèi)天然存在的變體可通過(guò)現(xiàn)有的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)鑒定。變體多核苷酸還包括 合成來(lái)源的多核苷酸，例如采用定點(diǎn)誘變所得到的仍編碼SEQ ID No. 2所示的氨基酸的多 核苷酸變體，或者是通過(guò)重組的方法（例如DNA重排等）。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)以下分子 生物技術(shù)手段來(lái)篩選或評(píng)價(jià)變體多核苷酸所編碼蛋白的功能或活性：DNA結(jié)合活性，蛋白 之間的相互作用，瞬時(shí)研究中基因表達(dá)的激活情況或轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的效應(yīng)等。
[0023] 本發(fā)明從玉米中分離、克隆了鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5基因，亞細(xì)胞定位的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明，該鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體定位在質(zhì)膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，因此推測(cè)其與鋅鐵離子的解毒與儲(chǔ)存有 關(guān)，在植物細(xì)胞中起到吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存鋅鐵以及參與鋅鐵離子的解毒等功能。在亞細(xì)胞定 位的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)授粉后不同天數(shù)的玉米胚和胚乳進(jìn)行了表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 正常營(yíng)養(yǎng)條件下，ZmZIP5在地上部的表達(dá)量比地下部高，缺鋅誘導(dǎo)96h時(shí)，ZmZIP5在地上 部表達(dá)上調(diào)，在高鋅條件下，ZmZIP5在地上部的表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸降低的趨 勢(shì)，然而，在高鐵條件下ZmZIP5在地上部與地下部的表達(dá)量是逐漸升高的。這些結(jié)果表明， ZmZIP5在幼苗時(shí)期對(duì)鋅和鐵的濃度比較敏感。在授粉后不同天數(shù)的胚和胚乳中的表達(dá)分析 發(fā)現(xiàn)，ZmZIP5在授粉后17天的胚和胚乳中是表達(dá)上調(diào)的，在授粉后19天的胚乳中的表達(dá) 量達(dá)到最高，ZmZIP5可能在胚和胚乳的發(fā)育過(guò)程中起到作用。
[0024] 酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所分離的ZmZIP5基因與水稻和擬南芥中的ZIP基因相 似，具有轉(zhuǎn)運(yùn)鋅鐵的功能。
[0025] 目前，已知許多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了植物體內(nèi)鋅鐵離子平衡網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，一些蛋白也被 應(yīng)用到植物的轉(zhuǎn)基因研究中，比如在大麥中過(guò)表達(dá)AtZIPl基因能夠增加鋅和鐵在種子中 的含量（Ramesh SA, Choimes S, Schachtman DP. Over-expression of an Arabidopsis zinc transporter in hordeum vulgare increases short-term zinc uptake after zinc deprivation and seed zinc content. Plant molecular biology2004, 54 (3):373-385.), 同樣，過(guò)表達(dá)OsIRTl基因，水稻中鋅和鐵的含量在地上部、地下部和種子中都有所提 高(Lee S, An G. Over-expression of OsIRTlleads to increased iron and zinc accumulations in rice. Plant, cell&environment2009, 32(4) :408-416.)。然而，在水稻 中過(guò)表達(dá)0sZIP4、0sZIP5、0sZIP8, 0sZIP9結(jié)果導(dǎo)致過(guò)量的鋅聚集于根部，降低了植株地上 部分的鋒含量（Lee S, Kim SA, Lee J，et al. Zinc deficiency-inducible 0sZIP8encodes a plasma membrane-localized zinc transporter in rice.Molecules and cells2010, 29(6):551-558 ；Lee S, Jeong HJ, Kim SA, et al. 0sZIP5is a plasma membrane zinc transporter in rice.Plant molecular biology2010, 73(4-5) :507-517 ；Ishimaru Y, Masuda H, Suzuki M, et al. Overexpression of the 0sZIP4zinc transporter confers disarrangement of zinc distribution in rice plants. Journal of experimental botany2007, 58 (11) : 2909-2915.)沒(méi)有達(dá)到在籽粒中增加鋅含量的目的，因此，這些基因的 過(guò)表達(dá)對(duì)水稻籽粒中鋅的富集是不利的。這些結(jié)果表明，異位過(guò)表達(dá)對(duì)于鋅鐵的積累與分 布可能會(huì)起到一定的作用。然而，有關(guān)鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在籽粒中的研究還很少。
