專利名稱：一種在細(xì)胞表面展示外源蛋白的方法及產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種在細(xì)胞表面展示外源蛋白
的方法及產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，具有某些功能活性的蛋白被越來越多地應(yīng)用于各領(lǐng) 域。然而，蛋白作為有生物活性的物質(zhì)，其本身極易于失活，穩(wěn)定性差，保存很困難，且難以 回收利用。并且，盡管目前蛋白的大規(guī)模重組制備已經(jīng)變得可能，然而表達(dá)后的蛋白的分離 和提純還存在諸多的困難，純化步驟復(fù)雜。因此本領(lǐng)域人員致力于尋找提高蛋白的穩(wěn)定性， 簡化蛋白的純化，固定化蛋白以及使得蛋白回收利用的方法。 此外，作為一種具體的例子，有機(jī)磷或氨基甲酸酯類殺蟲劑是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用 的一類農(nóng)藥，因其具有種類多樣、殺蟲譜廣、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上被廣泛使用，為 糧食豐產(chǎn)和農(nóng)業(yè)發(fā)展提供保證。但由于農(nóng)藥的不合理使用，許多食品中有機(jī)磷或氨基甲酸 酯類農(nóng)藥殘留超標(biāo)，導(dǎo)致急性中毒事件時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康和農(nóng)產(chǎn)品在 國際市場的競爭力，目前已經(jīng)引起了各國政府和社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。目前常用的有機(jī)磷 或氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測方法有免疫學(xué)檢測方法和酶抑制法。傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測技術(shù)因其 抗體特異性，不能同時(shí)檢測多種不同種類的農(nóng)藥，在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。而酶抑制法主要 利用了乙酰膽堿酯酶對(duì)有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性，具有簡便、靈敏等優(yōu)勢，成為 應(yīng)用較為普遍的農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)。乙酰膽堿酯酶能夠?qū)Ｒ恍缘谋挥袡C(jī)磷或氨基甲酸 酯類農(nóng)藥抑制，但游離形式的乙酰膽堿酯酶穩(wěn)定性差，極易失活，并且其來源有限，純化過 程復(fù)雜，這些都大大地限制了其在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。因此，本領(lǐng)域需要找到更為有效的獲 得和利用乙酰膽堿酯酶的方法，特別是提供乙酰膽堿酯酶穩(wěn)定性，簡化乙酰膽堿酯酶純化 技術(shù)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基因構(gòu)建物，所述的基因構(gòu)建物在被導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募?xì)胞 后可在細(xì)胞表面表達(dá)外源蛋白。 本發(fā)明的另一目的在于提供一種細(xì)胞，所述的細(xì)胞表面展示有外源蛋白。 在本發(fā)明的第一方面，提供一種基因構(gòu)建物，所述基因構(gòu)建物從5'到3'依次包括
以下操作性相連的元件 (a)葡萄糖淀粉酶信號(hào)肽編碼序列；
(b)外源蛋白的編碼序列；禾口 (c)酵母a凝集素基因C端錨定信號(hào)的編碼序列。 在另一優(yōu)選例中，所述的外源蛋白選自(但不限于)受體蛋白、配體蛋白、酶蛋白 或抗體蛋白等。 在另一優(yōu)選例中，所述的外源蛋白是長度是20-1200aa;較佳的是50-1000aa ;更
3佳的是80-800aa，如約lOOaa， 200aa， 300aa， 500aa， 700aa。
在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物中，外源蛋白是乙酰膽堿酯酶。 在另一優(yōu)選例中，所述的乙酰膽堿酯酶是不帶信號(hào)肽和錨定信號(hào)的乙酰膽堿酯 酶。 在另一優(yōu)選例中，所述的葡萄糖淀粉酶信號(hào)肽編碼序列是SEQ ID NO:l所示序列 中第1-75位的序列；或 所述的乙酰膽堿酯酶編碼序列是SEQ ID NO :1所示序列中第76-1824位的序列； 或 所述的酵母a凝集素基因C端錨定信號(hào)的編碼序列是SEQ ID NO :1所示序列中 第1858-2817位的序列。 在另一優(yōu)選例中，在元件(b)和元件(c)之間，包括一標(biāo)簽蛋白編碼序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽蛋白是Flag蛋白。 在另一優(yōu)選例中，所述的元件(a) 、 (b)和(c)之間包括或不包括連接肽編碼序列，
所述的連接肽具有l(wèi)-15aa ;較佳地具有l(wèi)-10aa ;更佳地具有1-5aa。 在另一優(yōu)選例中，所述的乙酰膽堿酯酶是黑腹果蠅乙酰膽堿酯酶。 在另一優(yōu)選例中，所述的基因構(gòu)建物具有SEQ ID NO :1所示的序列。 在本發(fā)明的二方面，提供一種重組的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有所述的基因構(gòu)建物。 在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體的骨架質(zhì)粒是pYES-DEST52。 在本發(fā)明的第三方面，提供一種細(xì)胞，所述的細(xì)胞是酵母細(xì)胞，所述細(xì)胞中含有所
述的表達(dá)載體；或其基因組中整合有所述的基因構(gòu)建物。 在另一優(yōu)選例中，所述的酵母細(xì)胞選自釀酒酵母或畢赤酵母。 在另一優(yōu)選例中，所述的基因構(gòu)建物中，外源蛋白的編碼序列是乙酰膽堿酯酶的 編碼序列。 在另一優(yōu)選例中，所述的酵母細(xì)胞是釀酒酵母細(xì)胞，其表面上展示表達(dá)有乙酰膽 堿酯酶。 在本發(fā)明的第四方面，提供一種在細(xì)胞表面展示表達(dá)外源蛋白的方法，所述方法 包括 (i)將所述的基因構(gòu)建物導(dǎo)入到酵母細(xì)胞中，獲得重組細(xì)胞；
