專利名稱：促進外源蛋白在cho細胞中高效表達的核苷酸序列片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，主要涉及一種來源于CHO細胞的核苷酸序 列。
背景技術(shù)：
按照宿主細胞的類型來分，基因表達系統(tǒng)大致可以分為原核、酵母、植物、昆蟲和 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。與其他系統(tǒng)相比，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋 白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的0型糖基化等多種翻譯后加工功能，因 而，表達產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分 子。在過去的十年間，利用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)高效表達重組蛋白的研究取得了令 人矚目的進展。目前，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)不僅已經(jīng)成為多種基因工程藥物的生產(chǎn)平臺， 而且在新基因功能的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究中也起了極為重要的作用。常用的用于表達重組蛋白的動物細胞有CHO細胞、骨髓瘤細胞(如Sp2/0和 J558L)、COS細胞、293細胞等。CHO細胞即中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary)。 其中CHO和NSO細胞是目前應(yīng)用最多的哺乳動物細胞表達系統(tǒng)細胞。不同的細胞對重組蛋 白的修飾可能會稍有差別，如CHO細胞表達的人白血病抑制因子和人組織因子旁路抑制劑 分別存在N端和C端氨基酸的缺失，而這些改變在另外的一些細胞株中并未出現(xiàn)。真核細胞中，CHO細胞體系是目前重組糖基蛋白生產(chǎn)的首選體系。因為與其他表 達系統(tǒng)相比，它具有許多優(yōu)點①具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達的糖基化藥物蛋白在分 子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有目的產(chǎn)物胞外分泌功 能，便于下游的分離純化；③具有重組基因的高效擴增和表達能力；④具有貼壁生長特性， 又可以進行懸浮培養(yǎng)，且有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，而且表達水平較高；⑤CHO細 胞屬于成纖維細胞(fibroblast)，很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的后分離。但缺 點是CHO細胞培養(yǎng)成本高，條件難掌握，易污染。目前已有越來越多的藥用蛋白在CHO細胞 中獲得了高效表達。外源基因在哺乳動物細胞有兩種不同的表達方式，一種稱為瞬時表達，另一種稱 為穩(wěn)定表達。瞬時表達完全由導(dǎo)入的質(zhì)粒來執(zhí)行，質(zhì)粒并沒有插入到細胞的染色體DNA中， 不存在因為重排和染色體不同部位對導(dǎo)入基因表達的影響。外源基因?qū)氲讲溉閯游锛毎?后1-4天，就可以檢測到基因的表達情況，這種表達是這是由于一部分導(dǎo)入的DNA進入細 胞核后被轉(zhuǎn)錄成mRNA，再進入胞質(zhì)被翻譯的緣故；由于這一方法比較簡單易行，通過選擇 好的表達載體和轉(zhuǎn)染方法，蛋白表達量能達到較高的程度，是研究蛋白結(jié)構(gòu)功能的常用蛋 白表達方法。瞬時表達是暫時的，由于絕大多數(shù)轉(zhuǎn)入的外源基因沒有整合到細胞染色體上 而被降解或隨細胞分裂丟失，因此數(shù)天后，在轉(zhuǎn)染的細胞群中將無法再檢測到外源基因的 表達；也有外源基因在受體細胞中的復(fù)制和表達最終導(dǎo)致細胞的裂解而無法得到永久表達 (如具有SV40復(fù)制起始區(qū)的表達質(zhì)粒在COS細胞中)。因為瞬時表達是由轉(zhuǎn)染效率、質(zhì)粒DNA的質(zhì)量(瞬時轉(zhuǎn)染所用的質(zhì)粒DNA通常是超螺旋的環(huán)狀質(zhì)粒)以及表達水平的不穩(wěn)定 性引起的，所以在具體的實驗中需要很好地控制實驗的條件來縮小實驗批次間的差異。