本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用芽孢桿菌高效分泌表達(dá)外源蛋白的方法。

背景技術(shù)：

蛋白表達(dá)技術(shù)是現(xiàn)代生物學(xué)的核心技術(shù)之一，表達(dá)蛋白不僅可用于生物學(xué)研究，也可以提供商業(yè)化的蛋白制品，如重組疫苗、重組胰島素、細(xì)胞因子等產(chǎn)品。目前常用的表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等，但是它們都各有明顯的優(yōu)缺點(diǎn)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究最充分，有多種選擇，最常用的是novagen的pet表達(dá)系統(tǒng)，其利用噬菌體的t7rna聚合酶可專一性地轉(zhuǎn)錄t7啟動子后的目的基因，在最佳條件下，目的蛋白可以達(dá)到大腸桿菌總蛋白的50％以上。盡管具有表達(dá)效率高，培養(yǎng)成本低等優(yōu)點(diǎn)，但是缺點(diǎn)也非常明顯：蛋白容易形成包涵體，復(fù)性難度和成本較高；大腸桿菌不能對蛋白進(jìn)行糖基化修飾；細(xì)胞壁含有脂多糖(內(nèi)毒素)，不易完全去除；胞內(nèi)蛋白種類多，目的蛋白純化過程中不易去除各種雜質(zhì)蛋白。另外一個常用的表達(dá)系統(tǒng)是酵母表達(dá)系統(tǒng)，其具有表達(dá)量高，可誘導(dǎo)，蛋白分泌到胞外易于純化，并且具有一定的翻譯后修飾能力等優(yōu)點(diǎn)，但是缺點(diǎn)是部分表達(dá)產(chǎn)物易降解，表達(dá)量不可控，大于30kda的蛋白幾乎不能分泌。動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)是具有完整的修飾系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物具有或者類似的天然活性，沒有內(nèi)毒素污染，但是表達(dá)量低，周期長，技術(shù)要求高，生產(chǎn)成本高。

枯草芽孢桿菌是一種廣泛存在于水體、空氣、土壤中的革蘭氏陽性菌，其可以在環(huán)境不適宜的時候產(chǎn)生孢子，孢子可以抵御高溫、干旱等極端環(huán)境，待環(huán)境適宜時再萌發(fā)進(jìn)行營養(yǎng)生長?？莶菅挎邨U菌的分泌能力強(qiáng)，在進(jìn)行高密度發(fā)酵時，蛋白分泌量可以達(dá)到20—25g/l(developmentsintheuseofbacillusspeciesforindustrialproduction，2004)。其發(fā)酵生產(chǎn)的蛋白酶、淀粉酶、次黃嘌呤核苷、核糖甙等產(chǎn)品，早已經(jīng)進(jìn)入我們的日常生活。由于其具有生物安全性，被fda評為gras類添加劑，其生產(chǎn)的益生菌及利用其生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和養(yǎng)殖業(yè)中。

上世紀(jì)八十年代就開始利用枯草芽孢桿菌進(jìn)行蛋白表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物不僅包括細(xì)菌來源的各種酶類，如淀粉酶、蛋白酶、內(nèi)葡聚糖酶、脂肪酶等，還包括hegf、ifn-alpha2、proinsulin、streptavidin、cathelicidin-bf等不同來源的蛋白。利用枯草芽孢桿菌的分泌途徑，可將表達(dá)蛋白分泌到發(fā)酵液中，極大地降低了后期分離純化的難度?？莶菅挎邨U菌屬于革蘭氏陽性菌，不含有脂多糖，便于生產(chǎn)注射用藥品?？莶菅挎邨U菌的營養(yǎng)要求簡單，由于其已經(jīng)實(shí)現(xiàn)規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)成熟，培養(yǎng)成本低。目前，枯草芽孢桿菌中的多個菌株及芽孢桿菌屬中的多個種都已經(jīng)完成了基因組測序工作，遺傳背景清楚，安全性高，也便于進(jìn)行基因組改造。但是枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)并不是一個廣泛應(yīng)用的表達(dá)系統(tǒng)，還有許多缺點(diǎn)待克服。