(ii)培養(yǎng)(i)的重組細(xì)胞，從而在細(xì)胞表面展示表達(dá)外源蛋白。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(i)中，所述的基因構(gòu)建物中，外源蛋白的編碼序列是
乙酰膽堿酯酶的編碼序列；從而在步驟(ii)中，在細(xì)胞表面展示乙酰膽堿酯酶。 在本發(fā)明的第五方面，提供一種檢測待測樣品中有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的試
劑盒，所述試劑盒中包括 細(xì)胞，所述的細(xì)胞中帶有一基因構(gòu)建物，所述的基因構(gòu)建物中外源蛋白的編碼序 列是乙酰膽堿酯酶的編碼序列；或 固相載體，以及吸附或包埋在固相載體中的細(xì)胞，所述的細(xì)胞中帶有一基因構(gòu)建
物，所述的基因構(gòu)建物中外源蛋白的編碼序列是乙酰膽堿酯酶的編碼序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括(但不限于)磷酸膽堿酯酶的底物(如乙酰膽堿或碘化乙酰膽堿)，顯色劑(如DTNB)，微量滴定板(如96孔板)，使用說明書。
在本發(fā)明的第六方面，提供一種檢測待測樣品中有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方 法，所述方法包括 (1)將細(xì)胞固定于固相載體或懸浮于與所述細(xì)胞相容性的介質(zhì)中，形成檢測體系； 所述的細(xì)胞中帶有一基因構(gòu)建物，所述的基因構(gòu)建物中外源蛋白的編碼序列是乙酰膽堿 酯酶的編碼序列； (2)在(1)的檢測體系中加入待測樣品，混合；禾口 (3)檢測(2)的體系中乙酰膽堿酯酶的活性，從而確定待測樣品中是否含有有機(jī) 磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥或其含量。 在另一優(yōu)選例中，在步驟(3)中，包括向步驟(2)的檢測體系中加入乙酰膽堿酯 酶的底物，通過檢測乙酰膽堿酯酶對(duì)底物的水解情況確定待測樣品中是否含有有機(jī)磷或氨 基甲酸酯類農(nóng)藥或其含量。 在另一優(yōu)選例中，所述的乙酰膽堿酯酶的底物是乙酰膽堿(ATch)，或碘化乙酰膽 堿(AtchI)。 在另一優(yōu)選例中，在步驟(2)中，還包括設(shè)置對(duì)照體系，所述的對(duì)照體系中不加 入待測樣品；步驟(3)中，還包括將檢測體系中乙酰膽堿酯酶活性與對(duì)照體系中乙酰膽堿 酯酶活性比較；若檢測體系中乙酰膽堿酯酶活性顯著降低(如降低10%，優(yōu)選降低20%;更 優(yōu)選降低40%或更低)；則表明待測樣品中含有有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥(定性方法)。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖l.pYES-S-AChE-fag-Aga重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程和圖譜。 圖2.載體pYES-S-AchE-f lag-Ag a酶切鑒定，其中 泳道M :DNA Marker,由HindIII、 BamHI和EcoRI消化的入DNA ; 泳道1 :由PvuII和BglII酶消化的pYES-S-AchE-f lag-Ag a 。 圖3.乙酰膽堿脂酶酶活力的測定，其中 圖3A.空白對(duì)照酵母反應(yīng)體系酶活力測定； 圖3B.未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化子酵母反應(yīng)體系酶活力測定； 圖3C.誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)化子酵母反應(yīng)體系酶活力測定。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次設(shè)計(jì)得到一種基因構(gòu)建物，所述的基因構(gòu)建物在 導(dǎo)入到細(xì)胞中后，可使得重組表達(dá)的細(xì)胞表面展示表達(dá)外源蛋白(如乙酰膽堿酯酶)，且外 源蛋白在細(xì)胞表面上的展示表達(dá)效果特別優(yōu)異，可保留良好的蛋白活性。采用本發(fā)明的基 因構(gòu)建物以及表達(dá)系統(tǒng)，可方便地實(shí)現(xiàn)外源蛋白的固定化，并可簡化蛋白純化的繁瑣步驟。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在細(xì)胞表面展示表達(dá)乙酰膽堿酯酶，可直接利用所述表 面展示有乙酰膽堿酯酶的細(xì)胞來檢測待測樣品中有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在與否 或存在量。與采用游離形式的乙酰膽堿酯酶檢測相比，展示在細(xì)胞表面的乙酰膽堿酯酶性
5質(zhì)更為穩(wěn)定，且無需繁瑣的純化過程即可使用，有效地簡化了檢測步驟，提高了檢測準(zhǔn)確 性。 如本文所用，所述的"操作性相連"或"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA 序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動(dòng)子控 制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。 如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......構(gòu)
成"、"基本上由......構(gòu)成"、和"由......構(gòu)成"；"主要由......構(gòu)成"、"基本上