[0026] 本發(fā)明通過(guò)ZmZIP5基因在胚和胚乳中的表達(dá)模式了解到ZmZIP5可以在胚或胚乳 中表達(dá)，所以，將本發(fā)明的ZmZIP5基因在糧食作物種子中進(jìn)行過(guò)表達(dá)能夠增加籽粒中鋅鐵 含量的積累。
[0027] 因此，本發(fā)明提供了一種調(diào)控植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存鋅鐵的能力，解除過(guò)量的鋅鐵 對(duì)植物毒害，調(diào)控胚乳和胚的發(fā)育或增加糧食作物籽粒中鋅鐵含量的方法，包括：將本發(fā)明 ZmZIP5基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接得到重組植物表達(dá)載體；將重組植物表達(dá)載 體轉(zhuǎn)化到植物中，在植物體中過(guò)表達(dá)ZmZIP5基因；特別的，將本發(fā)明ZmZIP5基因在糧食作 物種子中進(jìn)行特異性表達(dá)時(shí)，能夠有效增加糧食作物種子中鋅鐵的含量或積累。
[0028] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的重組植物表達(dá)載體以及含 有該重組植物表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0029] 將所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接，得到可以在植物中 表達(dá)該鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的重組植物表達(dá)載體。"可操作的連接"指兩個(gè)或更多個(gè)元件之 間功能性的連接，可操作的連接的元件可為鄰接或非鄰接的。例如，該重組植物表達(dá)載體可 以由5'端非編碼區(qū)，SEQ IDNo. 1所示的核苷酸和3'非編碼區(qū)組成，其中，所述的5'端 非編碼區(qū)可以包括啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列或/和翻譯增強(qiáng)序列；所述的啟動(dòng)子可以是組 成性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子；所述的3'非編碼區(qū)可以包含終止 子序列、mRNA切割序列等。合適的終止子序列可取自根癌農(nóng)桿菌的Ti-質(zhì)粒，例如章魚(yú)堿 合成酶或胭脂堿合成酶終止區(qū)。例如，為了使本發(fā)明的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因在糧食作物種 子進(jìn)行特異性表達(dá)，可以將鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因連接在種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子的下方構(gòu)建 得到重組植物表達(dá)載體，將該重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體植物后，鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因可 以在受體植物的種子里進(jìn)行特異性表達(dá)，達(dá)到增加種子鋅鐵含量或調(diào)控胚發(fā)育的效果。
[0030] 另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化以增強(qiáng)其 在植物中的表達(dá)。例如?？刹捎媚繕?biāo)植物的偏愛(ài)密碼子進(jìn)行優(yōu)化來(lái)合成多核苷酸以增強(qiáng)該 基因在目標(biāo)植物中的表達(dá)水平，這些方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所習(xí)知。
[0031] 此外，該重組植物表達(dá)載體還可含有用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因。選擇 性標(biāo)記基因用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。所述的選擇性標(biāo)記基因包括：編碼抗生素抗性 的基因以及賦予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的標(biāo)記基因還包括表型標(biāo)記，例如 β-半乳糖苷酶和熒光蛋白等。
[0032] 所述的"轉(zhuǎn)化"指將基因?qū)氲街参锛?xì)胞內(nèi)部這樣的方式將多核苷酸或多肽遺傳 轉(zhuǎn)化到植物中。將所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法為本領(lǐng)域所習(xí)知，包括但不限 于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法和病毒介導(dǎo)法等。"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"指被引入的多核苷酸構(gòu)建體整合 至植物細(xì)胞的基因組中并能通過(guò)其子代遺傳；"瞬時(shí)轉(zhuǎn)化"指多核苷酸被引入到植物中但只 能在植物中暫時(shí)性表達(dá)或存在。
[0033] 轉(zhuǎn)化方案以及將所述多核苷酸引入植物的方案可視用于轉(zhuǎn)化的植物（單子葉植 物或雙子葉植物）或植物細(xì)胞的類(lèi)型而變化。將所述多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的合適方法包 括：顯微注射、電穿孔、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、直接基因轉(zhuǎn)移以及高速?gòu)椀擂Z擊等。在特定的 實(shí)施方案中，可利用多種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法將本發(fā)明的ZmZIP5基因提供給植物。在其它實(shí)施方案 中，本發(fā)明的ZmZIP5基因可通過(guò)將植物與病毒或病毒核酸接觸來(lái)引入到植物中，通常，這 樣的方法涉及將本發(fā)明的ZmZIP5基因構(gòu)建體引入病毒DNA或RNA分子中。
