一種在多種昆蟲細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的Ⅱ組甲型桿狀病毒Bacmid及應(yīng)用
【專利說明】一種在多種昆蟲細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的N組甲型桿狀病毒
Bacmid及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在多種昆蟲細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的II組甲型桿狀病毒Bacmid及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]桿狀病毒是桿狀病毒科(Baculoviridae)成員的俗稱，根據(jù)國際病毒分類委員會(ICTV) 2012年公布的第9次報(bào)告，桿狀病毒科分為四個屬，分別是甲型桿狀病毒屬[Alphabaculovirus，為感染鱗翅目昆蟲的核型多角體病毒(Nucleopolyhedrovirus，NPV)]、乙型桿狀病毒屬[Betabaculovirus，為感染鱗翅目昆蟲的顆粒體病毒(Granulovirus, GV)]、丙型桿狀病毒屬(Gammabaculovirus，為感染膜翅目昆蟲的NPV)和丁型桿狀病毒屬(Deltabaculovirus，為感染雙翅目昆蟲的NPV)。根據(jù)病毒膜融合蛋白和DNA多聚酶蛋白序列特征及病毒其他特性，甲型桿狀病毒屬可分為I組和II組。
[0003]桿狀病毒廣泛用于農(nóng)林害蟲的生物防治。同時(shí)桿狀病毒一昆蟲(細(xì)胞)系統(tǒng)還是十分優(yōu)良的真核表達(dá)系統(tǒng)，己用于外源基因、診斷試劑和疫苗等的研究和生產(chǎn)。甘藍(lán)夜蛾多粒包埋核型多角體病毒(Mamestra brassicea multiple nucleopolyhedrovirus,MbMNPV)屬II組甲型桿狀病毒，是一種廣譜桿狀病毒，可防治32種以上鱗翅目害蟲，對重要農(nóng)業(yè)害蟲小菜蛾、棉鈴蟲、甜菜夜蛾、甘藍(lán)夜蛾、地老虎、粘蟲等都具有較好的控制作用。MbMNPV作為殺蟲劑，已獲得農(nóng)藥登記，在國內(nèi)應(yīng)用面積超過1000萬畝。但該病毒的分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究相對滯后，病毒廣譜性的分子機(jī)制研究較少，病毒也存在殺蟲速度較慢的缺陷，其更大范圍應(yīng)用仍受到限制。另外，桿狀病毒作為一種真核表達(dá)系統(tǒng)，不斷提高病毒表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量一直是當(dāng)今生物工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。對桿狀病毒分子生物學(xué)的研究，特別是對病毒基因的結(jié)構(gòu)與功能的研究將有助于揭示病毒的復(fù)制和廣譜侵染機(jī)制，為重組病毒殺蟲劑和快速、高效表達(dá)載體的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
[0004]自1983年Smith和Summers首次報(bào)道利用I組甲型桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)在草地貪夜蛾細(xì)胞系Sf9細(xì)胞中表達(dá)人β -干擾素以來，桿狀病毒表達(dá)載體因其能在昆蟲細(xì)胞和昆蟲幼蟲中高效表達(dá)外源基因，且在大多數(shù)情況下桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有加工和修飾表達(dá)產(chǎn)物的能力，如信號肽的切割、糖基化和磷酸化作用以及大多數(shù)表達(dá)產(chǎn)物具有很高的生物活性等優(yōu)點(diǎn)，使其成為十分重要的真核表達(dá)系統(tǒng)。目前應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)己表達(dá)了幾千種不同來源的外源基因。
[0005]傳統(tǒng)的重組桿狀病毒構(gòu)建需要按以下兩步進(jìn)行:首先，重組桿狀病毒必須將外源基因克隆到轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上，通常多克隆位點(diǎn)位于桿狀病毒的強(qiáng)啟動子控制下。將轉(zhuǎn)移載體同桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)同源重組產(chǎn)生重組病毒，重組率通常在0.1-1%之間。其次，重組桿狀病毒需用空斑法鑒定和純化重組病毒。由于重組病毒的產(chǎn)生率低以及空斑純化法操作復(fù)雜、耗時(shí)，往往需數(shù)月甚至更長的時(shí)間才能構(gòu)建一個完整的重組病毒。