枯草芽孢桿菌的模式菌168菌的野生型菌株已經(jīng)丟失，目前可以得到的菌株都是其突變體。盡管其滿足于科學(xué)研究的要求，但是其蛋白分泌能力差，是營養(yǎng)缺陷性突變體的特性，并不能滿足建立商業(yè)化表達(dá)系統(tǒng)的要求。目前建立的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)都是基于模式菌株168建立的，盡管野生型來源的菌株和已經(jīng)生產(chǎn)應(yīng)用的枯草芽孢桿菌種非常多，不易轉(zhuǎn)化都阻礙了對這些菌株的進(jìn)一步改造?？莶菅挎邨U菌來源的質(zhì)粒也幾乎都是隱蔽性質(zhì)粒，不易構(gòu)建載體；來源于其它革蘭氏陽性菌的質(zhì)粒多數(shù)都是滾環(huán)復(fù)制性質(zhì)粒，在枯草芽孢桿菌中復(fù)制不穩(wěn)定，易丟失，拷貝數(shù)較少；這些特性都限制了直接使用質(zhì)粒構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)的可能性?？莶菅挎邨U菌有四種已知的分泌途徑，sec途徑、tat途徑、com系統(tǒng)和abc轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，目前研究較清楚的是sec途徑，多數(shù)表達(dá)系統(tǒng)也利用sec途徑分泌表達(dá)蛋白。但是sec途徑具有內(nèi)在調(diào)控機(jī)制，會抑制不正確折疊的蛋白分泌，而外源蛋白一般折疊較慢，折疊過程需要伴侶蛋白的參與，容易被sec分泌途徑降解，這導(dǎo)致只有極少數(shù)蛋白可以利用sec途徑進(jìn)行分泌表達(dá)，且外源蛋白的表達(dá)量都比較低。枯草芽孢桿菌還會分泌多達(dá)八種蛋白酶到發(fā)酵液中，其同樣會降解表達(dá)的目的蛋白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種利用芽孢桿菌高效分泌表達(dá)外源蛋白的方法，其不依賴于信號肽或者特征結(jié)構(gòu)，與現(xiàn)有的sec途徑、tat途徑、com系統(tǒng)和abc轉(zhuǎn)運(yùn)途徑有本質(zhì)上差異。當(dāng)任一目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)，就可以通過這一途徑大量分泌到細(xì)胞外，最大分泌量可以達(dá)到g/l級別。不僅克服了現(xiàn)有分泌途徑分泌量低，通用性差的特點(diǎn)，還可以無選擇性地將目的蛋白分泌到發(fā)酵液中，降低后期分離純化的難度。

解決以上技術(shù)問題的本發(fā)明中的一種利用芽孢桿菌高效分泌表達(dá)外源蛋白的方法，其特征在于：所述目的蛋白在胞內(nèi)大量積累，其就被大量分泌到發(fā)酵液中。

所述目的蛋白在胞內(nèi)表達(dá)量超過總蛋白的2％以上時，其將會被分泌到發(fā)酵液中，分泌量在占表達(dá)蛋白的50％以上。

本發(fā)明中一種利用芽孢桿菌高效分泌表達(dá)外源蛋白的方法，其特征在于：具體包括以下步驟：

(1)構(gòu)建缺失八個蛋白酶的芽孢桿菌菌種：敲除芽孢桿菌表達(dá)菌株的apre、bpr、epr、mpr、nprb、npre、wpra和vpr八個蛋白酶基因，避免目的蛋白分泌到發(fā)酵液中后，被枯草芽孢表達(dá)菌株分泌的蛋白酶降解掉；

這八個蛋白酶為表達(dá)分泌蛋白酶到發(fā)酵液中的基因，去除后能改善發(fā)酵液中的蛋白降解情況。

(2)克隆目的蛋白基因，根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)的要求構(gòu)建表達(dá)載體，并將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入缺失八個蛋白酶的芽孢桿菌菌株，獲得表達(dá)目的蛋白的表達(dá)菌株；