[0034] 利用常規(guī)方法可使已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株（McCormick et al. Plant Cell Reports. 1986. 5:81-84)。本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)化任何植物種類(lèi)，包括但不限于：?jiǎn)巫尤~植 物或雙子葉植物；優(yōu)選的，所述的目標(biāo)植物包括糧食作物、蔬菜或果樹(shù)等，更優(yōu)選為糧食作 物，例如，可以是玉米、水稻、大麥小麥、高粱、大豆、馬鈴薯等糧食作物。
[0035] 本發(fā)明所涉及到的術(shù)語(yǔ)定義
[0036] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可使用與本文所述者 類(lèi)似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。
[0037] 術(shù)語(yǔ)"重組宿主細(xì)胞株"或"宿主細(xì)胞"意指包含本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞，而不管 使用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對(duì)或所屬領(lǐng)域中已 知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組 中。宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，宿主細(xì)胞還可為單子葉或雙子葉植物細(xì)胞。
[0038] 術(shù)語(yǔ)"核苷酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核 苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)涵蓋含有天然核苷酸的已知 類(lèi)似物的核酸，所述類(lèi)似物具有類(lèi)似于參考核酸的結(jié)合特性并以類(lèi)似于天然產(chǎn)生的核苷 酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)也意指寡核苷酸類(lèi)似物，其包括 PNA(肽核酸）、在反義技術(shù)中所用的DNA類(lèi)似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非 另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體（包括（但不限于）簡(jiǎn) 并密碼子取代）和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過(guò)產(chǎn)生其中一個(gè)或一 個(gè)以上所選（或所有）密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來(lái)實(shí) 現(xiàn)簡(jiǎn)并密碼子取代（Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991) ;01^8111^等人，工 Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);和 Cassol 等人，（1992) ;Rossolini 等人，]?〇1〇611· Probes8:91-98(1994))。
[0039] 術(shù)語(yǔ)"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。艮P， 針對(duì)多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述術(shù)語(yǔ)適用于天然產(chǎn)生氨 基酸聚合物以及其中一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如 本文中所使用，所述術(shù)語(yǔ)涵蓋任何長(zhǎng)度的氨基酸鏈，其包括全長(zhǎng)蛋白（即抗原），其中氨基 酸殘基經(jīng)由共價(jià)肽鍵連接。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040] 圖1酵母表達(dá)載體pFL61的示意圖。
[0041] 圖2標(biāo)準(zhǔn)Hoagland培養(yǎng)基條件下ZmZIP5的表達(dá)模式；S (shoot)，R (root)。
[0042] 圖3ZmZIP5基因在各種處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式。
[0043] 圖4ZmZIP5基因在玉米胚和胚乳發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式。
[0044] 圖5不同物種的ZIP成員的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析。
[0045] 圖6pRTL2NGFP-ZmZIP5重組載體酶切鑒定。
[0046] 圖7pRTL2NGFP-ZmZIP5載體構(gòu)建流程圖。
[0047] 圖8ZmZIP5洋蔥表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位；GFP為pRTL2NGFP空載體定位情況； ZmZIP5為pRTL2NGFP-ZmZIP5的亞細(xì)胞定位情況。
[0048] 圖9ZmZIP5擬南芥葉肉原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位；GFP為pRTL2NGFP空載體定位 情況；ZmZIP5為pRTL2NGFP-ZmZIP5的亞細(xì)胞定位情況。
[0049] 圖 10pFL61-ZmZIP5 及 pFL61-〇sZIP5、pFL61-〇sZIP8、pFL61-〇sIRTl 正向連 接重組載體酶切鑒定；M為IKb的Marker ;1-4依次為pFL61-ZmZIP5、pFL61-〇sZIP5、 pFL61-〇sZIP8、pFL61-〇sIRTl 雙酶切結(jié)果。
