Uch677蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物生長發(fā)育中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種UCH677蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物生長發(fā)育中的應(yīng)用。該應(yīng)用為由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或其編碼基因在調(diào)控植物如下1)-10)中至少一種的生長發(fā)育中的應(yīng)用：1)種子重量；2)種子體積；3)種子粒長；4)種子粒寬；5)種子粒厚；6)單穗種子數(shù)；7)植株株高；8)植株葉長；9)植株葉寬；10)植株穗長。實驗證明，在水稻的發(fā)育過程中，將水稻中UCH677蛋白表達水平上調(diào)，可導(dǎo)致水稻種子表現(xiàn)出如下表型：比野生型水稻種子相比，種子重量增加、體積增大，同時單穗種子數(shù)增多；另外，從植株表型上來說，與野生型相比，過表達植株的株高更高。本發(fā)明為找出更簡單的創(chuàng)制作物高產(chǎn)性狀的思路和方法奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】UCH677蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物生長發(fā)育中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種UCH677蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物生長發(fā)育中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]從上世紀70年代以來，雜種優(yōu)勢利用為我國水稻生產(chǎn)做出了重大的貢獻。面臨我國經(jīng)濟發(fā)展對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所提出“高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效、安全、生態(tài)”的新的重大需求，能否進一步發(fā)掘雜種優(yōu)勢的應(yīng)用潛力以應(yīng)對，就成為擺在當代科學(xué)家面前的一個嚴峻挑戰(zhàn)。
[0003]雜種優(yōu)勢的形成基于兩個不同親本的組合。要在現(xiàn)有應(yīng)用的基礎(chǔ)上進一步發(fā)掘其潛力，除了需要加強雜種優(yōu)勢形成機制的研究之外，還急需建立有效的方法來創(chuàng)造雄性不育性狀，以便有效擴大雜交組合的篩選和優(yōu)秀組合在生產(chǎn)上的應(yīng)用。
[0004]目前，在育種工作和生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的雄性不育性狀多來自于自然突變及其性狀轉(zhuǎn)育株系。雄性不育性狀的來源十分有限，是擴大雜交組合篩選特別是應(yīng)用的嚴重制約因子。按照目前國際通行的規(guī)則，所有具有應(yīng)用潛力的創(chuàng)新都受到知識產(chǎn)權(quán)保護。因此，尋找新的、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)制人工控制作物種子大小及產(chǎn)量的思路和方法，已經(jīng)成為希望把握發(fā)掘雜種優(yōu)勢應(yīng)用潛力主動權(quán)的國家和地區(qū)所面臨的無法回避、亟待解決的關(guān)鍵問題之一。
[0005]長期以來， 人們一直利用常規(guī)育種的方法選育雜交作物，這些方法周期長、見效慢，不能滿足生產(chǎn)發(fā)展的迫切需要?；蚬こ谭椒ㄏ啾葌鹘y(tǒng)方法具有一些特點:選育周期縮短，育性相對穩(wěn)定，受環(huán)境影響小，對基因型依賴少，環(huán)境污染少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種UCH677蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物生長發(fā)育中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明所提供的應(yīng)用，具體為由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(命名為UCH677蛋白)或其編碼基因(命名為UCH677基因)在調(diào)控植物如下1)-10)中至少一種中應(yīng)用:
[0008]I)種子重量；
[0009]2)種子體積；
[0010]3)種子粒長；
[0011]4)種子粒寬；
[0012]5)種子粒厚；
[0013]6)單穗種子數(shù)；
[0014]7)植株株高；
[0015]8)植株葉長；
[0016]9)植株葉寬；[0017]10)植株穗長。
[0018]上述應(yīng)用具體體現(xiàn)在:所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的UCH677蛋白在所述植物中的表達量越高，所述植物的種子重量越重、和/或種子體積越大、和/或種子粒長越長、和/或種子粒寬越寬、和/或種子粒厚越厚、和/或單穗種子數(shù)越多、和/或植株株聞越聞、和/或植株葉長越長、和/或植株葉寬越寬、和/或植株穗長越長；所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的UCH677蛋白在所述植物中的表達量越低，所述植物的種子重量越輕、和/或種子體積越小、和/或種子粒長越短、和/或種子粒寬越窄、和/或種子粒厚越薄、和/或單穗種子數(shù)越少、和/或植株株高越矮、和/或植株葉長越短、和/或植株葉寬越窄、和/或植株穗長越短。