(3)對步驟(2)中的表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，即得分泌的目的蛋白。

本發(fā)明通過表達(dá)系統(tǒng)胞內(nèi)大量表達(dá)目的蛋白，如果目的蛋白在胞內(nèi)大量積累，其就可以被大量分泌到發(fā)酵液中，且任一可以胞內(nèi)大量表達(dá)目的蛋白的表達(dá)系統(tǒng)都能用于蛋白分泌表達(dá)。

所述表達(dá)系統(tǒng)為使目的蛋白在胞內(nèi)積累被大量分泌到發(fā)酵液中的表達(dá)系統(tǒng)。

本發(fā)明所采用的表達(dá)系統(tǒng)為“無抗表達(dá)系統(tǒng)”，其克服了抗生素篩選標(biāo)記基因易發(fā)生漂移，質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)不穩(wěn)定，表達(dá)不可誘導(dǎo)表達(dá)量不高的缺點(diǎn)，為一種低背景可控誘導(dǎo)且高效表達(dá)的無抗表達(dá)系統(tǒng)。

所述“無抗表達(dá)系統(tǒng)”的菌株構(gòu)建過程，包括采用xylr基因、xylab的啟動子區(qū)域和t7rna聚合酶基因的cds片段替換z12菌株的wpra蛋白酶基因，具體包括以下步驟：

(1)pcr擴(kuò)增wpra基因上游片段wpra-f和wpra基因下游片段wpra-r，全基因合成xylr操縱子的xylr基因啟動子及cds區(qū)域和xylab的啟動子區(qū)域，全基因合成t7rna聚合酶基因的cds片段，通過同源重組構(gòu)建載體pbts-t7rp；

(2)轉(zhuǎn)化pbts-t7rp質(zhì)粒進(jìn)入z12菌株，通過限制性培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，分別在基因組的wpra-f和wpra-r兩個片段處完成兩次重組，得到不具有抗性的含有xylr-t7rp片段的菌株zt7rp。

本發(fā)明所采用的“無抗表達(dá)系統(tǒng)”的表達(dá)菌株zt7rp，在菌株構(gòu)建過程中已經(jīng)敲除了wpra蛋白酶基因。

本發(fā)明中構(gòu)建缺失八個蛋白酶的芽孢桿菌菌株的方法，即分別構(gòu)建pbts-apre、pbts-bpr、pbts-epr、pbts-mpr、pbts-nprb、pbts-npre和pbts-vpr載體，逐次敲除zt7rp菌株中的apre、bpr、epr、mpr、nprb、npre和vpr基因，獲得新菌株z15；

具體包括以下步驟：

(1)pcr擴(kuò)增待敲除基因x上游500-800bp的片段x-f，插入pbts載體中，得到質(zhì)粒pbts-x-f；擴(kuò)增待敲除基因x下游500-800bp的片段x-r，插入pbts-x-f載體中x-f片段的下游，得到質(zhì)粒pbts-x，其中，x代表為wpra、apre、bpr、epr、mpr、npre、nprb、vpr；

(2)轉(zhuǎn)化pbts-x質(zhì)粒進(jìn)入菌株，通過限制性培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，分別在基因組的x-f和x-r兩個片段處完成兩次重組，得到敲除基因x的菌株；

重復(fù)以上步驟，直到菌株中apre、bpr、epr、mpr、nprb、npre和vpr七個蛋白酶基因均被敲除。

本發(fā)明所采用的“無抗表達(dá)系統(tǒng)”的目的基因胞內(nèi)表達(dá)方法，包括構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pbts-fr、合成目的基因片段x、構(gòu)建表達(dá)載體pbts-fr-x以及通過同源重組把目的基因插入到xylab基因區(qū)域，具體包括以下過程：

(1)pcr擴(kuò)增xylab基因上游片段xyl-f和xylab基因下游片段xyl-r，全基因合成t7啟動子、xylr結(jié)合位點(diǎn)、rbs位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)和t7終止子片段，通過同源重組，構(gòu)建質(zhì)粒pbts-fr；

