一種利用蛋白支架提高大腸桿菌中異戊二烯合成的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用蛋白支架將大腸桿菌MEP途徑中的脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶、脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶和2-甲基赤蘚糖醇-4-焦磷酸合成酶共區(qū)域化，提高異戊二烯生產(chǎn)的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。本發(fā)明從枯草芽孢桿菌和大腸桿菌中分別克隆了所需靶酶分子的基因，構(gòu)建成增強(qiáng)MEP代謝途徑的重組質(zhì)粒，合成銀白楊異戊二烯合成酶基因并構(gòu)建外源表達(dá)蛋白支架以及異戊二烯合成酶的重組質(zhì)粒，將兩種重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中，獲得可以通過(guò)蛋白支架將三種靶酶分子共區(qū)域化提高異戊二烯合成的大腸桿菌工程菌株。
【專利說(shuō)明】一種利用蛋白支架提高大腸桿菌中異戊二烯合成的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提高大腸桿菌中異戊二烯合成的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]異戊二烯即2-甲基-1，3-丁二烯，是一種共軛二烯烴，作為一種重要的五碳平臺(tái)化合物用途十分廣泛，主要用于橡膠工業(yè)(如:輪胎，粘合劑的生產(chǎn))，是合成橡膠(SR)的重要單體，其用量約占異戊二烯總產(chǎn)量的95%，主要用于合成異戊橡膠(IR)以及丁基橡膠(IIR)，其次，在精細(xì)化工領(lǐng)域還可以作為合成香精香料、維生素E、農(nóng)藥的原料，也可用于合成樹(shù)脂、液體聚異戊二烯橡膠等，除此之外，生物來(lái)源的異戊二烯還可以加工成航空燃料，高分子材料等，在天然產(chǎn)物方面，異戊二烯也是合成萜類化合物的前體物質(zhì)。
[0003]工業(yè)上生產(chǎn)異戊二烯的方法有很多種，目前異戊二烯的生產(chǎn)方法主要有C5餾分萃取蒸餾法，異戊烷、異戊烯催化脫氫法，以及化學(xué)合成法。異戊二烯的化學(xué)法全合成過(guò)程復(fù)雜、原料難得、成本較高，而且隨著化石燃料的消耗以及人們對(duì)環(huán)境問(wèn)題的關(guān)注，利用生物法合成異戊二烯將具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。雖然植物可以釋放少量的異戊二烯，但通過(guò)收集植物釋放的異戊二烯操作困難，效率低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。利用微生物如大腸桿菌、釀酒酵母等進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯具有的優(yōu)點(diǎn)包括，產(chǎn)物易于收集，純化加工，微生物生長(zhǎng)速度快、繁殖周期短、發(fā)酵成本低、易操作等，而且與植物相比這些微生物的遺傳背景更加清晰，更易于進(jìn)行遺傳改造。
[0004]異戊二烯的生物合成方法主要依靠自然界中萜類代謝途徑的酶系，即甲羥戊酸途徑(MVA pathway)和非甲輕戍酸途徑(MEP pathway),異戍二烯烴職類共同合成途徑的中間產(chǎn)物二甲基丙烯基焦磷酸及異戊二烯焦磷酸，通過(guò)異戊二烯合成酶催化形成，因此，增加異戊二烯前體物質(zhì)二甲基丙烯基焦磷酸的積累量是提高異戊二烯產(chǎn)量的重要條件之一。另外，目前在微生物中還未發(fā)現(xiàn)異戊二烯合成酶，因此，異源表達(dá)植物來(lái)源的異戊二烯合成酶是實(shí)現(xiàn)微生物合成異戊二烯的必要條件。在工程大腸桿菌中利用MVA途徑進(jìn)行異戊二烯的生產(chǎn)已經(jīng)取得一定的研究結(jié)果，相關(guān)研究表明MEP途徑較于MVA途徑具有更高的理論產(chǎn)率，而且通過(guò)模擬自然界中存在的多酶復(fù)合體拉近途徑中的酶分子可以有效的增強(qiáng)底物隧道效應(yīng)，縮短底物在酶分子之間的傳輸距離及時(shí)間，減少中間代謝產(chǎn)物擴(kuò)散到主體相的損失，因此實(shí)現(xiàn)利用MEP途徑生產(chǎn)異戊二烯將有助于生物法合成異戊二烯進(jìn)一步的研究，利用蛋白支架將異戊二烯合成過(guò)程中的酶分子共區(qū)域化可以為異戊二烯的微生物法高效合成提供技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了解決化學(xué)法合成異戊二烯存在的問(wèn)題，以及目前生物法合成異戊二烯過(guò)程中存在的不足等(如通過(guò)簡(jiǎn)單提高關(guān)鍵酶的表達(dá)量和酶活而造成代謝流不平衡)，提供一種提高異戊二烯產(chǎn)量的新方法，該方法是利用蛋白支架將MEP途徑中的三種酶分子共區(qū)域化，通過(guò)縮短底物在酶分子之間的傳輸距離及時(shí)間增強(qiáng)底物隧道效應(yīng)，從而提高異戊二烯前體物質(zhì)DMAPP及IPP的積累量，再表達(dá)植物來(lái)源的經(jīng)密碼子優(yōu)化的異戊二烯合成酶實(shí)現(xiàn)異戊二烯的合成。