[0019]由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的(UCH677蛋白)或其編碼基因(UCH677基因)在選育具有如下I)-X)目的性狀中至少一種的植物品種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍:
[0020]I)種子重量增加或減少；
[0021]II)種子體積增大或減??；
[0022]III)種子粒長增長或減短；
[0023]IV)種子粒寬增寬或變窄；
[0024]V)種子粒厚增厚或變?。?br> [0025]VI)單穗種子數(shù)增加或減少；
[0026]VII)植株株高增高或變矮；
[0027]VIII)植株葉長增長或減短；
[0028]IX)植株葉寬增寬或變窄；
[0029]X)植株穗長增長或減短。
[0030]在實際應(yīng)用中，當所選育的植物品種為種子重量增加、和/或種子體積增大、和/或種子粒長增長、和/或種子粒寬增寬、和/或種子粒厚增厚、和/或單穗種子數(shù)增加、和/或)植株株高增高、和/或植株葉長增長、和/或植株葉寬增寬、和/或植株穗長增長的植物品種時，需將所述UCH677蛋白表達量較高的植株作為親本進行雜交。當所選育的植物品種為種子重量減少、和/或種子體積減小、和/或種子粒長減短、和/或種子粒寬變窄、和/或種子粒厚變薄、和/或單穗種子數(shù)減少、和/或植株株高變矮、和/或植株葉長減短、和/或植株葉寬變窄、和/或植株穗長減短的植物品種時，需將所述UCH677蛋白表達量較低的植株作為親本進行雜交。
[0031]本發(fā)明的再一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0032]本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可為如下(A)或⑶:
[0033](A)培育具有如下bl)_bl0)目的性狀中至少一種的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:
[0034]a)向目的植物中導(dǎo)入由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因，得到表達所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物；
[0035]b)從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，具有如下bl)_blO)目的性狀中至少一種的轉(zhuǎn)基因植物:
[0036]bl)種子重量增加；[0037]b2)種子體積增大；
[0038]b3)種子粒長增長；
[0039]b4)種子粒寬增寬；
[0040]b5)種子粒厚增厚；
[0041]b6)單穗種子數(shù)增加；
[0042]b7)植株株高增高；
[0043]b8)植株葉長增長；
[0044]b9)植株葉寬增寬；
[0045]blO)植株穗長增長；
[0046](B)培育具有如下dl)-dl0)目的性狀中至少一種的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:
[0047]c)在目的植物中對由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因進行抑制表達，得到轉(zhuǎn)基因植物；
[0048]d)從步驟c)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，具有如下dl)-dl0)目的性狀中至少一種的轉(zhuǎn)基因植物:
[0049]dl)種子重量減少；
[0050]d2)種子體積減?。?br> [0051]d3)種子粒長減短；
[0052]d4)種子粒寬變窄；
[0053]d5)種子粒厚變?。?br> [0054]d6)單穗種子數(shù)減少；
[0055]d7)植株株高變矮；
[0056]d8)植株葉長減短；
[0057]d9)植株葉寬變窄；
[0058]dlO)植株穗長減短。
[0059]在上述應(yīng)用或方法中，所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(UCH677蛋白)的編碼基因(UCH677基因)是如下(I)至(3)中任一所述的DNA分子:
[0060](I)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0061](2)在嚴格條件下與(I)所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0062](3)與⑴或⑵所限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0063]上述嚴格條件可為用6XSSC，0.5% SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC，
0.1 % SDS 和 I X SSC, 0.1 % SDS 各洗膜一次。
[0064] 其中，序列2由534個核苷酸組成，為所述UCH677基因的編碼序列(ORF);序列2編碼序列表中序列I所示的蛋白質(zhì)，序列I由177個氨基酸殘基組成。
[0065]在上述方法(A)中，所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因具體是通過重組表達載體的形式導(dǎo)入所述目的植物中的。
[0066]所述重組表達載體可用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達載體。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，例如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、泛素基因Ubiquitin啟動子(PUbi)、脅迫誘導(dǎo)型啟動子rd29A等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用重組表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物或是抗化學(xué)試劑標記基因等。也可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0067]在本發(fā)明的實施例中，所述重組表達載體中啟動所述UCH677基因基因轉(zhuǎn)錄的啟動子具體為Actin啟動子。
