一種肺組織特異性titf1啟動子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種肺組織異性TITF1啟動子及其應(yīng)用，特別提供了一種肺組織特異性表達基因5′調(diào)控區(qū)特異性啟動子及其在轉(zhuǎn)基因豬中的應(yīng)用，該啟動子只在肺組織中具有啟動特性，而在除肺組織外的多種細胞中均無啟動活性，可見該基因啟動子只在肺組織中特異性地啟動下游基因的表達，因此能夠滿足目的基因在肺組織中特異性表達的要求，為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高豬的抗病品質(zhì)提供了一種重要的元件。
【專利說明】一種肺組織特異性TlTF1啟動子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子遺傳學領(lǐng)域，具體涉及了一種肺組織特異性表達基因5'調(diào)控區(qū)特異性TITFl啟動子及其在轉(zhuǎn)基因豬中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]真核生物基因表達的時間和水平嚴格按照發(fā)育順序進行。某些特定基因表達模式的調(diào)節(jié)能夠引起轉(zhuǎn)錄因子與相關(guān)元件的特異性結(jié)合，成為轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵步驟，并最終導(dǎo)致基因的時間和空間表達。編碼組織特異蛋白的系列家族基因嚴格按照組織特異性和發(fā)育階段性表達，為基因表達調(diào)控機制提供了很好的研究模式。在轉(zhuǎn)基因動物中，獲得能廣泛應(yīng)用的特異性啟動子顯得非常重要。但啟動子的特異性由多個元件控制，在不同種類和不同發(fā)育時期起關(guān)鍵作用的調(diào)控元件并不相同，調(diào)控元件和反式作用因子之間的相互作用也十分復(fù)雜。因此要使外源基因能夠在動物組織中特異高效地表達，必須構(gòu)建一個可以特異高效表達的動物表達載體，其中啟動子的選擇是重要的條件之一。
[0003]甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子I (Thyroid Transcription Factorl, TITF1),又稱為甲狀腺特異性增強結(jié)合蛋白，選擇性的活化甲狀腺，肺，及大腦特異區(qū)域相關(guān)基因的表達。其中豬的TITFl位于7號染色體，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，編碼369個氨基酸。TITFl具有2個獨特轉(zhuǎn)錄活性的結(jié)構(gòu)域:一個位于N端第51-123個氨基酸殘基之間，另一個位于C端第295-369個氨基酸殘基之間，兩者都通過融合到DNA結(jié)合位點而發(fā)揮作用。通過克隆該基因啟動子區(qū)并在體外分析其啟動特性，利用相關(guān)序列構(gòu)建肺組織特異性表達載體是一種有效的方法，但是上述的研究均還處在起步階段，對于轉(zhuǎn)基因豬的培育和抗病性提高均沒有起到較好的促進作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于上述的原因，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)TITFl基因5'調(diào)控區(qū)具有肺組織特異性啟動特性，并利用這一特性設(shè)計了一種肺組織特異性HTFl啟動子載體，該啟動子可以在轉(zhuǎn)基因豬的培育中應(yīng)用。該啟動子載體具有肺組織特異性啟動特性，而在除肺組織外的多種細胞中均無啟動活性，可見該啟動子在肺組織中特異性地啟動下游基因的表達，能夠滿足目的基因在肺組織中特異性表達的要求，為轉(zhuǎn)基因載體提供了一種重要的元件。
[0005]本發(fā)明所提供的肺組織特異性表達基因5'調(diào)控區(qū)特異性啟動子，其基因序列如Seq ID No:1 所示；