(2)通過pcr擴(kuò)增或者全基因合成任一需要表達(dá)的基因片段，通過同源重組方式插入到pbts-fr的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)載體pbts-fr-x；

(3)轉(zhuǎn)化pbts-fr-x質(zhì)粒進(jìn)入z15菌株，通過限制性培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，在xyl-f和xyl-r中任一一處發(fā)生一次重組，得到菌株z15-x-45；或者分別在基因組的xyl-f和xyl-r兩個片段處完成兩次重組，得到不具有抗性的含有x片段的菌株z15-x；

(4)接種z15-x到培養(yǎng)基中，加入0.01‰-5‰濃度的木糖進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)時間>＝20h后，即得菌體或者發(fā)酵液中的目標(biāo)蛋白。培養(yǎng)溫度為25-40℃，接種后0-8h加入木糖進(jìn)行誘導(dǎo)。

所述pbts核苷酸序列如seqidno.1所示。

所述pbts-t7rp核苷酸序列如seqidno.2所示。

所述pbts-fr核苷酸序列如seqidno.3所示。

所述芽孢桿菌為芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌168、z12菌株、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和其它芽孢桿菌。

所述枯草芽孢桿菌z12，拉丁文bacillussubtilisz12，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心cgmcc，保藏號為12750。

本發(fā)明的有益效果如下：

a、該分泌途徑不需要信號肽、特征結(jié)構(gòu)等用于轉(zhuǎn)運(yùn)識別的結(jié)構(gòu)區(qū)域，分泌產(chǎn)生的目的蛋白不含有多余的蛋白序列。

b、該分泌途徑不具有選擇性，任一可以在胞內(nèi)大量表達(dá)的蛋白都可以分泌到發(fā)酵液中，顯著低降低后續(xù)目的蛋白的分離純化流程和成本。

c、具有分泌量大的特點(diǎn)，可以達(dá)到g/l級別。

本發(fā)明結(jié)合芽孢桿菌，尤其是枯草芽孢桿菌，已被fda認(rèn)定為gras類添加劑，發(fā)酵周期短，生產(chǎn)成本低的特點(diǎn)，利用本發(fā)明中分泌途徑可以規(guī)模化生產(chǎn)蛋白多肽類生物技術(shù)產(chǎn)品，改變大眾的生活方式。

附圖說明

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式對本發(fā)明做更進(jìn)一步詳細(xì)說明：

圖1不同濃度木糖誘導(dǎo)gfp蛋白分泌表達(dá)page電泳圖

圖2不同蛋白的分泌表達(dá)page電泳圖

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明作詳細(xì)的說明：

實(shí)施例1

1、通過ecori和apai內(nèi)切酶切割pbav1k-t5-gfp(http://www.addgene.org/vector-database/)質(zhì)粒，與合成的mcs片段進(jìn)行同源重組克隆，得到質(zhì)粒pbav1k。

本實(shí)驗(yàn)及后續(xù)試驗(yàn)中的內(nèi)切酶采用thermo公司的快速內(nèi)切酶，片段回收采用成都福際生物公司的膠回收試劑盒(de-02011)，mcs片段由金唯智生物科技有限公司合成，同源重組采用天根的esaygeno快速重組克隆試劑盒(vi201-02)，大腸桿菌菌株為top10，制備感受態(tài)采用kcm法，質(zhì)粒抽提采用福際生物的通用質(zhì)粒小量提取試劑盒(de-01001)。

2、設(shè)計引物，擴(kuò)增同義突變刪除ndei酶切位點(diǎn)的pbav1k片段，采用同源重組克隆的方式連接擴(kuò)增片段，獲得質(zhì)粒命名為pbts。

本實(shí)驗(yàn)及后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的引物由金唯智生物科技有限公司合成。