在穩(wěn)定表達中，要使得導(dǎo)入的基因能永久表達，需要導(dǎo)入的DNA能隨細胞的分裂 而復(fù)制，這要求被導(dǎo)入的基因DNA整合到細胞的染色體DNA中，因此需要通過大量篩選來富 集這類細胞，這通常是利用同時導(dǎo)入外源基因和篩選標(biāo)記基因來完成的。這些篩選基因提 供細胞一種藥物的抗性，故可以用相應(yīng)的藥物來篩選和富集外源基因整合的細胞系。在穩(wěn) 定表達中，由于外源基因整合到細胞的染色體上這一過程通常涉及DNA重排，以及受到插 入位點周邊序列的影響，故外源基因在不同的細胞克隆中表達水平差異很大，需要對多個 克隆細 胞進行表達量的鑒定。建立永久表達系主要是用于長期制備或利用某個蛋白。穩(wěn)定 表達有時也能利用一些病毒能長期以附加體形式存在于細胞中的特性來實現(xiàn)，如EB病毒 和牛乳頭瘤病毒。另外，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒相關(guān)病毒可以高效完整地將病毒基因組 DNA插入細胞染色體上也被被用于建立永久的表達細胞系。哺乳動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)是藥用蛋白生產(chǎn)中一個非常重要的平臺。然而，該平臺 的生產(chǎn)還存在著一些缺點，包括蛋白生產(chǎn)的可預(yù)見性差、長期表達的表達量不穩(wěn)定和表達 量不足等。與傳統(tǒng)的小分子藥物的生產(chǎn)相比，治療用蛋白的生產(chǎn)成本非常昂貴，因此，一個 能改善蛋白生產(chǎn)可預(yù)見性、產(chǎn)量和穩(wěn)定性的方法，對哺乳動物細胞大規(guī)模表達外源蛋白是 非常有價值的。導(dǎo)致以上各種問題的一個主要的原因是與染色質(zhì)有關(guān)。染色質(zhì)在基因表達過程中 有著重要的影響。如果導(dǎo)入細胞的外源基因隨機整合進或靠近非親和染色質(zhì)(異染色質(zhì)) 的時候，這個外源基因的表達會被沉默掉。一個解決的辦法是把一些基因組邊界元件加在 外源基因的兩側(cè)，來消除異染色質(zhì)的阻遏作用。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的邊界元件主要有如下幾種核骨架結(jié)合區(qū)(matrix attachment regions, MARs)或稱為染色體支架區(qū)(scaffoldattachment regions, SARs)，座位控制區(qū)(locus control region, LCR)，隔離子(insulator)和抗阻遏子元件 (anti-repressor elements)等。這些元件為大小幾十到幾千個堿基組成的核苷酸序列，對 目的基因的表達提高和抵抗沉默方面有積極的意義。在實際操作過程中，為促進外源基因在動物細胞中高效表達，又不影響目的外源 基因的正常表達，這些邊界元件都被構(gòu)建在質(zhì)粒載體中外源目的基因轉(zhuǎn)錄本的外側(cè)，例如 增強子，經(jīng)常位于轉(zhuǎn)錄本的一側(cè)，而抗阻隔子元件則被構(gòu)建到轉(zhuǎn)錄本的兩側(cè)。另外，為了篩選得到最佳的邊界元件用于動物細胞大規(guī)模生產(chǎn)，對獲得的侯選元 件進行篩選評估，例如抗阻隔子元件的發(fā)現(xiàn)者Kwaks對采用鳥槍法獲得的來源于人骨肉瘤 細胞U20S的基因組中的幾十條候選序列進行研究分析，最后得到能顯著促進外源基因表 達的若干條抗阻遏子元件，大小不超過2100bp，并證明這些元件在鼠與人中有高度同源性， 能促進外源基因在人源和鼠源的細胞中高效表達。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開了一種促進外源蛋白在中國倉鼠卵巢細胞中高效表達的核 苷酸序列，該核苷酸序列見序列表SEQ ID N0. 1。本發(fā)明公開的這種促進外源蛋白在中國倉鼠卵巢細胞中高效表達的核苷酸序列，自行命名為KH序列。KH序列也是一種邊界元件，被應(yīng)用在構(gòu)建入質(zhì)粒載體中外源目的基因表達轉(zhuǎn)錄 本的一側(cè)或兩側(cè)，為首次公開的來源于CHO基因組的能應(yīng)用于促進外源基因表達的邊界元 件。該序列是采用如下方法獲得首先設(shè)計的特異性上下游引物KHF :5，> TGCTTTGAATGTTCAAGTAG < 3和KHR :5’ > GATCTAATGTACATCATGAG < 3'；取培養(yǎng)的CH0-dhfr_細胞約IX IO7個，采用基因組抽提試劑盒獲得CHO基因組，然 后以基因組DNA為模板，采用如下PCR反應(yīng)體系CHO基因組DNA 2ul，dNTP2ul，KHF2ul，KHR 2ul, LA-taqO. 5ul, 10XLA-taq Buffer 2uIjH2O 9. 