鑒于按傳統(tǒng)方法構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)存在上述兩個缺陷，Kuckow發(fā)明了一種快速、有效產(chǎn)生重組桿狀病毒的方法，即Bac-to-Bac系統(tǒng)，在7天內(nèi)就可完成一個重組病毒的構(gòu)建，并進(jìn)行外源基因的高效表達(dá)。該系統(tǒng)由Bacmid和pFastBac供體質(zhì)粒兩部分組成。Bacmid含有一個低拷貝數(shù)的mini_F replicon、一個卡那霉素抗性基因和一個IacZa基因的8.6kb的DNA片段，一個作為細(xì)菌轉(zhuǎn)位子插入位點(diǎn)(mini_attTn7)的短片段插入到IacZa基因N-末端，該片段的插入并不改變IacZa基因的閱讀框。該Bacmid既能在E.coli內(nèi)復(fù)制又可在昆蟲細(xì)胞內(nèi)復(fù)制形成完整的病毒粒子。pFastBac供體質(zhì)粒則是由一個min1-Tn7轉(zhuǎn)位因子組成，在mini_Tn7左右臂之間插入一個慶大霉素抗性基因、一個桿狀病毒特異強(qiáng)啟動子、一個多克隆位點(diǎn)和SV4l3(A)Poly信號序列組成的表達(dá)框。在輔助質(zhì)粒提供的轉(zhuǎn)位酶的作用下，克隆于pFastBac供體質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)的外源基因能轉(zhuǎn)位至Bacmid的mini_attTn7位點(diǎn)上，通過抗生素抗性篩選和藍(lán)白斑篩選鑒定重組Bacmid.隨后從E.coli內(nèi)提取Bacmid DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞進(jìn)行外源基因表達(dá)。該方法具有重組率高、重組病毒篩選方便等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種在多種昆蟲細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的II組甲型桿狀病毒甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒Bacmid(本發(fā)明或稱MbBacmid)。外源蛋白基因可快速插入MbBacmid上，在包括Sf9、Tn368、high five等多種商品化昆蟲細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行高效表達(dá)，同時(shí)可在plO或ph啟動子調(diào)控下表達(dá)回復(fù)的多角體蛋白，在ph或pel強(qiáng)啟動子的調(diào)控下高效表達(dá)+eGFP或其他外源基因。重組病毒既可高效表達(dá)外源蛋白，又可形成病毒多角體，便于快速分析鑒定。本發(fā)明提供MbBacmid進(jìn)行重組病毒研究，獲得新重組病毒只需要7_15天，大大提高了利用重組病毒進(jìn)行病毒基因功能研究的速度，也為構(gòu)建更為高效快速廣譜昆蟲病毒殺蟲劑提供了便捷的途徑。含甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒表達(dá)載體的菌株已于2015年4月8日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名:大腸桿菌DHlOB(Escherichia coliDH10B)/MbBacmid PhP1，保藏編號CCTCC N0:M2015187。地址:中國武漢武漢大學(xué)。用LD培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37攝氏度。
[0007]本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種能在多種商品化昆蟲細(xì)胞上進(jìn)行外源蛋白表達(dá)的II組甲型桿狀病毒甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒Bacmid的應(yīng)用。
[0008]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
[0009]一種能在多種商品化昆蟲細(xì)胞上進(jìn)行外源蛋白表達(dá)的II組甲型桿狀病毒甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒Bacmid，構(gòu)建方式包括以下步驟:
[0010](I)甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒Bacmid轉(zhuǎn)移載體pMbTV的構(gòu)建
[0011]—個含有低拷貝數(shù)的細(xì)菌DNA復(fù)制子(min1-F replicon)、一個卡那霉素抗性基因和一個IacZa基因、一個作為細(xì)菌轉(zhuǎn)位子插入位點(diǎn)(min1-attTn7)的短片段插入到IacZa基因N-末端，形成8.6kb的DNA片段。該片段前面加上甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒多角體蛋白基因上游約2.3kb片段作為上游同源臂，后面加上多角體蛋白基因下游序列約1.3kb作為下游同源臂，構(gòu)成轉(zhuǎn)移載體pMbTV。