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案提供一種提高異戊二烯合成量的大腸桿菌工程菌株構(gòu)建方法，從枯草芽孢桿菌SL-14(Bacillus subtilis)中克隆脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因DXS，脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因DXR，從大腸桿菌C600(EsCheriChiacoli)中克隆2-甲基赤蘚糖醇-4-焦磷酸合成酶基因IspD，將三個(gè)靶酶基因分別與支架蛋白的配體通過(guò)一段甘氨酸與絲氨酸組成的九肽連接，將獲得的基因片段通過(guò)Gibson組裝的方法與pET28a質(zhì)粒構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET28a_scaffold。將銀白楊(Populus alba)的異戍二烯合成酶基因IspS密碼子優(yōu)化并合成，與支架蛋白以及pET21b質(zhì)粒進(jìn)行Gibson組裝，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET21b-GSP-1spS，將兩種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中獲得工程菌株BL21 (DE3) -ScaS。[0007]本發(fā)明的大腸桿菌工程菌株BL21 (DE3) -ScaS，其中強(qiáng)化表達(dá)了脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶DXS，脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶DXR，2-甲基赤蘚糖醇-4-焦磷酸合成酶IspD，導(dǎo)入了外源的蛋白支架和異戊二烯合成酶IspS，其中DXS、DXR及IspD在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)后可在蛋白支架的作用下共區(qū)域化而發(fā)揮作用。
[0008]本發(fā)明通過(guò)蛋白支架方法獲得的大腸桿菌工程菌株能夠發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯并提高其產(chǎn)量，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0009]1、本發(fā)明構(gòu)建的異戊二烯工程菌株中重組質(zhì)粒的構(gòu)建采用Gibson組裝的方式進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)了多個(gè)片段的同時(shí)組裝，與傳統(tǒng)的限制性酶切、連接組裝方法相比，不需要重復(fù)的酶切和連接反應(yīng)，基因操作容易，基因組裝過(guò)程高效省時(shí)，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟。
[0010]2、本發(fā)明構(gòu)建的異戊二烯工程菌，有效的增強(qiáng)了 MEP途徑的代謝流，并利用蛋白支架將靶酶分子共區(qū)域化，組裝成多酶復(fù)合體發(fā)揮催化作用，與游離形式過(guò)表達(dá)三種靶酶相比，異戊二烯的產(chǎn)量從17.68mg/L提高到24mg/L。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例中大腸桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯的氣相色譜圖；
[0012]圖2是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例中大腸桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯的氣相-質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0014]實(shí)施例1:大腸桿菌工程菌株的構(gòu)建