[0050] 圖llpFL61-ZmZIP5載體構(gòu)建流程圖。
[0051] 圖12ZmZIP5酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0052] 圖13pBI121-ZmZIP5植物表達(dá)載體示意圖。
[0053] 圖14ZmZIP5基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)提高擬南芥中鋅鐵含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；ZmZIP5 為轉(zhuǎn)ZmZIP5基因擬南芥種子中鐵和鋅含量測(cè)定的結(jié)果；WT為野生型哥倫比亞種子中鐵和 鋅含量測(cè)定的結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0054] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0055] 實(shí)驗(yàn)材料
[0056] I. 1植物材料
[0057] 玉米自交系X178由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國(guó)家玉米改良中心河北分中心實(shí)驗(yàn)室 提供，水稻自交系日本晴由北京師范大學(xué)生命科學(xué)院惠贈(zèng)。
[0058] L 2菌株與載體
[0059] 大腸桿菌（E. coli)菌株 Machl-Tl 和農(nóng)桿菌（A. tumefacterium)菌株 EHA105、 GV3101均由本實(shí)驗(yàn)室保存。pGEM-Teasy載體購(gòu)自Promega公司。酵母表達(dá)載體 pFL61(不意圖見(jiàn)圖 1)、酵母菌株 zrtlzrt2ZHY3(MATa ade6 canl his3 leu2 trpl ura3 zrtl::LEU2 zrt2::HIS3), fet3fet4DEY1453(MATa/MATa ade2/+ canl/canl his3/ his3 Ieu2/leu2 trpl/trpl ura3/ura3fet3-2::HIS3/fet3-2::HIS3fet4-l::LEU2/ fet4-l: :LEU2)，DY1455(MATa ade6canlhis31eu2trplura3)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張紅生教授友 情惠贈(zèng)。
[0060] 實(shí)施例1玉米鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5基因的克隆
[0061] 1、植物材料的處理
[0062] 先把蛭石用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液浸透，將玉米自交系X178種子點(diǎn)播于育苗盤(pán)中，上面 覆蓋上一層干蛭石，在溫室（16h光照/8h黑暗，26°C )中培養(yǎng)，12天幼苗長(zhǎng)至2葉一心時(shí)移 入標(biāo)準(zhǔn)Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)6天至3葉一心（每3天換一次營(yíng)養(yǎng)液），3葉一心的玉米 幼苗在標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)液和不加鋅、鐵、銅、錳，高鋅、鐵的條件下處理〇、6、12、24、48、96h后，分別 收取幼苗地上部和根，液氮速凍后于_80°C保存用于總RNA提取。
[0063] 2、玉米總RNA的提取
[0064] 采用Trizol提取試劑盒提取玉米總RNA。
[0065] 3、cDNA 的合成
[0066] (1)、去除 DNA，按下述配制反應(yīng)體系：總 RNA(lyg/yL)1.0yL，DNAse I(K)U/ yL)1.0yL，10XDNAse I bufferl.OyL，DEPC H2O 7.0yL"g4+10.0yL;37t：30*#， 加入 I μ L25mM EDTA，65°C 5min 終止反應(yīng)。
[0067] (2)、加入 IyL oligo(dT18)，65°C 5 分鐘；
[0068] (3)、以上共12 μ L，再加入以下組分得到反轉(zhuǎn)錄體系：5X反應(yīng)緩沖液4.0 μ L， Ri RT (20U/ μ L) I. 0 μ L，Re RT (200U/ μ L) I. 0 μ L，IOmM dNTP mix2. 0 μ L，總計(jì)：20. 0 μ L ; 42°C 60min，70°C 5分鐘，終止反應(yīng)。
[0069] 4、目的基因的克隆
[0070] (1)、根據(jù)目的基因的ORF框設(shè)計(jì)引物：
[0071] ZmZIP5F5'-GAATTCATGCCGCTCCTCGAGGAGAT-3' EcoRI
[0072] ZmZIP5R5'-GCGGCCGCGAGCTCCTAAGCCCAGATGGCTAGAGATGCC-3,NotI，SacI
[0073] 以上述步驟3玉米葉片的cDNA為模板，選用ExTaq酶，2 X GCI buffer進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，PCR程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性4min ;94°C變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸lmin，33個(gè)循 環(huán)；72°C延伸 IOmin ;
[0074] (2)、將克隆得到的片段克隆到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化Machl-Tl菌株；
[0075] (3)、經(jīng)酶切鑒定獲得陽(yáng)性的重組質(zhì)粒，命名為pGEM_ZmZIP5,測(cè)序得到正確克隆。 將所克隆的基因命名為ZmZIP5,該基因的cDNA序列為SEQ ID No. 1所示，所推導(dǎo)的氨基酸 序列為SEQ ID No. 2所示。
[0076] 實(shí)施例2 ZmZIP5在幼苗、胚和胚乳中的表達(dá)模式
[0077] 將實(shí)施例1步驟3中反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋10倍作為PCR反應(yīng)的模板，PCR反應(yīng)體 系如下：