由......構(gòu)成"和"由......構(gòu)成"屬于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。 構(gòu)建物 為了能夠?qū)崿F(xiàn)將外源蛋白展示在酵母細(xì)胞表面的目的，本發(fā)明人曾經(jīng)嘗試了多種 基因構(gòu)建方法，最后獲得了最佳的基因構(gòu)建物，從而實(shí)現(xiàn)外源蛋白的良好展示表達(dá)。因此， 本發(fā)明提供了一種基因構(gòu)建物，所述構(gòu)建物從5'到3'依次包括以下操作性相連的元件 (a)葡萄糖淀粉酶信號(hào)肽編碼序列；(b)外源蛋白的編碼序列；和(c)酵母a凝集素基因C 端錨定信號(hào)的編碼序列。 所述的構(gòu)建物編碼的融合蛋白中，以葡萄糖淀粉酶信號(hào)肽作為外源蛋白的信號(hào) 肽。本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖淀粉酶信號(hào)肽具有良好的細(xì)胞表面定位效果，可良好地指 導(dǎo)胞質(zhì)中表達(dá)的外源蛋白穿過細(xì)胞壁，最終展示在酵母細(xì)胞的表面。作為本發(fā)明的優(yōu)選方 式，所述的葡萄糖淀粉酶信號(hào)肽編碼序列是SEQID N0:l中第l-75位的序列；或其簡并的序 列或其變異體，只要所述的變異體編碼的蛋白也保留有葡萄糖淀粉酶信號(hào)肽的全部或部分 (至少50%以上，優(yōu)選至少80%以上)活性或功能。 所述的構(gòu)建物編碼的融合蛋白中，以酵母a凝集素基因C端錨定信號(hào)作為外源蛋 白的錨定信號(hào)。當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，酵母a凝集素基因C端錨定信號(hào)具有非常優(yōu)異的蛋白錨 定效果，使得外源蛋白良好地、穩(wěn)定地錨定在細(xì)胞表面，且保持良好的蛋白活性。作為本發(fā) 明的優(yōu)選方式，所述的酵母a凝集素基因C端錨定信號(hào)的編碼序列是SEQ ID N0:1中第 1858-2817位的序列；或其簡并的序列或其變異體，只要所述的變異體編碼的蛋白也保留 有酵母a凝集素基因C端錨定信號(hào)的全部或部分(至少50%以上，優(yōu)選至少80%以上) 活性或功能。 如本文所用，所述的"外源蛋白"可以是多種需要展示表達(dá)的蛋白，例如，所述的外 源蛋白可以是(但不限于)受體蛋白、配體蛋白、酶蛋白或抗體蛋白等。其它類型的蛋白 也是可用的。 所述的受體類蛋白例如是核受體，如孤兒核受體、類固醇受體等等。將受體類蛋白 或受體類蛋白的配體結(jié)合區(qū)展示表達(dá)在細(xì)胞表面，從而獲得重組細(xì)胞，所述的重組細(xì)胞可 應(yīng)用于藥物篩選等領(lǐng)域，例如用于篩選與該受體相匹配的配體。 所述的酶蛋白例如是乙酰膽堿酯酶、蛋白激酶等。將酶蛋白展示表達(dá)在細(xì)胞表面， 從而獲得重組細(xì)胞，所述的重組細(xì)胞可應(yīng)用于酶催化反應(yīng)領(lǐng)域。有利于保持酶蛋白的生物 活性，以及有利于酶的固定化以及酶的回收利用。 本發(fā)明的基因構(gòu)建物的各元件是操作性相連的。所述的各元件之間可以直接相 連，或者也可包括適當(dāng)?shù)拈g隔序列，例如具有卜45bp的連接序列；較佳地具有l(wèi)-30bp的連 接序列；更佳地具有l(wèi)-15bp的連接序列。所述的連接序列例如是酶切位點(diǎn)，或者是標(biāo)簽蛋白編碼序列。 本發(fā)明還包括含有所述構(gòu)建物的重組表達(dá)載體，任何適用于酵母細(xì)胞表達(dá)的表達(dá) 載體可用于制備本發(fā)明的表達(dá)載體，只要其能在酵母細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定。表達(dá)載體的一個(gè) 重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。作為本發(fā)明的優(yōu)選方 式，所述的表達(dá)載體選自(但不限于):pYSE-DEST52(Invitrogen)， pPIC9K(Invitrogen) 等。將構(gòu)建物克隆入表達(dá)載體以構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法也是本領(lǐng)域人員已知的。
含有乙酰膽堿酯酶編碼序列的構(gòu)建物 作為本發(fā)明特別優(yōu)選的方式，所述的外源蛋白是一種酶蛋白。更優(yōu)選的，所述的酶 蛋白是乙酰膽堿酯酶。 所述的乙酰膽堿酯酶是本領(lǐng)域人員熟知的蛋白，其編碼基因也是本領(lǐng)域熟知的。 任何一種乙酰膽堿酯酶蛋白的生物活性片段的編碼序列都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里， 乙酰膽堿酯酶蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種蛋白片段，其仍然能保持完整的乙 酰膽堿酯酶蛋白的全部或部分功能(如至少80%的活性，更佳的至少90%的活性)。氨基 酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的乙酰膽堿酯酶蛋白及其編 碼基因也可應(yīng)用于本發(fā)明中。所述的經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形 成的乙酰膽堿酯酶蛋白也具有乙酰膽堿酯酶蛋白的全部或部分功能。 乙酰膽堿酯酶及其編碼基因的來源比較廣泛，例如可以分離自蠅、魚腦、哺乳動(dòng)物 血液等。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的乙酰膽堿酯酶是黑腹果蠅乙酰膽堿酯酶。所 述的乙酰膽堿酯酶的氨基酸序列可以與GenBank登錄號(hào)為NM_057605所示的序列基本上相 同。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的乙酰膽堿酯酶不帶有其自身的信號(hào)肽和錨定信 號(hào)，其編碼序列具有SEQ ID N0 :1中第76-1824位的序列。 所述的構(gòu)建物編碼的融合蛋白中，以葡萄糖淀粉酶信號(hào)肽代替了乙酰膽堿酯酶自 帶的信號(hào)肽。本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖淀粉酶信號(hào)肽比乙酰膽堿酯酶自帶的信號(hào)肽具 有更好的細(xì)胞表面定位效果，葡萄糖淀粉酶信號(hào)肽可良好地指導(dǎo)胞質(zhì)中表達(dá)的乙酰膽堿酯 酶蛋白穿過細(xì)胞壁，最終展示在酵母細(xì)胞的表面。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的葡萄糖淀 粉酶信號(hào)肽非編碼序列是SEQ IDN0 :1中第1-75位的序列。 