[0068]更為具體的，所述重組表達載體為將所述UCH677基因基因插入到pCAM23A載體的多克隆位點后得到的重組質(zhì)粒；在本發(fā)明的一個實施例中，所述多克隆位點具體為Xba I和Sal I。
[0069]在上述方法⑶中，所述在目的植物中對所述UCH677蛋白的編碼基因進行抑制表達，可為任何可降低 所述目的植物中所述UCH677基因的表達的方法。
[0070]在上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法㈧和方法⑶中，將攜帶有所述UCH677基因的所述重組表達載體或所述UCH677基因的所述RNA干擾表達載體導(dǎo)入所述目的植物，具體可為:通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
[0071]在上述各應(yīng)用或各方法中，所述植物即可為單子葉植物，也可為雙子葉植物。在本發(fā)明中，所述植物具體為單子葉植物水稻，如水稻品種中花11。
[0072]在上述各應(yīng)用或各方法中，所述葉長和所述葉寬均具體為旗葉的葉長和葉寬。
[0073]實驗證明，在水稻的發(fā)育過程中，本發(fā)明通過基因過表達技術(shù)，將水稻中UCH677蛋白及其編碼基因表達水平上調(diào)，可導(dǎo)致水稻種子表現(xiàn)出如下表型:比野生型水稻種子相t匕，種子重量增加、體積增大(粒長、寬、厚均增加)，同時單穗種子數(shù)增多；另外，從植株表型上來說,與野生型相比,過表達植株的株高更高、葉長、葉寬和穗長均增加。本發(fā)明為找出更簡單的創(chuàng)制作物高產(chǎn)性狀的思路和方法奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0074]圖1為T1代轉(zhuǎn)入過量表達載體pCAM23A_UCH677ox的轉(zhuǎn)基因水稻的PCR鑒定結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標準，各條帶從大到小依次為5000，3000，2000，1000，750，500，300，200bp ;泳道1-7為鑒定陽性的植株，8為未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻中花11。[0075]圖2為T1代轉(zhuǎn)入重組表達載體pCAM23A-UCH677ox的轉(zhuǎn)基因水稻中UCH677基因的實時熒光定量PCR檢測。其中，WT表示未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻中花11 ;677ox表示1\代轉(zhuǎn)入重組表達載體pCAM23A-UCH677ox的轉(zhuǎn)基因水稻。以未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻中花11中UCH677基因的表達量為I。*表示與WT相比差異顯著(P〈0.05)。
[0076]圖3為UCH677基因各遺傳材料水稻植株表型。其中，WT表示為未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示鑒定陽性的T1代轉(zhuǎn)入過量表達載體PCAM23A-UCH6770X的轉(zhuǎn)基因水稻植株。
[0077]圖4為UCH677基因各遺傳材料水稻植株的株高、旗葉的葉長和葉寬的統(tǒng)計結(jié)果。其中，A為株高；B和C分別為旗葉的葉長和葉寬。A-C中，WT表示未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代轉(zhuǎn)入重組表達載體pCAM23A-UCH677ox的轉(zhuǎn)基因水稻，*表示與WT相比差異顯著(P〈0.05)。
[0078]圖5為UCH677基因各遺傳材料水稻稻穗表型。其中，WT表示未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代轉(zhuǎn)入過量表達載體PCAM23A-UCH6770X的轉(zhuǎn)基因水稻植株。
[0079]圖6為UCH677基因各遺傳材料水稻單穗種子數(shù)。其中，ZHll表示未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代轉(zhuǎn)入過量表達載體PCAM23A-UCH6770X的轉(zhuǎn)基因水稻植株，*表示與ZHll相比差異顯著(P〈0.05)。
[0080]圖7為UCH677基因各遺傳材料水稻籽粒表型。其中，WT表示未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代轉(zhuǎn)入過量表達載體PCAM23A-UCH6770X的轉(zhuǎn)基因水稻植株。
[0081]圖8為UCH677基因各遺傳材料水稻籽粒的粒長、粒厚和粒寬的統(tǒng)計結(jié)果。其中，A、B和C分別為粒長、 粒寬和粒厚。A-C中，WT表示未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代轉(zhuǎn)入重組表達載體pCAM23A-UCH677ox的轉(zhuǎn)基因水稻，*表示與WT相比差異顯著(Ρ〈0.05)。
[0082]圖9為UCH677基因各遺傳材料水稻種子的千粒重。其中，ZHll表示未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻中花11 ；677οχ表示T1代轉(zhuǎn)入過量表達載體PCAM23A-UCH6770X的轉(zhuǎn)基因水稻植株，*表示與ZHll相比差異顯著(P〈0.05)。