實(shí)施例2

1、菌株轉(zhuǎn)化方法參見高滲轉(zhuǎn)化法(highosmolarityimprovestheelectro-transformationefficiencyofthegram-positivebacteriabacillussubtilisandbacilluslicheniformis，1999)。取待轉(zhuǎn)化菌株的新劃線單菌落，接種到約3mlgm(lb+0.5m山梨糖醇)培養(yǎng)基中，37℃，180rpm過夜培養(yǎng)。第二天早上按1:100接種到50mlgm培養(yǎng)基中，37℃，180rpm培養(yǎng)，待菌液生長到od達(dá)到0.85-0.95之間時，將菌液放到冰上預(yù)冷10min；4℃，5000g，5min，離心去上清，用等體積預(yù)冷的em(0.5m山梨糖醇+0.5m甘露糖醇+10％甘油水溶液)重懸菌體，再次4℃，5000g，5min，離心去上清，一共重復(fù)洗滌4次；加入約1/40體積的em重懸菌體，保證菌液濃度在1-1.3×10¹⁰cfu/ml之間。取60ul上述菌液，加入1ul待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度大于100ng/ul，吹打混勻，然后加入預(yù)冷的1mm電擊杯。電轉(zhuǎn)化儀(eppendorfeporator)參數(shù)設(shè)定，2.1kv，實(shí)際電擊時間在4.0-5.0ms時，才可能有轉(zhuǎn)化菌落生長。電擊后，立即加1mlrm(lb+0.5m山梨糖醇+0.38m甘露糖醇)，吹打混勻，轉(zhuǎn)入5ml無菌離心管中，37℃，180rpm培養(yǎng)3h。將菌液離心，去上清后按一定比例稀釋，取200ul涂布到含有30mg/l卡那霉素的lb平板上，37℃過夜培養(yǎng)，同時涂布未經(jīng)電轉(zhuǎn)化的菌液做陰性對照。第二天早上觀察菌落生長情況，若轉(zhuǎn)化板有菌落生長，陰性對照沒有，則表明轉(zhuǎn)化成功。

實(shí)施例3

枯草芽孢桿菌z12(((拉丁文為bacillussubtilisz12)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，保藏號為12750，保藏日期為2016年7月11日))菌落圓形，呈白色或淡黃色，不透明，表明粗糙，有褶皺，邊緣不整齊。z12生長過程需氧，生長最適ph7.0-8.5，最適溫度30-45℃，革蘭氏染色呈陽性。

枯草芽孢桿菌的培育方法，包括以下步驟：

(1)采集野生型菌種：采集含有枯草芽孢桿菌的土壤，按土壤與培養(yǎng)基的用量比例為1：100加入lb培養(yǎng)基，37℃，200rpm，培養(yǎng)24h，得到富含芽孢桿菌孢子的菌懸液，得到原始菌種。

土壤可在原始林區(qū)，富含降解菌的地方進(jìn)行采集。

(2)菌株富集與篩選：取1ml菌液，85℃加熱處理30min，殺死所有菌體；然后按10³和10⁵倍稀釋涂板，lb培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)；對獲得的單菌落再次劃線，進(jìn)行純度鑒定。純度鑒定是劃線培養(yǎng)，所有的單菌落形態(tài)一致。

(3)菌株轉(zhuǎn)化篩選：若需要檢測轉(zhuǎn)化效率，則統(tǒng)計生長菌落總數(shù)，并乘以稀釋倍數(shù)，通過質(zhì)粒添加量，計算轉(zhuǎn)化效率。

菌株轉(zhuǎn)化方法參見高滲轉(zhuǎn)化法和電轉(zhuǎn)化法,如實(shí)施例2中的內(nèi)容。

實(shí)施例4

1、設(shè)計引物擴(kuò)增枯草芽孢桿菌z12菌株的wpra基因上游602bp的片段wpra-f；設(shè)計引物擴(kuò)增wpra下游601bp的片段wpra-r；全基因合成xylr啟動子以及cds和xylab的啟動子區(qū)域片段xylr；全基因合成t7rna聚合酶片段t7rp；通過同源重組克隆構(gòu)建載體pbts-t7rp。