所述的構(gòu)建物編碼的融合蛋白中，以酵母a凝集素基因C端錨定信號(hào)代替了乙 酰膽堿酯酶自帶的錨定信號(hào)。酵母a凝集素基因C端錨定信號(hào)具有更優(yōu)異的蛋白錨定 效果，使得乙酰膽堿酯酶良好地、穩(wěn)定地錨定在細(xì)胞表面，且保持良好的酶活性。作為本發(fā) 明的優(yōu)選方式，所述的酵母a凝集素基因C端錨定信號(hào)的編碼序列是SEQ ID N0:1中第 1858-2817位的序列。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在乙酰膽堿酯酶與酵母a凝集素基因C端錨定信號(hào)之 間，還包括一標(biāo)簽蛋白編碼序列，從而在翻譯表達(dá)后有利于融合蛋白的檢測。優(yōu)選的是一些 氨基酸序列較短的標(biāo)簽蛋白，所述的標(biāo)簽蛋白例如是Flag蛋白，其具有SEQ ID N0:1中第 1825-1848位所示的編碼序列。例如，可以采用抗所述標(biāo)簽蛋白的抗體(如anti-Flag)來 檢測蛋白的表達(dá)情況；或者，可以采用抗所述標(biāo)簽蛋白的抗體來純化蛋白或展示所述蛋白 的細(xì)胞。
細(xì)胞
本發(fā)明還提供了一種重組的細(xì)胞，所述的細(xì)胞是酵母細(xì)胞，所述細(xì)胞中含有所述 的表達(dá)載體，或其基因組中整合有所述的基因構(gòu)建物。優(yōu)選地，所述的酵母細(xì)胞選自釀酒 酵母、畢赤酵母。所述的細(xì)胞的表面上可穩(wěn)定地展示表達(dá)外源蛋白，從而可直接用于所述外 源蛋白相關(guān)的應(yīng)用，如用于篩選藥物或藥物發(fā)揮催化作用等等。 本發(fā)明所述的在細(xì)胞表面展示表達(dá)外源蛋白的方法主要包括(i)將本發(fā)明的基 因構(gòu)建物導(dǎo)入到酵母細(xì)胞中，獲得重組細(xì)胞；(ii)培養(yǎng)(i)的重組細(xì)胞，從而在細(xì)胞表面展 示表達(dá)外源蛋白。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細(xì)胞的表面上可穩(wěn)定地展示表達(dá)乙酰膽堿酯酶， 從而可用于檢測待測樣品中的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，同時(shí)還可用于乙酰膽堿酯酶相 關(guān)的環(huán)保、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、軍事等領(lǐng)域。在酶活性水平上，本發(fā)明制備的酵母細(xì)胞表面展示的乙 酰膽堿酯酶的酶活力檢測與市面購買的成品酶粉的參比試驗(yàn)表明，本發(fā)明的酵母細(xì)胞表面 的乙酰膽堿酯酶活力很高，達(dá)到3. 06 ii mol/min mL，完全可達(dá)到或超過市面購買的成品酶 粉的酶活力水平。 將基因構(gòu)建物引入到宿主細(xì)胞內(nèi)的方法是本領(lǐng)域已知的，例如可采用選自以下的 方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等?？赏ㄟ^抗性標(biāo)記 來篩選引入了基因構(gòu)建物的重組細(xì)胞。 獲得的重組細(xì)胞可以采用常規(guī)的酵母細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)，在適于宿主細(xì)胞生長的 條件下進(jìn)行培養(yǎng)。可根據(jù)培養(yǎng)的規(guī)模適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)培養(yǎng)的條件，使之良好地表達(dá)蛋白。
所述的重組細(xì)胞可以被置于溶液中，制成細(xì)胞懸浮液使用。更優(yōu)選的，所述的重組 細(xì)胞可被固定化在固相載體中，從而便于穩(wěn)定地使用，以及便于細(xì)胞的回收和重復(fù)利用?？?通過固定細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外源蛋白(如酶)的固定化，避免了游離蛋白的性質(zhì)不穩(wěn)定、極易失活、 不能重復(fù)使用的缺點(diǎn)，從而使得相應(yīng)的外源蛋白可以更好地得到應(yīng)用。 固定化細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如可以采用選自(但不限于)以下的 技術(shù)(l)吸附法(包括物理吸附法，離子結(jié)合法等)；(2)包埋法(如海藻酸鈉凝膠固定化 細(xì)胞法)；(3)共價(jià)交聯(lián)法。對(duì)于酵母細(xì)胞而言，一種可選的固定方法是包埋法，其是將細(xì)胞 均勻地包埋在水不溶性載體的緊密結(jié)構(gòu)中，細(xì)胞不會(huì)漏出而底物和產(chǎn)物可以進(jìn)入和滲出。 細(xì)胞和載體不起任何結(jié)合反應(yīng)，細(xì)胞處于最佳生理狀態(tài)。因此，酶的穩(wěn)定性高，活力持久。
細(xì)胞固定化常用材料(或稱為固相載體)例如可選自(但不限于)(l)多糖類 (纖維素、瓊脂、葡聚糖凝膠、藻酸鈣、K-角叉膠、DEAE-纖維素等)；(2)蛋白質(zhì)(骨膠原、明 膠等)；(3)無機(jī)載體(氧化鋁、活性炭、陶瓷、磁鐵、二氧化硅、高嶺土、磷酸鈣凝膠等)；(4) 合成載體(聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、酚醛樹脂等)。 對(duì)于酵母細(xì)胞而言，優(yōu)選地可以采用海藻酸鈉來實(shí)現(xiàn)固定?？蓪⒔湍讣?xì)胞與海藻 酸鈉混合，然后將混合液滴入氯化鈣溶液中，使藻酸鈉轉(zhuǎn)變?yōu)樗蝗艿脑逅徕}凝膠，由此將 包埋在其中，這種固定方法是本領(lǐng)域人員已知的。
試劑盒 本發(fā)明還提供了一種檢測待測樣品中有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的試劑盒，所述 試劑盒中包括本發(fā)明所述的表面展示表達(dá)有乙酰膽堿酯酶的細(xì)胞(或細(xì)胞培養(yǎng)物)?；?者，所述的試劑盒中含有固相載體，以及吸附或包埋在固相載體中的表面展示表達(dá)有乙酰 膽堿酯酶的細(xì)胞。
8