[0006]除了上述的啟動子之外，還可以是該啟動子變體或者片段，但均具有如Seq IDNo:1所不的基因序列。
[0007]“變體”是指對豬肺組織TITFl啟動子Seq ID No:1序列進行一個或者多個堿基的任何取代、變異、修飾、替換、缺失或者添加所產(chǎn)生的序列，該序列仍然表現(xiàn)出類似于Seq IDNo:1DNA序列的活性。[0008]“片段”是指基本豬肺組織TITFl啟動子Seq ID No:1序列的一個或者多個區(qū)域，其仍然類似于基本DNA序列的活性。
[0009]具有上述序列的啟動子或其變體，或者片段，具有肺組織特異性啟動特性，而在肺組織之外的多種細胞中均無啟動活性，可見該基因啟動子在肺組織中特異性地啟動下游基因的表達，能夠滿足目的基因在肺組織中特異性表達的要求，并能應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因豬的培育中。
[0010]應(yīng)用上述的啟動子時，一般采用重組核酸序列，該序列中含有上述的啟動子或其變體，或者片段，這樣就可以使于啟動子下游的目的基因在肺組織中特異性表達，作為分析、開發(fā)、改造肺組織特性的研究模型。還可以利用已有的分子生物學操作技術(shù)獲得包含目的基因的重組核酸，通過顯微注射等基因?qū)爰夹g(shù)獲得轉(zhuǎn)基因胚胎，用于建立轉(zhuǎn)基因動物。重組核酸序列中的目的基因，含有下列的至少一種功能基因，主要包括抗病基因，加快生長速度基因，提高飼料報酬的基因以及生產(chǎn)特定藥物的基因，這樣就可以在獲得肺組織特異性啟動特性之外，提高該重組核酸序列的性能，為轉(zhuǎn)基因豬的培養(yǎng)提供更多的功能性方向，增加其附加產(chǎn)值，如將Toll樣受體基因在該啟動子指導(dǎo)下表達可以特異性提高肺組織中白介素和干擾素，提高豬的抗病性能。
[0011]在獲得了上述的重組核酸序列之后，還可以用其建立特殊的表達系統(tǒng)，以便更好的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因豬的培育過程中。將目的基因重組至該啟動子下游，通過基因轉(zhuǎn)入技術(shù)使調(diào)控區(qū)與目的基因共同整合進染色體中，獲得轉(zhuǎn)基因動物，在該啟動子作用下目的基因僅在肺組織中表達，在其他組織器官中不表達，降低目的基因?qū)游锏挠绊?，提高轉(zhuǎn)基因的效果O
[0012]本發(fā)明主要通過報告基因分析確定該啟動子的啟動特征。首先獲得無啟動子紅色熒光蛋白載體。然后通過PCR或者基因捕獲等技術(shù)獲得肺組織中特異性表達的豬表面活性物質(zhì)蛋白基因TITFl型5'調(diào)控區(qū)，長度為2.85kb，插入紅色熒光蛋白上游，得到啟動子報告基因分析載體，將CMV啟動子(589bp)連入空載體DsRed載體中作為陽性對照，空載體DsRed載體為陰性對照。質(zhì)粒去內(nèi)毒素后，轉(zhuǎn)染V79倉鼠肺細胞系，同時轉(zhuǎn)染3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞系和Marcl45非洲綠猴腎細胞系為對照,48h后用倒置熒光顯微鏡觀察紅色熒光蛋白表達情況，分析啟動子特性。其中之所以選擇CMV連入的空載體中作為陽性對照，主要是因為CMV為已知公認的強啟動子，將強啟動子連入無啟動子的載體上游可以啟動報告基因RFP的表達，該載體轉(zhuǎn)染如細胞作為陽性對照，可以證明實驗中所用的細胞以及轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染技術(shù)等不存在問題，證明陰性對照無RFP表達是由于沒有啟動子的存在，而不是其他因素造成。進而更有力的證明連入實驗啟動子的載體轉(zhuǎn)入細胞后啟動RFP的表達是因為該啟動子的作用。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明選用了獨特的載體DsRed載體(商業(yè)載體全稱為pDsRed-Express2-lvector),以適應(yīng)本發(fā)明所米用的報告基因RFP (紅色突光蛋白)，同時本發(fā)明為TITFl特別設(shè)計了引物、啟動子序列以及酶切位點等供研究其使用，均具有獨特的代表性，因此與現(xiàn)有的肺組織特異性啟動子相比，本發(fā)明的技術(shù)具有明顯的不同和顯著的進步和針對性。