5ul，總體積 20ul ；以及如下 PCR 反應(yīng)程 序-MV IOmin 之后，94°C 30sec,60°C 30sec，72°C 45sec，共 32 個循環(huán)，最后是 72°C IOmin 等擴增而獲得的。本發(fā)明所公開的核苷酸序列KH，可以在構(gòu)建含外源基因的重組表達質(zhì)粒時，加在 外源基因轉(zhuǎn)錄本的任一側(cè)或兩側(cè)；含有該KH序列的重組真核表達質(zhì)粒，可以轉(zhuǎn)染任何來源 于中國倉鼠的貼壁或懸浮型細胞株，如CH0-K1，CHO/dhfr-，DG44等，并有促進外源基因高 效表達的作用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明將KH序列克隆到不同的表達載體的轉(zhuǎn)錄本兩側(cè)或者一側(cè)，然后再克隆入 相應(yīng)的外源基因，將采用表達不同外源基因的表達載體分別轉(zhuǎn)染CH0-K1，CHO/dhfr-, DG44 等來源于中國倉鼠卵巢細胞的細胞株，經(jīng)檢查相應(yīng)的單克隆細胞形成率、單克隆細胞傳代 穩(wěn)定性、外源基因表達水平等，數(shù)據(jù)顯示加了 KH序列能夠提高外源基因的表達水平以及提 高外源基因的傳代穩(wěn)定性。以下采用具體的實施例對本發(fā)明進一步的詳細說明。


圖1為從CHO細胞基因組中PCR擴增獲得KH序列；第1列PCR產(chǎn)物；第2列DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖2為重組質(zhì)粒載體構(gòu)建圖；圖3為不同質(zhì)量的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染DG44細胞分泌表達FGF2比較；圖4為不同重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-Kl后各單克隆細胞表達外源sPDGFR α -Fc的Q-PCR 結(jié)果示意圖；圖5為重組質(zhì)粒pINKH-sPDGFR α -Fc轉(zhuǎn)染CHO-Kl后部分單克隆細胞表達外源 sPDGF-Fc的免疫印跡結(jié)果。
具體實施例方式以下所述的實施例，其限制性酶切酶購買自大連Takara公司和美國NEB公司， 質(zhì)粒小提試劑盒、DNA切膠回收試劑盒、細胞基因組DNA抽提試劑盒購自廣州OMEGA公司， 去內(nèi)毒素的質(zhì)粒大抽試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司，RNA提取試劑盒及相關(guān)試劑、 One-step RT-PCR試劑盒購自美國QIAGEN公司；細胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基DMEM/F12和新生牛血清、G418均購自美國Gibco公司，F(xiàn)GF2標(biāo)準(zhǔn)品、抗FGF2抗體和抗FC購自美國R&D公司， Dual-LuciferaseReporter Assay System的熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司； 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自美國invitrogen公司。質(zhì)粒pIRESneo3購買自美國Clotech公司，pcDNA3. 1購買自美國invitrogen公 司，pMD 19-T購自大連寶生物公司；細胞株CHO/dhfr-和CHO-Kl購自美國ATCC，細胞株 DG44及其無血清培養(yǎng)基購自美國invitrogen公司。其他常用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。實施例1 :KH序列的獲得和序列鑒定 取培養(yǎng)的CHO細胞約IX IO7個，采用基因組抽提試劑盒獲得CHO基因組，然后 設(shè)計特異性的上游引物KHF :5，> TGCTTTGAATGTTCAAGTAG <3，；和下游引物KHR :5，> GATCTAATGTACATCATGAG < 3'；PCR 反應(yīng)體系為CH0 基因組 DNA 2ul, dNTP2ul, KHF2ul, KHR2ul, LA-taq 0. 5ul, lOXLA-taq Buffer 2ul, H2O 9. 5ul，總體積 20ul ；PCR 反應(yīng)程序為-MV IOmin 之后，94°C 30sec，60°C 30sec，72°C 45sec，共 32 個循 環(huán)，最后是72°C IOmin0 PCR反應(yīng)結(jié)果見圖1。