此外，所述的試劑盒中還可包括用于分析酶活性的試劑，包括磷酸膽堿酯酶的底 物(如乙酰膽堿或碘化乙酰膽堿)，顯色劑(如DTNB)，微量滴定板(如96孔板)，以及使用 說明書等。 此外，當(dāng)需要時(shí)，所述的試劑盒中還可包括用于稀釋樣品的試劑；或用于培養(yǎng)細(xì)胞 的培養(yǎng)基。 此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書等，用于指導(dǎo)檢測人員正確地使用或 操作。 有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測方法 所述的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測方法基于以下原理乙酰膽堿酯酶能夠 專一性的被有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制，且其抑制率與農(nóng)藥的濃度成正比關(guān)系。因此 通過檢測樣品是否使乙酰膽堿酯酶活性發(fā)生變化，可快速檢測樣品中有機(jī)磷或氨基甲酸酯 類農(nóng)藥的殘留情況。乙酰膽堿酯酶的酶活性可以通過其與底物的反應(yīng)情況來確定。
因此，本發(fā)明提供一種檢測待測樣品中有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法，所述 方法包括(l)將本發(fā)明所述的表面展示表達(dá)有乙酰膽堿酯酶的細(xì)胞固定于固相載體或懸 浮于與所述細(xì)胞相容性的介質(zhì)中，形成檢測體系；(2)在(1)的檢測體系中加入待測樣品， 混合；和(3)檢測(2)的體系中乙酰膽堿酯酶的活性，從而確定待測樣品中是否含有有機(jī)磷 或氨基甲酸酯類農(nóng)藥或其含量。 乙酰膽堿酯酶的酶活性的測定是本領(lǐng)域人員已知的技術(shù)。乙酰膽堿酯酶可催化神
經(jīng)傳導(dǎo)代謝產(chǎn)物(如乙酰膽堿)水解，其水解產(chǎn)物可與顯色劑(如二硫代二硝基苯甲酸，
DTNB)反應(yīng)，產(chǎn)生顯色物質(zhì)(DTNB可顯示黃色)，用分光光度計(jì)測定吸光度隨時(shí)間的變化值，
計(jì)算出抑制率，通過抑制率可以判定出產(chǎn)品中是否存在有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥以及存
在量。優(yōu)選地，可通過設(shè)置對(duì)照體系來更準(zhǔn)確地反映酶活性的變化情況。 所述的"與所述細(xì)胞相容性的介質(zhì)"是指對(duì)所述細(xì)胞以及細(xì)胞表面展示的酶均不
產(chǎn)生影響，且對(duì)于有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥與乙酰膽堿酯酶的相互作用以及乙酰膽堿酯
酶與其底物的相互作用不產(chǎn)生影響的介質(zhì)。所述的介質(zhì)例如可以是適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)緩沖液，如
磷酸鈉緩沖液。 經(jīng)過實(shí)施例驗(yàn)證，細(xì)胞表面展示有乙酰膽堿酯酶的細(xì)胞檢測體系當(dāng)應(yīng)用于農(nóng)藥檢 測時(shí)，對(duì)于許多種有機(jī)磷類以及氨基甲酸酯類農(nóng)藥均具有非常靈敏的檢測效果，特別是對(duì) 于殘殺威、速滅威、呋喃丹等農(nóng)藥，半抑制濃度(IC50)最高達(dá)到了 0. 00073 iig/mL。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于 (1)本發(fā)明找到了可良好地使外源蛋白展示表達(dá)在酵母細(xì)胞表面的方法，利用酵 母作為外源蛋白的表達(dá)宿主；采用本發(fā)明的方法和系統(tǒng)，外源蛋白在細(xì)胞表面上的展示表 達(dá)效果特別優(yōu)異，可保留良好的蛋白活性，可方便地實(shí)現(xiàn)外源蛋白的固定化，并可簡化蛋白 純化的繁瑣步驟。 (2)本發(fā)明在酵母表面表達(dá)乙酰膽堿酯酶，可以使得攜帶乙酰膽堿酯酶的重組細(xì) 胞直接與農(nóng)藥發(fā)生相互作用，避免了過往從生物體或分泌液中分離純化乙酰膽堿酶的復(fù)雜 程序，生產(chǎn)工藝大為簡便，成本降低。 (3)在酵母表面表達(dá)乙酰膽堿酯酶，可通過固定酵母，實(shí)現(xiàn)酶的固定化，避免了游 離酶的性質(zhì)不穩(wěn)定，極易失活，不能重復(fù)使用的缺點(diǎn)，從而可以將其開發(fā)為傳感器等更加靈敏和自動(dòng)化的農(nóng)藥殘留檢測設(shè)備。 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York : Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。 實(shí)施例l.乙酰膽堿脂酶融合蛋白酵母真核表達(dá)載體構(gòu)建 乙酰膽堿脂酶(AChE)基因全長1947bp (參見GenBank登錄號(hào)NM_057605)，可編碼649個(gè)氨基酸(參見GenBank登錄號(hào)NP_476953)，該酶蛋白序列N端含有信號(hào)肽序列(l-38aa)，其C端含有GPI錨定信號(hào)(620_649aa)。 為了使乙酰膽堿脂酶能夠在酵母表面展示，本發(fā)明人刪除該酶蛋白的錨定信號(hào)(622-649aa)，由酵母自身的a凝集素基因(Ag a ) C端錨定信號(hào)序列(320aa)代替。同時(shí)在AChE基因與a凝集素基因錨定區(qū)域之間加入一個(gè)Flag抗原表位，以便用于融合蛋白的檢測。 此外，為了改善酶蛋白在酵母表面定位的效果，本發(fā)明人以葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase)分泌信號(hào)肽序列代替了 AChE自身信號(hào)肽，并利用pYES-DEST52Gateway系統(tǒng)，構(gòu)建了 pYES-S-AChE-flag-Aga重組質(zhì)粒，見圖1。
表達(dá)載體構(gòu)建方法具體如下 從果蠅與釀酒酵母的cDNA文庫中分別獲取AChE
(1-1863bp)
基因以及Aga
(3，端960bp)
(a凝集素，其序列參見GenBank登錄號(hào)X16861)基因，并克隆到PMD18-T載體(購自Invitrogen公司)中，得到重組質(zhì)粒T_AChE(1—1863)與T_Ag a (3'端96卿)。 通過常規(guī)的PCR技術(shù)，以T-AChE(卜1863)為模板，在3'端中引入flag標(biāo)簽堿基序列(編碼以下氨基酸序列DYKDDDDK)以及Not I酶切位點(diǎn)，得到產(chǎn)物AChE(卜1863)-f lag片段。同時(shí)以T-Aga