[0078] cDNA2. 0 μ L，ExTaqO. 1 μ L，2XGCI 緩沖液 10. 0 μ L，IOmM dNTP mixO. 8 μ L，上 游引物 RTZmZIP5F(10 μ M/ μ L) I. 0 μ L，下游引物 RTZmZIP5R(10 μ M/ μ L) I. 0 μ L，ddH20 5. 1 μ L, 20. 0 μ L ；
[0079] RTZmZIP5F5'-GCACATAGGCATAGCCACGC-3'
[0080] RTZmZIP5R5'-ACGCCCAAAGATAGCCCGAT-3'
[0081] PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性4min ;30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94°C變性45sec，60°C退火 lmin，72°C延伸Imin ;最后再延伸72°C lOmin，降溫至16°C，取出PCR產(chǎn)物放入4°C保存。
[0082] 目的基因表達(dá)量的檢測(cè)：實(shí)施例1步驟3中反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋20倍作為 real-time PCR反應(yīng)的模板，Actin為內(nèi)參照，反應(yīng)體系如下：
[0083] cDNA 5. 0 μ L, SYBR Green I 10. 0 μ L, RoxO. 4 μ L,上游引物 ZmActinlF (10 μ M/ 4 1^)0.4 4 1^，下游引物211^(^11111?(1(^]\1/^1^)0.4 4 1^，(1(1!1203.8 4 1^，總計(jì)10.(^1^;
[0084] ZmActin1F5'-ATGTTTCCTGGGATTGCCGAT-3'
[0085] ZmActinlR5'-CCAGTTTCGTCATACTCTCCCTTG-3'
[0086] 所用程序：95°C 2min，95°C 15sec，60°C 34sec，40 個(gè)循環(huán),通過(guò) Δ Δ Ct 法計(jì)算表達(dá) 量。
[0087] 通過(guò)real-time RT-PCR表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，正常營(yíng)養(yǎng)條件下，ZmZIP5在地上部的表達(dá) 量比地下部高（圖2)，缺鋅誘導(dǎo)96h時(shí)，ZmZIP5在地上部表達(dá)上調(diào)，在高鋅條件下，ZmZIP5 在地上部的表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，然而，在高鐵條件下ZmZIP5在地 上部與地下部的表達(dá)量是逐漸升高的（圖3)。這些結(jié)果表明，ZmZIP5在幼苗時(shí)期對(duì)鋅和鐵 的濃度比較敏感。在授粉后不同天數(shù)的胚和胚乳中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，ZmZIP5在授粉后17 天的胚和胚乳中是表達(dá)上調(diào)的，在授粉后19天的胚乳中的表達(dá)量達(dá)到最高（圖4)。推測(cè) ZmZIP5可能在胚和胚乳的發(fā)育過(guò)程中起到一定的作用。
[0088] 實(shí)施例3 ZmZIP5的生物信息學(xué)分析
[0089] 生物信息學(xué)分析表明，鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5定位在玉米的第6染色體上，由5 個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5蛋白編碼409個(gè)氨基酸，通過(guò)對(duì)玉米 ZIP蛋白的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ZmZIP5蛋白含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，在第3與第4跨膜區(qū)之 間有一富含組氨酸的可變區(qū)，可能和金屬離子的結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，ZmZIP5與 AtIRT3、AtZIP4、AtZIP9處于一個(gè)分支上，進(jìn)化關(guān)系較近（圖5)，AtIRT3是轉(zhuǎn)運(yùn)鋅鐵的鋅轉(zhuǎn) 運(yùn)體，所以ZmZIP5可能是一個(gè)鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體。
[0090] 實(shí)施例4鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5的亞細(xì)胞定位
[0091] 1、融合表達(dá)載體的構(gòu)建
[0092] 根據(jù)ZmZIP5基因的序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：
[0093] ZmZIP5GF 5'-GAATTCATGCCGCTCCTCGAGGAGAT-3' EcoRI
[0094] ZmZIP5GR 5'-TCTAGAAGCCCAGATGGCTAGAGATGCC-3' XbaI
[0095] 加入合適的酶切位點(diǎn)，并且基因3'端去除終止密碼子，以克隆基因時(shí)連接到 pGEM-T載體上測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板，選用ExTaq酶與2 X GCI buffer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性4min ;94°C變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸lmin，33個(gè)循環(huán)；72°C 延伸lOmin。擴(kuò)增片段經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳回收后克隆到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌 株Machl-Tl，經(jīng)LB培養(yǎng)基（IPTG、X-gal、Amp)得到陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒、酶切和測(cè)序驗(yàn)證；以 克隆基因時(shí)連接到pGEM-Τ載體上測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板，選用ExTaq酶與2 XGCI buffer 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳回收后克隆到pGEM-T載體中，測(cè)序正確的質(zhì) 粒酶切后，將目的片段構(gòu)建到PRTL2NGFP載體上，命名為pRTL2NGFP-ZmZIP5,圖6為酶切鑒 定圖，構(gòu)建流程見(jiàn)圖7。