[0015]1、從枯草芽孢桿菌SL-14 (Bacillus subtilis)中克隆出脫氧木酮糖_5_磷酸合成酶的基因片段DXS以及脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶的基因片段DXR，從大腸桿菌C600(Escherichia coli)中克隆出2-甲基赤蘚糖醇_4_焦磷酸合成酶的基因片段IspD,將克隆的三個(gè)基因分別與支架蛋白GBD、SH3及PDZ的配體GBD lig、SH31ig、H)Z Iig通過(guò)一段甘氨酸與絲氨酸組成的九肽連接，獲得的片段DXS-L-GBD lig、DXR-L-SH31ig、IspD-L-PDZIig0
[0016]擴(kuò)增引物序列為:[0017]引物1:5，>TTGGATCTTTTATCAATACA〈3’
[0018]引物2:5 ’ >CAGACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCTGATCCAATTCCTTTGTGTG<3 ’，引物 I和2用于DXS基因片段的擴(kuò)增。
[0019]引物3:5，>CCACCAAAGACACACAAAGGAATTGGATCAGGTTCTGGTTCTGGTTCTGG<3，
[0020]引物4:5’ >TTAGTCTTCGTCTTCGTCACCAG〈3’，引物 3 和 4 用于 GBD Iig 基因片段的擴(kuò)增。
[0021 ]引物 5:5，>TTGAAAAATATTTGTCTTTT<3，
[0022]引物6:5 ’ >GGCGGACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCTGTGAGTATTGAATTGACGT<3 ’引物5和6用于DXR-L-SH31ig基因片段的擴(kuò)增。
[0023]引物7:5，>TTATGTATTCTCCTGATGGA<3 ’
[0024]引物8:5，>AACCAGAGATTCTTTAACACCACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCATGGCAACCACTCATTTGGA〈3’引物7和8用于IspD-L-PDZ Iig基因片段的擴(kuò)增。
[0025]2、分別以克隆得到的基因片段DXS-L-GBD lig、DXR-L_SH31ig、IspD-L-PDZ Iig為模板，分別擴(kuò)增得到添加了核糖體識(shí)別序列RBS并可用于Gibson組裝的基因片段T7-DXS、RBSl-DXR、RBS2-1spD。
[0026]擴(kuò)增引物序列為:
[0027]引物 9:5，>CTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATGGATCTTTTATCAATACA〈3’，下劃線序列為與pET28a質(zhì)粒重疊序列。
[0028]引物10:5，>TAAAAGACAA ATATTTTTCATACTAGTTTTCTCCTCTTTTTAGTCTTCGTCTTCGTCAC〈3’，下劃線序列為與DXR-L-SH31ig基因片段及RBSl重疊序列。引物9和10用于擴(kuò)增Gibson組裝的T7-DXS基因片段。
[0029]弓 I 物 11:5，> GGTGACGAAGACGAAGACTAAAAAGAGGAGAAAACTAGTATGAAAAATATTTGTCTTTIX3’，下劃線序列為與 DXS-L-GBD Iig 基因片段及 RBSl 重疊序列。
[0030]引物12:5，>CAAATGAGTGGTTGCCATACTAGTTTTCTCCTCTTTAATTTAACGACGACGTTTCGGCG〈3’，下劃線序列為與IspD-L-PDZ Iig基因片段及RBS2重疊序列。引物11和12用于擴(kuò)增Gibson組裝的RBSl-DXR基因片段。
[0031 ]引物 13:5，>CCGAAACGTCGTCGTTAAATTAAAGAGGAGAAAACTAGTATGGCAACCACTCATTTGGA〈3’，下劃線序列為與DXR-L-SH31ig基因片段及RBS2重疊序列。
[0032]引物 14:5? >TTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTAAACCAGAGATTCTTTAA〈3’，下劃線序列為與pET28a質(zhì)粒重疊序列。引物13和14用于擴(kuò)增Gibson組裝的RBS2-1spD基因片段。
[0033]3、從Genbank基因庫(kù)中查詢獲得銀白楊異戊二烯合成酶IspS的基因片段，利用大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成IspS基因片段。
[0034]引物序列為:
[0035]引物15:5，>GTTTCTCCGTACTTCAAATAAAAAGAGGAGAAAACTAGTATGCTCTGTTTCTACCGAAA〈3’