2、電轉(zhuǎn)化pbts-t7rp進(jìn)入z12菌株，得到菌z12-pbts-t7rp。

3、取菌z12-pbts-t7rp接種到3mllb培養(yǎng)基中，45℃，180rpm，培養(yǎng)24h；另接菌z12-pbts做對照。

4、取3中的菌液200ul涂布到含有30mg/l卡那霉素的lb平板上，45℃過夜培養(yǎng)。若z12-pbts沒有菌落生長，z12-pbts-t7rp有菌落生長，則得到的菌株完成第一次重組，命名為z12-pbts-t7rp-45。

5、接菌z12-pbts-t7rp-45到3mllb培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，抽提基因組，pcr擴(kuò)增xylr-t7rp片段進(jìn)行驗(yàn)證。

6、取5中驗(yàn)證為陽性的z12-pbts-t7rp-45菌株，接種到3mllb基中，37℃，180rpm培養(yǎng)，每隔8-16h傳代一次，連續(xù)傳代10次后，取菌液稀釋10⁶倍，涂布于無抗的lb平板上，得到單菌落。

7、取6中的單菌落，同時劃線到lb和含有30mg/l卡那霉素的lb平板上，篩選無抗的菌落，需要得到5-10株無抗菌落。

8、取7中的無抗菌落，接種到3mllb培養(yǎng)基中，37℃，180rpm過夜培養(yǎng)，抽提細(xì)菌基因組，通過pcr擴(kuò)增xylr-t7rp片段驗(yàn)證同源重組結(jié)果(野生型或者插入t7rp片段)。取陽性的片段，送金唯智生物科技有限公司進(jìn)一步進(jìn)行測序驗(yàn)證，得到陽性的菌株即為插入xylr-t7rp片段的菌株——zt7rp(wpra::(xylr-pxylabrpot7))。

實(shí)施例5

1、設(shè)計引物擴(kuò)增枯草芽孢桿菌z12菌株的apre操縱子上游561bp的片段apre-f，插入pbts的ecori和bamhi位點(diǎn)間，得到質(zhì)粒pbts-apre-f；擴(kuò)增下游486bp的片段apre-r，插入質(zhì)粒pbts-apre-f的bamhi和hindiii之間，得到質(zhì)粒pbts-apre質(zhì)粒(敲除apre基因)。

2、采用實(shí)施例2中的高滲轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化pbts-apre進(jìn)入zt7rp菌株，獲得zt7rp-pbts-apre菌株。

3、取菌zt7rp-pbts-apre接種到3mllb培養(yǎng)基中，45℃，180rpm，培養(yǎng)24h；另接菌zt7rp-pbts做對照。

4、取3中的菌液200ul涂布到含有30mg/l卡那霉素的lb平板上，45℃過夜培養(yǎng)。若zt7rp-pbts沒有菌落生長，zt7rp-pbts-apre有菌落生長，則得到的菌株完成第一次重組，命名為zt7rp-pbts-apre-45。

5、接菌zt7rp-pbts-apre-45到3mllb培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，抽提基因組(成都福際生物技術(shù)有限公司，細(xì)菌基因組dna提取試劑盒，de-05311)，pcr擴(kuò)增apre片段進(jìn)行驗(yàn)證(成都福際生物技術(shù)有限公司，2×快速pcr反應(yīng)預(yù)混體系，dp-20041)。

6、取5中驗(yàn)證為陽性的zt7rp-pbts-apre-45菌株，接種到3mllb基中，37℃，180rpm培養(yǎng)，每隔8-16h傳代一次，連續(xù)傳代8次后，取菌液稀釋10⁶倍，涂布于無抗的lb平板上，得到單菌落。