[0096] 2、用相應(yīng)的酶切pRTL2NGFP載體與不同的酶切后的基因，經(jīng)T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn) 化Machl-Tl菌株，提質(zhì)粒酶切鑒定篩選出正確重組體大提質(zhì)粒用于基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮 和PEG法轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體。
[0097] 3、基因槍微彈的制備
[0098] 4、用基因槍進(jìn)行洋蔥表皮轉(zhuǎn)化
[0099] 從定位結(jié)果可知ZmZIP5定位在質(zhì)膜與細(xì)胞內(nèi)膜上（圖8)。為進(jìn)一步確定細(xì)胞內(nèi) 膜的具體定位，選用ER marker與ZmZIP5共定位進(jìn)行擬南芥葉肉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，結(jié)果證 明鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5定位在細(xì)胞質(zhì)膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上（圖9)。
[0100] 實(shí)施例五酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)
[0101] 1、酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
[0102] 根據(jù)目的基因序列加入合適的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物：
[0103] ZmZIP5YF 5,-GCGGCCGCATGCCGCTCCTCGAGGAGAT-3, NotI
[0104] ZmZIP5YR 5' -GCGGCCGCCTA AGCCCAGATGGCTAGAGATGCC-3' NotI
[0105] 以克隆基因時(shí)連接到pGEM-T載體上測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板，選用ExTaq與2 X GCI buffer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性4min ;94°C變性lmin，60°C退火lmin，72°C延 伸lmin，33個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴(kuò)增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收后克隆到pGEM-T 載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株Machl-Tl，經(jīng)LB培養(yǎng)基（IPTG、X-gal、Amp)得到陽(yáng)性克隆，提質(zhì) 粒、酶切和測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序正確的質(zhì)粒經(jīng)相應(yīng)的酶切后，將目的片段構(gòu)建到PFL61載體上， 命名為 pFL61-ZmZIP5 及 pFL61-〇sZIP5、pFL61-〇sZIP8 和 pFL61-〇sIRTl，圖 10 為酶切鑒定 圖，圖11為構(gòu)建流程圖。
[0106] 用NotI酶切pFL61載體去磷酸化后與酶切后的ZmZIP5片段經(jīng)T4DNA連接酶連接， 轉(zhuǎn)化Machl-Tl菌株，提質(zhì)粒酶切鑒定篩選出正確重組體大提質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化釀酒酵母。
[0107] 2、電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母
[0108] (1)、從 YPD 平板上挑取 zrtlzrt2ZHY3、fet3fet4DEY1453 和 DY1455 的單菌落于 20mL的YH)液體培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng)約24小時(shí)；
[0109] (2)、吸取以上2%體積的菌液轉(zhuǎn)接到IOOmL的YPD培養(yǎng)基中繼續(xù)擴(kuò)繁約4-5小時(shí)， 待菌液OD 6c?為1. 2-1. 5時(shí)即可制備感受態(tài)；
[0110] (3)、將菌液收集到50mL的離心管中，4°C，5, OOOrpm，離心5min，倒掉上清；
[0111] (4)、加入等體積的去離子水，冰上重懸菌體，4°C，5, OOOrpm，5min離心，倒掉上 清；
[0112] (5)、加入1/2體積的去離子水，冰上重懸菌體，4°C，5, OOOrpm，5min離心，倒掉上 清；
[0113] (6)、加入IOmL的IM山梨醇溶液，冰上重懸菌體，4°C，5, OOOrpm，5min離心，倒掉上 清；
[0114] (7)、加入450-600 μ L的山梨醇溶液，用去頭的槍頭輕吸，重懸菌體；
[0115] (8)、按照每個(gè)I. 5mL的離心管里加入約100 μ L的感受態(tài)為準(zhǔn)，分裝；
[0116] (9)、在每管感受態(tài)中加入適量的DNA(10y L左右，c彡200ng/yL)，冰上放置 l-2min,之后吸到預(yù)冷的電擊杯中，不要有氣泡；