[0036]引物16:5，>TTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTAACGTTCGAACGGCAGGA〈3’，引物15和16用于擴(kuò)增Gibson組裝的IspS基因片段。[0037]4、將獲得的基因片段T7-DXS、RBS1-DXR、RBS2_IspD通過(guò)Gibson組裝的方法與雙酶切回收后的pET28a質(zhì)粒構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET28a-scaff0ld，表達(dá)增強(qiáng)MEP途徑的多基因串聯(lián)表達(dá)盒T7-DXS-RBSl-DXR-RBS2-1spD，將酶切回收得到的蛋白支架基因GBD-SH3-PDZ以及異戊二烯合成酶基因IspS與雙酶切回收后的pET-21b質(zhì)粒通過(guò)Gibson組裝的方法構(gòu)建外源表達(dá)異戍二烯合成酶的重組質(zhì)粒pET21b-GSP-1spS,具體過(guò)程如下:
[0038]利用引物I和引物2，以枯草芽孢桿菌SL-14 (Bacillus subtilis)基因組為模板，克隆得到脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶DXS的基因片段；
[0039]利用引物3和引物4，以pUC57-GBD Iig質(zhì)粒為模板，克隆得到支架蛋白配體GBDIig的基因片段；
[0040]利用引物I和引物4，以基因片段DXS和GBD Iig為模板，擴(kuò)增得到基因片段DXS-L-GBD Iig ；
[0041]利用引物5和引物6，以枯草芽孢桿菌SL-14 (Bacillus subtilis)基因組為模板，克隆得到添加了支架蛋白配體SH31ig的脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因片段DXR-L-SH31ig ；
[0042]利用引物7和引物8，以大腸桿菌C600(Escherichia coli)基因組為模板，克隆得到添加了支架蛋白配體PDZ Iig的2-甲基赤蘚糖醇-4-焦磷酸合成酶基因片段IspD-L-PDZIig ;
[0043]利用引物9和引物10，以基因片段DXS-L-GBD Iig為模板，克隆得到可用于Gibson組裝的基因片段T7-DXS ； [0044]利用引物11和引物12，以基因片段DXR-L_SH31ig為模板，克隆得到添加了核糖體識(shí)別序列RBSl并可用于Gibson組裝的基因片段RBSl-DXR ；
[0045]利用引物13和引物14，以基因片段IspD-L-PDZ Iig為模板，克隆得到添加了核糖體識(shí)別序列RBS2并可用于Gibson組裝的基因片段RBS2_IspD ；
[0046]將回收純化后得到的基因片段T7-DXS、RBSl-DXR、RBS2_IspD與利用Nco I與Xho
I雙酶切得到的pET28a線性化質(zhì)粒通過(guò)Nanodrop測(cè)定DNA濃度，根據(jù)濃度不同進(jìn)行混合，利用Gibson組裝形成環(huán)狀質(zhì)粒,進(jìn)行大腸桿菌ToplO的轉(zhuǎn)化；
[0047]利用引物15和引物16，以pUC19_IspS為模板，克隆得到異戊二烯合成酶IspS的基因片段；將IspS、GBD-SH3-PDZ及pET21b質(zhì)粒通過(guò)Nanodrop測(cè)定DNA濃度，按照濃度不同進(jìn)行混合，利用Gibson組裝形成環(huán)狀質(zhì)粒,進(jìn)行大腸桿菌ToplO的轉(zhuǎn)化；
[0048]5、通過(guò)菌落PCR驗(yàn)證及提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證分別獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒pET28a-scaffold及 pET21b_GSP_IspS ；
[0049]6、將重組質(zhì)粒pET28a_scaffold及pET21b-GSP_IspS共同轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，構(gòu)建工程菌BL21(DE3)-ScaS，并進(jìn)行鑒定驗(yàn)證。將共轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BL21 (DE3)涂布在含有氨芐青霉素和卡那霉素雙抗性的平板上，由于pET28a含有卡那霉素抗性基因，轉(zhuǎn)化成功的工程菌株在卡那霉素的平板上生長(zhǎng)，由于pET21b含有氨芐青霉素抗性基因，轉(zhuǎn)化成功的工程菌株也可以在氨芐青霉素的平板上生長(zhǎng)，并進(jìn)一步驗(yàn)證獲得陽(yáng)性菌株。