(3，端960bp)
為模板，5'端引入Not I酶切位點(diǎn)，得到產(chǎn)物Aga(3，,e。bp)片段。以上述兩個(gè)產(chǎn)物片段為模板，利用重疊PCR技術(shù)，整合為片段AChE(卜腦)-f lag-Ag a (3,端96卿)。并繼續(xù)以此為模板，將葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase)分泌信號(hào)肽堿基序列(其序列見SEQ ID N0:l中第l-75位))引入5'端引物中，以此替換掉AChE基因片段5'端的信號(hào)肽堿基序列(l-114bp)，獲得S_AChE(115—觀)-flag-Aga (3,端96卿)片段。利用T0P0技術(shù)將此片段克隆至載體pENTR/D-TOPO⑧(Invitrogen公司)的attLl/attL2位點(diǎn)中，得到重組質(zhì)粒pEntr-S_AChE(115—觀)-flag-Aga (3'端96一，利用Gateway 技術(shù)將融合基因片段AChE(115—腦)-f lag-Ag a (3'端96一插入到pYSE_DEST52 (Invitrogen公司)表達(dá)載體的attL1/
attL2位點(diǎn)中，得到目的質(zhì)粒pYES-AChE (115-1863) _flag_Ag a (3'端960bp)。 上述所構(gòu)建的重組載體pYES-S-AChE-f lag-Ag a用PvuII與BglII雙酶切鑒定，酶切片段大小為718bp，與實(shí)際預(yù)期相符，見圖2。測序結(jié)果顯示該酶切片段為實(shí)驗(yàn)所需目的片段。 S-AChE(115—1863)_f lag-Ag a (3'端96一的核苷酸序列如SEQ ID NO :l所示，其中第1-75位為葡萄糖淀粉酶分泌信號(hào)肽編碼序列；第76-1824位為AChE編碼序列；第1825-1848位為Flag標(biāo)簽編碼序列；第1858-2817位為Ag a的3'端編碼序列。
實(shí)施例2.乙酰膽堿酯酶誘導(dǎo)表達(dá)以及酶活力鑒定
10
將重組質(zhì)粒pYES-S-AChE-f lag-Ag a轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVScl (購自Invitrogen公司)，在SC選擇平板上篩選轉(zhuǎn)化子。挑取的單克隆在5ml SC培養(yǎng)基中3(TC培養(yǎng)過夜，隨后10，000rpm，4t:條件下離心5min收集細(xì)胞，用以半乳糖(Gal)為碳源的SC培養(yǎng)基將其稀釋為0D6。。值為0. 4的細(xì)胞懸液，3(TC誘導(dǎo)4小時(shí)，再10， OOOrpm，4"條件下離心5min收獲細(xì)胞。 細(xì)胞重懸在磷酸鈉緩沖液(pH7.6)中，使其0De。。值為0.5，隨后依次加入底物碘化乙酰膽堿(ATchI)和顯色劑DTNB，其終濃度均為lmM。將該反應(yīng)體系置于37°C ，測其0D412值，以后每隔0. 5min測定一次，連續(xù)測定15min。酶活力定義為每mL細(xì)胞懸液(0D6。。 = 1)每min水解底物的y mol數(shù)，酶活力單位為P mol/mL. min。具體公式如下
酶活力=VXA/(V。XKXLXc) (公式1) 公式中A表示吸光度隨時(shí)間的變化率(min—0 ;V。表示酶活力測定時(shí)所取細(xì)胞懸液的體積(mL) ， V。 = 0. 1 ;K表示消光系數(shù)[L/ (mmol. mm) ] ， K = 1. 36 ;c表示酵母細(xì)胞懸液的吸光值，c = 1 ;L表示測定酶活力時(shí)溶液的光徑長度，即比色皿光程(mm) ， L = 2 ;V表示反應(yīng)體系的總體積(mL) ， V = 0. 2。 將未轉(zhuǎn)質(zhì)粒的空白酵母，未經(jīng)Gal誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化子酵母懸液作為對(duì)照，測定誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)化子酵母懸液的乙酰膽堿酯酶活力。與對(duì)照相比(圖3A，圖3B)，誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)化子酵母可檢測到明顯的酶活性(圖3C)，根據(jù)公式l計(jì)算其酶活力為3.06iimol/mL.min。上述結(jié)果也證明了乙酰膽堿酯酶展示在酵母細(xì)胞表面，而非細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或分泌表達(dá)。
實(shí)施例3.有機(jī)磷農(nóng)藥半抑制濃度(IC5。)測定 酵母細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)AChE后離心收集，再重懸于磷酸鈉緩沖液(pH7.6)中，隨后接種于96孔板中，使其0D6。。值為0. 5，加入終濃度分別為0、 10-4、 10-3、 10-2、 10-1和1 y g/mL的有機(jī)磷農(nóng)藥，3(TC下孵育30min，然后加入終濃度均為lmM的底物ATChI與顯色劑DTNB，反應(yīng)總體積為200 ii L， 37t:下反應(yīng)15min，反應(yīng)過程中每間隔0. 5min檢測0D412值。使用常規(guī)的直線內(nèi)插法分別計(jì)算出農(nóng)藥對(duì)AChE的ICs。值。 從表1結(jié)果可知，12種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)AChE的敏感性都十分顯著，其中敏感性最好的是速滅威，其IC5。值為0. 00073 i！ g/mL，即便是敏感性差的久效磷，其IC5。值也達(dá)到了0. 046 ii g/mL。這說明固定化后乙酰膽堿酯酶敏感性仍然較高，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。
表1有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)AChE的半抑制濃度IC5。