[0117] (10)、電擊轉(zhuǎn)化，立即加入約800 μ L，IM的預(yù)冷的山梨醇溶液，重懸菌體；
[0118] (11)、從電擊杯中吸出菌體，涂布SD/Ura-平板；
[0119] (12)、SD平板上28 °C培養(yǎng)約6天可長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌斑。
[0120] 3、酵母陽(yáng)性克隆的鑒定
[0121] (1)、取I. 5mL酵母培養(yǎng)物，9, OOOrpm離心30sec，盡可能的吸棄上清，收集酵母細(xì) 胞；
[0122] (2)、加入600 μ L Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細(xì)胞，加入80U的 Lyticase,充分顛倒混勻，37°C溫育30min消化細(xì)胞壁，中間顛倒數(shù)次；
[0123] (3)、13000印111離心11^11，盡可能吸棄上清，加入25(^1^溶液￥?1重懸菌體沉淀， 渦旋震蕩至徹底懸??；
[0124] (4)、加入250 μ L YP2溶液，輕柔地翻轉(zhuǎn)，使菌體充分裂解，室溫放置4分鐘；
[0125] (5)、加入350μ L ΥΡ3溶液，輕柔地翻轉(zhuǎn)，充分混勻時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，冰上靜 置3_5min，13, OOOrpm離心5min，小心吸取上清液。
[0126] (6)、將上一步所得上清液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12, OOOrpm 離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液；
[0127] (7)、加入 500 μ L 去蛋白液 F1D, 12, OOOrpm 離心 30_60sec，棄廢液；
[0128] (8)、加入500 μ L漂洗液WB (已加無(wú)水乙醇），12, OOOrpm離心30_60sec，棄廢液；
[0129] (9)、加入 500 μ L 漂洗液 WB，12, OOOrpm 離心 30-60sec，棄廢液；
[0130] (10)、將吸附柱AC放回空收集管中，13, OOOrpm離心2min，除去漂洗液；
[0131] (11)、取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50 μ L洗 脫緩沖液EB (65-70°C水?。覝胤胖?min，13, OOOrpm離心lmin。
[0132] (12)、以抽提的IyL DNA為模板，基因的兩端引物為PCR擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增 驗(yàn)證目的基因，驗(yàn)證正確的菌液，加入25%的甘油于-80°C保存。
[0133] 4、酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)
[0134] 將 pFL61，pFL6卜ZmZIP5, pFL6卜0sZIP5、pFL6卜0sZIP8、pFL61-〇sIRTl 分 別轉(zhuǎn)化酵母突變株zrtlzrt2ZHY3和fet3fet4DEY1453, pFL61為陰性對(duì)照，0sZIP5、 0sZIP8(Lee S, Kim SA, Lee J, et al. Zinc deficiency-inducible 0sZIP8encodes a plasma membrane-localized zinc transporter in rice.Molecules and cells2010, 29(6):551-558 ；Lee S, Jeong HJ, Kim SA, et al. 0sZIP5is a plasma membrane zinc transporter in rice. Plant molecular biology2010, 73(4-5) :507-517 ；Ishimaru Y,Masuda H,Suzuki M,et al.Overexpression of the 0sZIP4zinc transporter confers disarrangement of zinc distribution in rice plants. Journal of experimental botany2007, 58(11) :2909-2915.)為鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體的陽(yáng)性對(duì)照，OsIRTl (Lee S, An G. Over-expression of OsIRTlleads to increased iron and zinc accumulations in rice. Plant, cell&environment2009, 32(4) :408-416.)為鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體的陽(yáng)性對(duì)照，pFL61 轉(zhuǎn)化野生型菌株DY1455作為另一陽(yáng)性對(duì)照，轉(zhuǎn)化后鑒定為陽(yáng)性的酵母菌，在SD液體培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，酵母菌液分別稀釋4個(gè)濃度（0D_ = 1、0. 1、0.01、0.001)，然后取5111^點(diǎn)在低鋅、 低鐵和正常SD的培養(yǎng)基中，低鋅培養(yǎng)基（SD培養(yǎng)基加入0.4mMEDTA、0.4mMEDTA和 250μM ZnS04、0. 4mM EDTA 和 300 μ M ZnSO4)，低鐵培養(yǎng)基（SD 培養(yǎng)基加入 50mM MES、50mM MES 和 50 μ M FeCl3、50mM MES 和 100 μ M FeCl3)酵母互補(bǔ)參照 Lin, Υ· F 的試驗(yàn)（Lin YF, Liang HM, Yang SY, et al.Arabidopsis IRT3is a zinc-regulated and plasma membrane localized zinc/iron transporter. The New phytologist2009, 182 (2) :392-404.)方法進(jìn) 行，28 °C培養(yǎng)，6天觀察試驗(yàn)結(jié)果。