[0012](2)甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒表達(dá)載體Mb Bacmid的構(gòu)建
[0013]用pMbTV和甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒粒子DNA共轉(zhuǎn)染棉鈴蟲4齡幼蟲，提取BVDNA,電轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B，挑選單菌落，產(chǎn)生既能在E.coli內(nèi)復(fù)制又可在昆蟲細(xì)胞內(nèi)復(fù)制形成完整病毒粒子的甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒穿梭表達(dá)載體Bacmid。提取不同菌落的Bacmid核酸進(jìn)行BamH 1、EcoR 1、Hind III和Pst I等內(nèi)切酶分析，內(nèi)切酶圖譜與野生型病毒較接近的菌落鑒定為甘藍(lán)夜蛾穿梭表達(dá)載體MbBacmid-al。
[0014]用pMbTV和甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒粒子核酸共轉(zhuǎn)染甜菜4齡幼蟲，提取BV DNA,電轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B，挑選單菌落，產(chǎn)生既能在E.coli內(nèi)復(fù)制又可在昆蟲細(xì)胞內(nèi)復(fù)制形成完整病毒粒子的甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒穿梭表達(dá)載體Bacmid。提取菌落的Bacmid核酸進(jìn)行限制內(nèi)切酶分析，內(nèi)切酶圖譜與野生型病毒較接近的菌落鑒定為甘藍(lán)夜蛾穿梭表達(dá)載體 MbBacmi d_a2。
[0015]按MbBacmid-al和MbBacmid-a2為1:1比例混合轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，收集病毒粒子，提取核酸再轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH10B，產(chǎn)生甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒穿梭表達(dá)載體MbBacmid。提取不同單菌落Bacmid DNA進(jìn)行454全基因組測序，與公布的基因組全序列進(jìn)行比對，基因組序列相一致的菌株鑒定為甘藍(lán)夜蛾穿梭表達(dá)載體MbBacmid。甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒全基因組穿梭表達(dá)載體MbBacmid轉(zhuǎn)化到Eschrichia coli DHlOB株內(nèi)，SP獲得了一株含甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒表達(dá)載體的菌株，甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒全基因組穿梭表達(dá)載體MbBacmid轉(zhuǎn)化到Eschrichia coli DHlOB株內(nèi)，即獲得了一株含甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒表達(dá)載體的菌株，該菌株已于2015年4月8日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名:大腸桿菌DHlOB(Escherichia coli DH10B)/MbBacmid PhP1，保藏編號CCTCC N0:M2015187o地址:中國武漢武漢大學(xué)。
[0016]該菌株的生理生化特性與大腸桿菌DH10B相同。
[0017]甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒全基因組穿梭表達(dá)載體MbBacmid的構(gòu)建是利用同源重組的方法將一個含有低拷貝數(shù)的細(xì)菌DNA-F復(fù)制因子(min1-F r印licon)、一個卡那霉素抗性基因和一個IacZ α基因、一個作為細(xì)菌轉(zhuǎn)位子插入位點(diǎn)(min1-attTn7)的短片段插入到IacZ α基因N-末端的8.5kb的DNA片段置換到甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒基因組多角體蛋白基因位點(diǎn)上，因此，所構(gòu)建的甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒全基因組穿梭表達(dá)載體MbBacm