農(nóng)藥名稱IC50(Mg/mL)
甲基啼啶磷0.0137
久效磷0.046
殘殺威0.002
速滅威0.00073
對(duì)氧磷0.001267
抗蚜威0.00246
呋喃丹0.00175
葉蟬散0.015
西維因0.025
氧化樂果0.029
甲拌磷0扁76
馬拉硫磷0.013 實(shí)施例4.酵母細(xì)胞的固定 稱取1.6g海藻酸鈉于無菌的小燒杯中，加無菌去離子水少許，調(diào)成糊狀，再加入其余的水(總量為40ml)?；鹕霞訙刂寥刍?，冷卻至3(TC左右，加入10ml上述制備的表面展示有乙酰膽堿酯酶的酵母培養(yǎng)液，混合均勻，倒入下邊裝有膠管與止血夾的漏斗中，通過1. 5 3. 0mm的小孔，以恒定的速度滴到盛有10% CaCl2溶液的平皿中制成凝膠珠。凝膠珠在CaCl2溶液中浸泡30min以便形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，之后將凝膠珠轉(zhuǎn)入300ml錐形瓶中，用無菌去離子水洗滌3次后加入200ml SC培養(yǎng)基。
實(shí)施例5.檢測試劑盒 —種檢測待測樣品中有機(jī)磷存在與否的試劑盒，該試劑盒中含有 容器1，以及裝于該容器中的實(shí)施例4制備的固定有所述表面展示乙酰膽堿酯酶
的酵母細(xì)胞的凝膠珠，其存在于SC培養(yǎng)基中； 容器2，以及裝于該容器中的碘化乙酰膽堿(ATchI); 容器3，以及裝于該容器中的顯色劑DTNB ; 以及，說明檢測方法的使用說明書。 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。 序列表 〈110〉中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院 〈120〉 一種在細(xì)胞表面展示外源蛋白的方法及產(chǎn)品 〈130>087048
〈160>1 〈170>PatentIn version 3.3 〈210>1 〈211>2817 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈221>misc_feature 〈223>融合基因 〈400>1atgcaactgttcaatttgcctcattctttctcgtcctctcttecttttct60ttgctcgtttctgctetcgatcgcctggtccctccggacctgtecgcggt120cgctccgtgacggtgc郷gc郷g郷tgcatgtctecacgggcatcccctecgccaag180ccgcccgtcgaggacctgcgcttccgaaagccggttcccgcggagccatggcacggcgtc240ctcgacgccacgcggttetccgccacctgcgtcc皿gagcgttecgagtecttccccggc300ttctccggcg郷卿tctgg皿cccc皿caccaacgtgtccgaggactgcctctecate360朋tgtctgggcgccggca朋ggcccgacttcgccatgggcggggtgc咖cgggggtgag420caccccaatggC3朋C3ggCggacactgaccatctcatcctccgcagaac■3Cg3CC朋Cggactgccgattctgatctggatctetggcggtggcttcatgaccggatcg540gccaccctggtgcggatetcatgaccgccgtggg咖tgt皿tegtggcc600tccttccagtatcgggtgggagcttttgggttcttgcacctggcgccggaaatgccgtcg660g朋ttcgcgg皿gaggcgcccgg咖tgtgggcctetgggatcaggcactcgccattcgc720tggctgaaggacaacgctcatgccttcggcgga皿tccggactgttcgga780gagtcggctggatccagttcggtg皿tgcccagctcatgtcgccggtgacg郷ggtctg840gtcaagcgcgg^tgatgcagtcgggcactatgaacgccccctggagccacatgacctcc■g卿郷ccgtgg卿tcggc皿ggcgctgatcaacgactgc皿ctgc皿tgcatctetg960Ctg朋g3CC3atcccgctcacgtgatgagctgcatgcgttccgtggacgcc^gaccate1020tcggtgcagcagtgg朋ctcctectcgggcatcctcagctttccctcggcgcccaccatt1080gatggtgcgttcctgccggcggatcccatgacgctgatga卿cggcggatctg皿ggac1140tecgacatcctgatggg腿acttcttgctgtecgatttc1200atcgattacttcgat朋ggacgatgccacggccctgccacgggaca^tecctggaaatt1260atgaacaatatttttggcaaggc皿cgc皿gcgg雄gcgaggccatcattttccagtet1320accagttggg朋ggc朋tcctggctetcag皿CC3gC3gCa^tcggacgcgccgtgggc1380gatcacttcttcacctgcccC3CC皿Cg3gtetgcccaggctctggcggagcgaggcgct1440tccgtgcactactectactttacacaccgcacaagcacctcattgtggggcg皿tggatg1500ggcgtgctgcgatcg朋tecttctttggccagccgctg皿caactccctg1560cagtetcgacctgtggagcgtgagctgggc皿gcgtetgctcagtgcggtcattgagttt1620gcteagacgggaaatcccgctc郷atggcg郷賜tggcccaacttctcc皿ggaggat1680cccgtctactatettttcagcaccgacgat^gatcgaga皿ttggccaggggtcctttg1740
13