[0135] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在低鋅條件下，加有250μΜ ZnSO4的培養(yǎng)基中能明顯觀察到 DY-pFL61(野生型）、Z-ZmZIP5、Z-〇sZIP5、Z-〇sZIP8、Z-〇sIRTl 比空載體 Z-pFL61 長(zhǎng)勢(shì)好，并 且，ZmZIP5比已經(jīng)報(bào)道的水稻OsZIP長(zhǎng)勢(shì)好。在低鐵條件下，ZmZIP5與已經(jīng)報(bào)道的OsIRTl 的轉(zhuǎn)運(yùn)活性相當(dāng)（圖12)，表明ZmZIP5在植物體中具有較強(qiáng)的吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)鋅鐵的功能。
[0136] 實(shí)驗(yàn)例I ZmZIP5基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)提高擬南芥種子中鐵或鋅含量的實(shí)驗(yàn)
[0137] 將ZmZIP5基因與組成型35S啟動(dòng)子控制的植物表達(dá)載體pBI121相連接構(gòu)建得到 ZmZIP5基因重組植物表達(dá)載體（圖13);將構(gòu)建的重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到擬南芥中，鑒定 獲得陽(yáng)性的轉(zhuǎn)ZmZIP5基因擬南芥；將陽(yáng)性的轉(zhuǎn)ZmZIP5基因擬南芥與野生型哥倫比亞在相 同的載培條件下培養(yǎng)，分別收獲轉(zhuǎn)ZmZIP5基因擬南芥種子和野生型擬南芥種子，分別測(cè)定 轉(zhuǎn)ZmZIP5基因擬南芥種子和野生型擬南芥種子中鐵和鋅的含量；每批測(cè)定200mg種子，測(cè) 定三批，取三批數(shù)據(jù)的平均值。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖14。從圖14的結(jié)果可見(jiàn)，在擬南芥中過(guò)表達(dá) ZmZIP5基因能夠顯著提高種子中鐵或鋅含量。
【權(quán)利要求】
1. 從玉米（Zea mays)中分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5基因，其特征在于，其cDNA序 列選自（a)、（b)或（c): (a) 、SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列； (b) 、編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸的核苷酸序列； (c) 、與SEQ ID NO: 1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷酸，該核苷酸所 編碼的蛋白質(zhì)具有鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。
2. 權(quán)利要求1所述的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5基因所編碼的蛋白質(zhì)。
3. 按照權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列為（a)或（b) 所示： (a) 、SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列； (b) 、將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的蛋白變體。
4. 含有權(quán)利要求1所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5基因的重組表達(dá)載體；優(yōu)選的，所述的 重組表達(dá)載體是重組植物表達(dá)載體。
5. 權(quán)利要求1所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5基因在調(diào)控或改善植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存鋅 或鐵能力中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5基因在調(diào)控或促進(jìn)植物種子胚發(fā)育中的應(yīng) 用。
7. 權(quán)利要求1所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5基因在增加糧食作物種子鋅或鐵含量中的 應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5基因在解除過(guò)量的鋅或鐵對(duì)植物毒害中的 應(yīng)用。
9. 按照權(quán)利要求5-8任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，包括：將權(quán)利要求1所述鋅鐵 調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP5基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接，得到重組植物表達(dá)載體；將重組 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體植物或植物細(xì)胞，培育得到轉(zhuǎn)基因植物。
10. 按照權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的受體植物是糧食作物；優(yōu)選為玉 米、水稻、小麥或高粱。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK104212817SQ201410241067
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月31日
【發(fā)明者】陳茹梅, 陳景堂, 李素貞, 周曉今, 范云六 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所