[0050]實(shí)施例2:大腸桿菌工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯的驗(yàn)證
[0051]將篩選出工程菌株的單菌落接種到LB培養(yǎng)基中，37°C搖瓶培養(yǎng)過(guò)夜后作為種子液按照接種量為1%轉(zhuǎn)接到新鮮的LB培養(yǎng)基中，37°C，170rpm培養(yǎng)至0D600為0.6-0.8時(shí)加入0.1mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)并進(jìn)行密封培養(yǎng)，誘導(dǎo)溫度為20°C，培養(yǎng)24小時(shí)后，將搖瓶在60°C下處理30min，抽取1mL頂空氣體進(jìn)行檢測(cè)，以異戊二烯標(biāo)準(zhǔn)品作為參照。氣相檢測(cè)系統(tǒng)采用島津GC2010氣相色譜儀，色譜柱為TG-5，檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器，氣化室溫度100°C，檢測(cè)器溫度200°C。氣相色譜分析結(jié)果中箭頭所示的峰與異戊二烯標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)保留時(shí)間相同，均為2.69分鐘，為進(jìn)一步分析該峰結(jié)構(gòu)，利用安裝有Agilent色譜柱DB-1(30m*0.25mm*0.25um)的島津氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-QP2010進(jìn)行氣質(zhì)分析，結(jié)果顯示該峰為異戊二烯(圖2)。結(jié)果說(shuō)明工程菌中成功導(dǎo)入了異戊二烯合成酶，能夠合成異戊二烯。
[0052]實(shí)施例3:大腸桿菌工程菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
[0053]將工程菌株的單菌落接種到LB培養(yǎng)基中，37°C搖瓶培養(yǎng)過(guò)夜后作為種子液按照接種量為1%轉(zhuǎn)接到新鮮的LB培養(yǎng)基中，37 °C，170rpm培養(yǎng)至0D600為0.6-0.8時(shí)加入
0.1mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)并進(jìn)行密封培養(yǎng)，誘導(dǎo)溫度為20°C，培養(yǎng)24小時(shí)后氣相檢測(cè)，異戊二烯的產(chǎn)量達(dá)到24mg/L。
【權(quán)利要求】
1.一種提高大腸桿菌異戊二烯合成的方法，其特征在于:利用支架蛋白將脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)及2-甲基赤蘚糖醇_4_焦磷酸合成酶(IspD)共區(qū)域化，提高異戊二烯前體物質(zhì)二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)及異戊二烯焦磷酸(IPP)的積累量，再通過(guò)表達(dá)植物來(lái)源的異戊二烯合成酶(IspS)實(shí)現(xiàn)異戊二烯的合成。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)及2-甲基赤蘚糖醇-4-焦磷酸合成酶(IspD)這三種酶分子的過(guò)表達(dá)和共區(qū)域化可增加異戊二烯前體物質(zhì)DMAPP的含量。
3.如權(quán)利要求1所述的脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)及2-甲基赤蘚糖醇-4-焦磷酸合成酶(IspD)是來(lái)源于:1)埃希氏菌屬大腸桿菌，或2)來(lái)源于其他細(xì)菌，優(yōu)選枯草芽孢桿菌，或3)來(lái)源于其他生物中具有相同或相似功能的基因。
4.如權(quán)利要求1所述的支架蛋白是起到能使酶分子共區(qū)域化的蛋白，包括通過(guò)成對(duì)的相互作用蛋白質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)域和多肽鏈構(gòu)建的蛋白支架，通過(guò)自組裝蛋白質(zhì)構(gòu)建的蛋白支架和通過(guò)借助化學(xué)修飾蛋白構(gòu)建的蛋白支架等。
5.權(quán)利要求1所述的大腸桿菌工程菌株在發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P5/02GK103898149SQ201410088310
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】李春, 屈虹男, 李哲, 王翠薇 申請(qǐng)人:北京理工大學(xué)