7、取6中的單菌落，同時劃線到lb和含有30mg/l卡那霉素的lb平板上，篩選無抗的菌落，需要得到5-10株無抗菌落。

8、取7中的無抗菌落，接種到3mllb培養(yǎng)基中，37℃，180rpm過夜培養(yǎng)，抽提細(xì)菌基因組，通過pcr擴(kuò)增apre片段驗(yàn)證同源重組結(jié)果(野生型或者敲除apre基因)。取陽性的片段，送金唯智生物科技有限公司進(jìn)一步進(jìn)行測序驗(yàn)證，得到陽性的菌株即為敲除apre基因的菌株(△(apre)，wpra::(xylr-pxylabrpot7))。

實(shí)施例6

1、參比實(shí)施例5，分別構(gòu)建pbts-bpr、pbts-epr、pbts-mpr、pbts-nprb、pbts-npre、pbts-vpr載體，逐次敲除zt7rp菌株(△(apre)，wpra::(xylr-pxylabrpot7))中的bpr、epr、mpr、nprb、npre和vpr基因，獲得新菌株z15(△(apre),△(bpr),△(epr),△(mpr),△(nprb),△(npre),△(vpr)，wpra::(xylr-pxylabrpot7))。

實(shí)施例7

1、設(shè)計引物擴(kuò)增xylab基因上游493bp片段xyl-f；設(shè)計引物擴(kuò)增xylab基因下游585bp片段xyl-r；全基因合成t7啟動子、xylr結(jié)合位點(diǎn)、rbs位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、t7終止子位點(diǎn)片段；通過同源重組克隆上述三個片段與pbts載體連接，構(gòu)建質(zhì)粒pbts-fr。

實(shí)施例8

1、全基因合成綠色熒光蛋白(gfp)基因，通過同源重組克隆插入到pbts-fr載體中，構(gòu)建成載體pbts-fr-gfp。

2、電轉(zhuǎn)化pbts-fr-gfp進(jìn)入z15菌株，得到菌z15-pbts-fr-gfp。

3、取菌z15-pbts-fr-gfp接種到3mllb培養(yǎng)基中，45℃，180rpm，培養(yǎng)24h；另接菌z15-pbts做對照。

4、取3中的菌液200ul涂布到含有30mg/l卡那霉素的lb平板上，45℃過夜培養(yǎng)。若z15-pbts沒有菌落生長，z15-pbts-fr-gfp有菌落生長，則得到的菌株完成第一次重組，命名為z15-gfp-45(z15-gfp-45也可以用于誘導(dǎo)，其表達(dá)量高于z15-gfp)。

5、接菌z15-gfp-45到3mllb培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，抽提基因組，pcr擴(kuò)增gfp片段進(jìn)行驗(yàn)證。

6、取5中驗(yàn)證為陽性的z15-gfp-45菌株，接種到3mllb基中，37℃，180rpm培養(yǎng)，每隔8-16h傳代一次，連續(xù)傳代10次后，取菌液稀釋10⁶倍，涂布于無抗的lb平板上，得到單菌落。

7、取6中的單菌落，同時劃線到lb和含有30mg/l卡那霉素的lb平板上，篩選無抗的菌落，需要得到5-10株無抗菌落。

8、取7中的無抗菌落，接種到3mllb培養(yǎng)基中，37℃，180rpm過夜培養(yǎng)，抽提細(xì)菌基因組，通過pcr擴(kuò)增gfp片段驗(yàn)證同源重組結(jié)果(是否插入gfp片段)。取陽性的片段，送金唯智生物科技有限公司進(jìn)一步進(jìn)行測序驗(yàn)證，得到陽性的菌株即為插入gfp片段的菌株——z15-gfp。

9、接菌z15-gfp到40mllb培養(yǎng)基中，添加不同濃度的木糖進(jìn)行誘導(dǎo)(0、0.1‰、0.2‰、0.5‰、1‰、2‰、5‰)，另接種z15到40mllb中，添加0和2‰的木糖作對照。37℃，200rpm，培養(yǎng)24h。