將獲得的PCR產(chǎn)物直接裝入pMD 19-T載體中，進行測序鑒定。測序結(jié)果見SEQ ID N0. 1。實施例2 應(yīng)用KH序列使熒光素酶在CHO/dhfr—細胞中高效表達取pIRESne03質(zhì)粒，將該核苷酸序列插入到外源基因轉(zhuǎn)錄本的上下游和上游，構(gòu) 建出兩個不同的載體，分別命名為PlN-KH和PIN-2KH;然后再將熒光素酶插入到多克隆位 點構(gòu)建為重組表達載體分別命名為ρΙΝ-ΚΗ-Luc和pIN-2KH-Luc，如圖2。另外，再構(gòu)建對照 質(zhì)粒 pIN-Luc。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將pIRESneo3、pIN-Luc、ρIN-KH-Luc 和 pIN-2KH_Luc 分別 轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-細胞，同時按1/10的量轉(zhuǎn)染一內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK轉(zhuǎn)染在24孔細胞培養(yǎng) 板上進行，采用不同的脂質(zhì)體用量和DNA用量，操作方法見美國invitrogen公司提供的 Lipofectamine2000脂質(zhì)體試劑說明書。轉(zhuǎn)染后2天加入G418篩選，每2天更換培養(yǎng)基，培 養(yǎng)2 3周，至肉眼可見單克隆細胞形成的白色聚集物即可，同時計算克隆形成數(shù)。從結(jié)果可 以看出，加入了該序列后，獲得的單克隆數(shù)明顯增加，結(jié)果見表1。表1.抗生素篩選后克隆數(shù)目統(tǒng)計表 將1000 μ g/mlG418篩選的各組的單克隆細胞隨機挑選20個，分別于96孔培養(yǎng)板 中培養(yǎng)，每孔一個單克隆細胞，完全培養(yǎng)基中加入G418的濃度調(diào)整為300ug/ml ；長滿后轉(zhuǎn) 移至24孔板；待長滿后傳代至另一 24孔板，再次長滿后，取一板仍繼續(xù)傳代，另一板則采用 Dual-Luciferase Reporter Assay System檢測試劑盒對熒光素酶活性進行檢測，具體檢 測和計算方法見該試劑盒的說明書，統(tǒng)計各組的表達情況，計算平均值。傳代的24孔板培 養(yǎng)至第10代時，再次采用試劑盒檢測。從結(jié)果可知，加入該序列后，外源基因熒光素酶的表 達是未加該序列的6倍以上，而且有較好的傳代穩(wěn)定性。結(jié)果見表2.表2熒光素酶活性檢測結(jié)果(平均信) * 備注數(shù)據(jù)處理 1 為 pIN-Luc、ρIN-KH-Luc 以及 pIN-2KH_Luc 分別與 pIRESneo3 的原始數(shù)據(jù)的比值；數(shù)據(jù)處理2 為pIN-KH-Luc以及pIN-2KH-Luc分別與pIN-Luc的數(shù)據(jù) 處理1所得的數(shù)據(jù)的比值；實施例3 應(yīng)用KH序列使FGF2在CH0/DG44中高效表達2. 1重組表達載體的構(gòu)建、鑒定與大規(guī)模制備以成纖維細胞生長因子2 (Fibroblast Growth Factor2，F(xiàn)GF2)的核苷酸序列為模 板，PCR擴增FGF2，Nhe I和HindIII雙酶切，取真核表達載體pcDNA3. 1和pcDNA3. 1-KH，采 用Nhe I和HindIII雙酶切，二者采用T4連接酶連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α后，涂 布LB-AMP+平板，37°C 16 18h，篩選挑取3 5個單菌落，于5ml的LB-AMP+中擴培，抽 提質(zhì)粒，采用酶切鑒定和PCR擴增目的序列兩種方法鑒定重組子，并測序鑒定獲得正確的 重組表達載體，分別命名為pcDNA3. 1-FGF2和pcDNA3. 1-KH-FGF2。將重組菌株擴增培養(yǎng)于 IOOml的LB-AMP+培養(yǎng)液中37°C過夜，收集菌體，采用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒大抽試劑盒制備獲得 200ug左右的重組質(zhì)粒 2.2重組子轉(zhuǎn)染CH0/DG44細胞懸浮培養(yǎng)CH0/DG44細胞，細胞存活率> 90 %，離心收集細胞，調(diào)整細胞密度至 1 X 107/ml ；選用4mm的電擊杯，含細胞400 μ L，將去內(nèi)毒素化的重組表達載體按5、10、15、 20、25、30、35和40 μ g分別加入各個電擊杯，每次電擊電壓為280V，電擊時間為20ms，室溫 操作，電擊后將電擊杯置至于冰上5min，之后補加1. 