gcggctcgctgctcgttctgg皿tgattecggc郷tect1800tgcgatggcgattcggg皿gtgctgattet3tg3C皿ggCggccgctegc1860gcc皿皿gctcttttetctcaaccactectactgattteacactagtgcg1920tettccactggatccatttccac3gteg皿3C3ggC皿tCgaactecatc3g皿gtgatc1980agcratgtggtgacteccagcac皿朋ctgtctccaactgctecteccagcctgacaatt2040gC3C皿3CC3gtetctattctactgactca皿tetcac3gtegg皿c3gatettcacacc2100tgattegtgatgtgg朋3CC3ttegcag3gaaacagcttcgaccgttgta2160gccgctccaacctc皿c皿ctggatgg織ggcgctetgaatecttecatctcgcaattt2220acatcctcttctttcgcaac朋tc皿cagctctcttcatcagcagtettt2280atgcttcaattgtcaatgtgatetcacg朋tectgctgct2340gttccatctg朋gagcccacttttgtaaatgCC3Cg3g皿actcctteaattccttctgc24003gC3gC朋3Cagccatccagtccctcatcttetecgtcttccccactcgtatcgtccctc2460tccgteagca朋gC3CC3gttttecgccttctgtgccaac2520cga皿朋tecgggttectttg3gC3C3Cggctttgacaacatcttcagtt2580ggcctteattcttttegtga朋C3gC3gtCtcatctcaggtgacaccttt2640ttagtgtcatccttgatcgcatetccttcttctgcatcaggtccggtetc2700tcacatcaacttctctcatgatttcaacctatg朋ggteaagcgtcteta2760tttttctcagctgagctcggttcgatcatttttctgcttttgtcgtecctgctettc281權(quán)利要求
一種基因構(gòu)建物，其特征在于，所述基因構(gòu)建物從5’到3’依次包括以下操作性相連的元件(a)葡萄糖淀粉酶信號(hào)肽編碼序列；(b)外源蛋白的編碼序列；和(c)酵母α凝集素基因C端錨定信號(hào)的編碼序列。
2. 如權(quán)利要求l所述的基因構(gòu)建物，其特征在于，所述的外源蛋白選自受體蛋白、配體蛋白、酶蛋白或抗體蛋白。
3. 如權(quán)利要求2所述的基因構(gòu)建物，其特征在于，所述的外源蛋白是乙酰膽堿酯酶。
4. 如權(quán)利要求3所述的基因構(gòu)建物，其特征在于，所述的葡萄糖淀粉酶信號(hào)肽編碼序列是SEQ ID N0:l所示序列中第l-75位的序列；或所述的乙酰膽堿酯酶編碼序列是SEQ ID NO :l所示序列中第76-1824位的序列；或所述的酵母a凝集素基因C端錨定信號(hào)的編碼序列是SEQ ID NO:l所示序列中第1858-2817位的序列。
5. 如權(quán)利要求3所述的基因構(gòu)建物，其特征在于，在元件(b)和元件(c)之間，包括一標(biāo)簽蛋白編碼序列。
6. —種重組的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體含有權(quán)利要求l-5任一所述的基因構(gòu)建物。
7. —種細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞是酵母細(xì)胞，所述細(xì)胞中含有權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體；或其基因組中整合有權(quán)利要求1-5任一所述的基因構(gòu)建物。
8. 如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞，其特征在于，所述的酵母細(xì)胞選自釀酒酵母或畢赤酵母。
9. 如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞，其特征在于，所述的基因構(gòu)建物中，所述的外源蛋白的編碼序列是乙酰膽堿酯酶的編碼序列。
10. —種在細(xì)胞表面展示表達(dá)外源蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括(i) 將權(quán)利要求l-5任一所述的基因構(gòu)建物導(dǎo)入到酵母細(xì)胞中，獲得重組細(xì)胞；(ii) 培養(yǎng)(i)的重組細(xì)胞，從而在細(xì)胞表面展示表達(dá)外源蛋白。
11. 一種檢測待測樣品中有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括權(quán)利要求9所述的細(xì)胞；或固相載體，以及吸附或包埋在固相載體中的權(quán)利要求9所述的細(xì)胞。
12. —種檢測待測樣品中有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法，其特征在于，所述方法包括(1) 將權(quán)利要求9所述的細(xì)胞固定于固相載體或懸浮于與所述細(xì)胞相容性的介質(zhì)中，形成檢測體系；(2) 在(1)的檢測體系中加入待測樣品，混合；禾口(3) 檢測(2)的體系中乙酰膽堿酯酶的活性，從而確定待測樣品中是否含有有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥或其含量。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，包括向步驟(2)的檢測體系中加入乙酰膽堿酯酶的底物，通過檢測乙酰膽堿酯酶對(duì)底物的水解情況確定待測樣品中是否含有有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥或其含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在酵母細(xì)胞表面展示外源蛋白的方法及產(chǎn)品。本發(fā)明公開了一種基因構(gòu)建物，所述的基因構(gòu)建物在導(dǎo)入到細(xì)胞中后，可使得重組表達(dá)的外源蛋白在細(xì)胞表面展示。采用本發(fā)明的基因構(gòu)建物以及表達(dá)系統(tǒng)，外源蛋白在細(xì)胞表面上的展示表達(dá)效果特別優(yōu)異，可保留良好的蛋白活性，方便地實(shí)現(xiàn)外源蛋白的固定化，并可簡化蛋白純化的繁瑣步驟。
文檔編號(hào)C12Q1/44GK101724649SQ20081020189
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月29日
發(fā)明者專芳芳, 吳松潔, 王慧, 許誦辭 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院