[0083]圖10為UCH677基因各遺傳材料水稻種子的結(jié)實率。其中，ZHlI表示未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代轉(zhuǎn)入過量表達載體PCAM23A-UCH6770X的轉(zhuǎn)基因水稻植株。
【具體實施方式】
[0084]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0085]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0086]PCAM23A載體:北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。記載于“池正昌.水稻減數(shù)分裂基因OsSGOl功能研究與分析.揚州大學(xué)，2010年，碩士論文”一文中。pCAM23A載體上自帶的位于Xba I上游的啟動子是Actin啟動子。
[0087]水稻品種中花11號:購自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所；由中國農(nóng)科院作物所1979年用京風(fēng)五號/特特普/福錦進行花培。記載于“倪丕沖.水稻花培新品種一中花11號.作物品種資源，1989年04期”。
[0088]農(nóng)桿菌EHA105:北京全式金生物工程有限公司。[0089]下述實施例中獲得轉(zhuǎn)基因植物的過程中所涉及的培養(yǎng)基如下: [0090]1、水稻愈傷誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)基(粳稻)NB基本培養(yǎng)基
[0091]
【權(quán)利要求】
1.由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或其編碼基因在調(diào)控植物生長發(fā)育中的應(yīng)用； 所述植物生長發(fā)育，具體體現(xiàn)在如下1)-10)中至少一種: 1)種子重量； 2)種子體積； 3)種子粒長； 4)種子粒寬； 5)種子粒厚； 6)單穗種子數(shù)； 7)植株株高； 8)植株葉長； 9)植株葉寬； 10)植株穗長。
2.由序列表中序列I所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)或其編碼基因在選育具有如下D-X)目的性狀中至少一種的植物品種中的應(yīng)用: I)種子重量增加或減少； 11)種子體積增大或減??； III)種子粒長增長或減短； IV)種子粒寬增寬或變窄； V)種子粒厚增厚或變??； VI)單穗種子數(shù)增加或減少； VII)植株株高增高或變矮； VIII)植株葉長增長或減短； IX)植株葉寬增寬或變窄； X)植株穗長增長或減短。
3.培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為如下⑷或⑶:(A)培育具有如下bl)-bl0)目的性狀中至少一種的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟: a)向目的植物中導(dǎo)入由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因，得到表達所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物； b)從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，具有如下bl)_blO)目的性狀中至少一種的轉(zhuǎn)基因植物: bl)種子重量增加； b2)種子體積增大； b3)種子粒長增長； b4)種子粒寬增寬； b5)種子粒厚增厚； b6)單穗種子數(shù)增加； b7)植株株高增高；b8)植株葉長增長； b9)植株葉寬增寬； blO)植株穗長增長； (B)培育具有如下dl)-dlO)目的性狀中至少一種的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟: c)在目的植物中對由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因進行抑制表達，得到轉(zhuǎn)基因植物； d)從步驟c)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，具有如下dl)-dlO)目的性狀中至少一種的轉(zhuǎn)基因植物: dl)種子重量減少； d2)種子體積減??； d3)種子粒長減短； d4)種子粒寬變窄； d5)種子粒厚變??； d6)單穗種子數(shù)減少； d7)植株株高變矮； d8)植株葉長減短； d9)植株葉寬變窄； dlO)植株穗長減短。
4.根據(jù)權(quán)利要求1- 3中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是如下(I)至(3)中任一所述的DNA分子: (1)序列表中序列2所不的DNA分子； (2)在嚴格條件下與⑴所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子； (3)與(I)或⑵所限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述(A)中，所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是通過重組表達載體的形式導(dǎo)入所述目的植物中的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述重組表達載體中，啟動所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為Actin啟動子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述單子葉植物為水稻。
【文檔編號】C07K14/415GK104004074SQ201410228344
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】王東輝, 白書農(nóng), 許智宏 申請人:北京大學(xué)