5mL培養(yǎng)基于37°C的5% FBS培養(yǎng)基 貼壁24h后，換液去死細胞，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合率達到8(Γ90%左右，胰酶消化細胞，再重 新懸浮培養(yǎng)于20ml的無血清培養(yǎng)基中，至細胞密度達到7. 5XlOVml左右，細胞活力達到 95%左右，收集上清。2. 3ELISA鑒定外源TOF2的表達以 R&D 公司的 FGF2 作為標(biāo)準(zhǔn)品，將其稀釋為 2000ng/ml，1000ng/ml, 500ng/ml, 250ng/ml，125ng/ml，62. 5ng/ml，31. 3ng/ml 的各 100 μ □依次加入一排 7 孔中，另 1 孔只 加樣品稀釋液的作為零孔，再另一孔留空不加作為TMB空白顯色孔，每個樣設(shè)3個復(fù)孔 ’另 取2. 2中各組的細胞培養(yǎng)上清，離心2000轉(zhuǎn)30min，收集上清，取100 μ □/孔直接加入酶 標(biāo)板，每個樣設(shè)3個復(fù)孔。一酶標(biāo)板加上蓋，置于濕盒中，37°C反應(yīng)90分鐘或者4°C過夜一甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體，再對著吸水紙拍幾下，0. 1 % Tween20-PBS洗3次一加入10A BSA的PBS 室溫封閉lh，之后0.1 % Tween20-PBS洗3次一加入效價為1 5000的抗Fc抗體，工作液 按每孔0. Iml依次加入，(TMB空白顯色孔除外)，37°C反應(yīng)2h，之后0. 1% Tween20-PBS洗 3飛次一按每孔IOOul依次加入TMB顯色液，室溫慢搖至顯色，加入2M的H2S04終止液終止 反應(yīng)一用酶標(biāo)儀在450nm波長測定0. D.值。通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白的已知濃度系列稀釋，測出OD值后繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 可推算出TOF2的含量。表3. DG44培養(yǎng)基上清中分泌表達的FGF2含量(ng/ml) 實施例4 應(yīng)用KH序列使PDGFR- □融合蛋白在CHO-Kl中高效表達3. 1重組表達載體的構(gòu)建與鑒定以可溶性血小板衍生因子膜外區(qū)并融合了人Fc蛋白(sPDGFRa -Fe)的核苷酸序 列為模板，PCR擴增sPDGFR α -Fe, Nhe I和BglII雙酶切，取真核表達載體pIRES_Neo3禾口 pIN-KH，采用Nhe I和BamHI (與BglII同為同尾酶)雙酶切，二者連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5 α后，涂布LB-AMP+平板，37°C 16 18h，篩選挑取3 5個單菌落，于5ml的LB-AMP+ 中擴培，抽提質(zhì)粒，采用酶切鑒定和PCR擴增目的序列兩種方法鑒定重組子，并測序鑒定獲 得正確的重組表達載體，分別命名為pIN-sPDGFRa -Fc和pIN-KH-sPDGFRa -Fe。3. 2重組子轉(zhuǎn)染CHO-Kl細胞將CHO-Kl細胞鋪板培養(yǎng)于6孔板(完全培養(yǎng)基為含10%小牛血清的DF12)，當(dāng) 細胞匯合度為70%時，將去內(nèi)毒素化的重組表達載體按每孔8ugDNA/8ul陽離子脂質(zhì)體 (Lipofectamine TM 2000)轉(zhuǎn)染細胞，于不加血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，更換成完全培養(yǎng) 基，再24tT48h后加篩選抗生素G418 (700ug -ml-1)，2周后可見到明顯單克隆細胞團，逐個 挑取到96孔板培養(yǎng)，此時，將G418濃度降為500ug ·πι1-1，待細胞長滿后，依次放大到24孔 板和細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。3. 3總RNA的提取與RT-PCR鑒定陽性單克隆細胞Trizol 法提取總 RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為65°C 5min,30°C 10min,42°C 60min, 72°C IOmin0 PCR 反應(yīng)條件為預(yù)變性 95°C 5min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 20s，32 個循環(huán)； 72°C延伸lOmin。