10、取各種菌液1ml，12000g離心一分鐘；取上清100ul，加入等體積2×loadingbuffer，95℃處理5min，作為菌液蛋白樣品進(jìn)行page電泳；沉淀采用600ulbuffera(50mmtris，2mmedta，100mmnacl，1％triton-100)重懸，加入1ul100mg/l的溶菌酶，37℃處理5min裂解細(xì)胞壁；取裂解液100ul，加入等體積的2×loadingbuffer，95℃處理5min，作為菌體蛋白樣品進(jìn)行page電泳。

11、對10中的樣品進(jìn)行page電泳，采用常規(guī)sda-page電泳，膠濃度為12％。

結(jié)果如圖1，1號泳道為marker，2-8號泳道分別添加0、0.1‰、0.2‰、0.5‰、1‰、2‰、5‰的木糖進(jìn)行誘導(dǎo)，9號和10號泳道為z15菌株，分別添加0和2‰的木糖；a圖是菌體蛋白電泳圖，b圖是菌液蛋白電泳圖；只有z15-gfp菌株在添加木糖誘導(dǎo)，胞內(nèi)積累gfp蛋白量大于2％以上時，gfp蛋白才可以分泌到發(fā)酵液中，并且隨著誘導(dǎo)木糖濃度升高，表達(dá)的gfp量逐漸增加，分泌到發(fā)酵液中的gfp蛋白量也逐漸增加；對所有樣品進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)分泌到發(fā)酵液中的gfp蛋白量等于或者大于胞內(nèi)殘留的蛋白量，表達(dá)分泌量達(dá)到50％以上。

實(shí)施例9

1、參比實(shí)施7，全基因合成rham、ibpb、ribc、tevp、grol、lacz基因，構(gòu)建pbts-fr-rham、pbts-fr-ibpb、pbts-fr-ribc、pbts-fr-tevp、pbts-fr-grol、pbts-fr-lacz載體，轉(zhuǎn)化進(jìn)入z15菌株，并完成第一次重組，構(gòu)建表達(dá)菌株z15-rham-45、z15-ibpb-45、z15-ribc-45、z15-tevp-45、z15-grol-45、z15-lacz-45。

2、接菌z15-rham-45、z15-ibpb-45、z15-ribc-45、z15-gfp-45、z15-tevp-45、z15-grol-45、z15-lacz-45到40mllb中，添加2‰的木糖進(jìn)行誘導(dǎo)，另接種z15到40mllb中，添加0和2‰的木糖作對照。37℃，200rpm，培養(yǎng)24h。

3、取各種菌液菌液1ml，12000g離心一分鐘；取上清100ul，加入等體積2×loadingbuffer，95℃處理5min，作為菌液蛋白樣品進(jìn)行page電泳；沉淀采用600ulbuffera(50mmtris，2mmedta，100mmnacl，1％triton-100)重懸，加入1ul100mg/l的溶菌酶，37℃處理5min裂解細(xì)胞壁；取處理液100ul，加入等體積的2×loadingbuffer，95℃處理5min，作為菌體蛋白樣品進(jìn)行page電泳。

4、對3中的樣品進(jìn)行page電泳，采用梯度sda-page電泳，膠濃度為10％-15％。

結(jié)果如圖2，1號泳道為marker，2號泳道為rham，3號泳道為ibpb，4號泳道為ribc，5號泳道為gfp，6號泳道為tevp，7號泳道為grol，8號泳道為lacz，9號和10號泳道為z15菌株，分別添加0和2‰的木糖；a圖為菌體蛋白，b圖為菌液蛋白。rham、ibpb、ribc、gfp、grol蛋白都可以在胞內(nèi)大量表達(dá)，同時也可以大量分泌到發(fā)酵液中；但是tevp蛋白不能在胞內(nèi)有效表達(dá)，推測其被胞內(nèi)蛋白降解，故也不能分泌到發(fā)酵液中；lacz蛋白可能太大(110kda)，亦不能在胞內(nèi)大量表達(dá)，故也不能分泌到發(fā)酵液中。

序列表

sequencelisting

<110>成都美溢德生物技術(shù)有限公司

<120>一種利用芽孢桿菌高效表達(dá)外源蛋白的方法

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<213>人工合成

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