0. 8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶。3. 4Real-Time PCR檢測各陽性單克隆細胞表達目的基因的差異反應(yīng)體系為模板cDNA 2ul，上游引物(IOpmol · L_1)0. 8ul，下游引物 (IOpmol · L-1) 0. 8ul, Real-Time PCR MIX IOul，雙蒸水 6. 4ul。反應(yīng)條件為:95°C IOmin ；95°C 10s,60°C 20s, 72°C 30s, 32個循環(huán)。溶解曲線分析溫度55°C _95°C，每分鐘讀一次， 每個樣設(shè)置3個復(fù)孔，取均值，數(shù)值越低，則表示表達量越高。不同重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-Kl后 各單克隆細胞表達外源sPDGFRa -Fc的Q-PCR結(jié)果如圖4所示。表4不同重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-Kl后各單克隆細胞表達外源sPDGFRa -Fc的Q-PCR
結(jié)果 * 備注數(shù)據(jù)處理采用□ CT = CT 值(sPDGFR a -Fe) -CT 值(18S rRNA)，18SrRNA 內(nèi)參校正cDNA加樣量的誤差。3. 5ffestern blot鑒定pINKH-sPDGF-Fc轉(zhuǎn)染獲得的重組單克隆細胞株的目的蛋 白表達去編號Bl至B5的單克隆細胞培養(yǎng)，細胞密度到100%后，裂解細胞，收集裂解液， 并對其進行蛋白定量。12% SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉，分別用抗Fc的單克隆 抗體(1 10000)及β-actina 10000)抗體4°C孵育過夜，相應(yīng)二抗為羊抗鼠-HRP抗 體(1 1000)，加入ECL化學(xué)試劑于暗盒中X光膠片曝光檢測。結(jié)果顯示，B2的sPDGF-Fc表達最高，B5的最低，其結(jié)果與3. 4中Realtime PCR 的結(jié)果相符，也同時說明Realtime PCR的結(jié)果能夠反映外源基因的蛋白表達量的情況， 故結(jié)合圖4和表4結(jié)果可知，應(yīng)用pINKH-sPDGF-Fc轉(zhuǎn)染獲得的重組單克隆細胞株較 pIN-sPDGF-Fc轉(zhuǎn)染獲得的重組單克隆細胞株從整體評估可知表達量較高，故該序列能夠有 效提高外源sPDGF-Fc的表達。重組質(zhì)粒pINKH-sPDGFR α -Fc轉(zhuǎn)染CHO-Kl后部分單克隆細 胞表達外源sPDGF-Fc的免疫印跡結(jié)果如圖5所示。Untitled_ST25SEQUENCE LISTING<110>暨南大學(xué)<120>促進外源蛋白在CHO細胞中高效表達的核苷酸序列片段<130><160>1<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>532<212>DNA<213>CH0 細胞
<400>1
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促進外源蛋白在CHO細胞中高效表達的核苷酸序列片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.含有權(quán)利要求1所述核苷酸序列片段的重組質(zhì)粒表達載體。
3.由權(quán)利要求2所述重組質(zhì)粒表達載體而得的重組微生物。
全文摘要
促進外源蛋白在CHO細胞中高效表達的核苷酸序列片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明將KH序列克隆到不同的表達載體的轉(zhuǎn)錄本兩側(cè)或者一側(cè)，然后再克隆如相應(yīng)的外源基因，將采用表達不同外源基因的表達載體分別轉(zhuǎn)染CHO-K1，CHO/dhfr-，DG44等細胞，經(jīng)檢查相應(yīng)的單克隆細胞形成率、單克隆細胞傳代穩(wěn)定性、外源基因表達水平等，數(shù)據(jù)顯示加了KH序列的載體能夠提高外源基因的表達水平以及提高外源基因的傳代穩(wěn)定性。
文檔編號C12N1/00GK101838646SQ20091021398
公開日2010年9月22日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日
發(fā)明者洪岸, 陳小佳 申請人:暨南大學(xué)