[0014]當上述的啟動子，或者重組核酸序列或者表達系統(tǒng)被應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因豬的培育中后，可以有效的提高培 育的效果，且通過添加各種功能性基因，使得轉(zhuǎn)基因豬可以獲得更好的抗病品質(zhì)，更高的生長速度，更好的抗病性以及降低飼養(yǎng)成本，還可以在特定藥物的生產(chǎn)中得到更為廣泛的應(yīng)用，對于該領(lǐng)域的研究有著很好的參考價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為TITFl (F)和TITFl (R)引物PCR擴增TITFl啟動子片段電泳圖，圖中泳道M 為 MassRuler Maker, I 為 PCR 產(chǎn)物；
[0016]圖2為無啟動子的DsRed載體圖譜；
[0017]圖3為轉(zhuǎn)染TITFlpromoter DsRed48h倉鼠V79細胞照片灰度圖，
[0018]圖中左側(cè)為40倍光鏡下照片，細胞狀態(tài)良好；右側(cè)為綠光激發(fā)下照片，可見RFP表達，TITFl promoter有啟動活性；
[0019]圖4為轉(zhuǎn)染TITFlpromoter DsRed48h小鼠胚胎成纖維3T3-L1細胞照片灰度圖，
[0020]圖中左側(cè)為40倍光鏡下照片，細胞狀態(tài)良好；右側(cè)為綠光激發(fā)下照片，無RFP表達，TITFlpromoter無啟動活性；
[0021]圖5為轉(zhuǎn)染TITFlpromoter DsRed48h非洲綠猴腎Marcl45細胞照片灰度圖，
[0022]圖中左側(cè)為40倍光鏡下照片，細胞狀態(tài)良好；右側(cè)為綠光激發(fā)下照片，無RFP表達，TITFlpromoter無啟動活性；
[0023]圖6為轉(zhuǎn)染CMV Promoter DsRed48h倉鼠V79細胞照片灰度圖，
[0024]圖中左側(cè)為40倍光鏡下照片，細胞狀態(tài)良好；右側(cè)為綠光激發(fā)下照片，可見RFP表達，轉(zhuǎn)染技術(shù)有效；
[0025]圖7為轉(zhuǎn)染promoter les`s DsRed48h倉鼠V79細胞照片灰度圖，
[0026]圖中左側(cè)為40倍光鏡下照片，細胞狀態(tài)良好；右側(cè)為綠光激發(fā)下照片，無RFP表達，轉(zhuǎn)染試劑有效。
【具體實施方式】
[0027]在本說明書的上下文中，除非特別指明否則本說明書所用的任何術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員在本領(lǐng)域中通常理解的含義，而未注明詳細條件的實驗方法是按照常規(guī)試驗方法或按照供應(yīng)商所建議的操作說明書進行的。
[0028]實施例1啟動子報告基因載體的構(gòu)建
[0029]基因組提取:取大約克夏豬耳組織,按照TIANamp genomic DNA (天根)試劑盒說明書進行基因組DNA提取。
[0030]無啟動子的DsRed載體作為陰性對照；以DsRed為骨架用Sma I (Fermentas)酶切，回收4107bp片段，得到無啟動子片段。將完整的CMV啟動子正向連入該載體中，得到該載體的陽性對照載體。
[0031]將包含陰性對照和陽性對照載體的菌液按照1:500的比例分別接種至含卡那霉素100yg/ml LB培養(yǎng)基中，200rpm劇烈搖晃14h。4°C 6000g收集菌體至50ml離心管中，用于無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取，具體操作按照EndoFree Plasmid Maxi (QIAGEN)說明書進行,純化得到的質(zhì)粒A260/280在1.8-1.9之間。
[0032]根據(jù)NCBI (GeneID: 100155470)設(shè)計如下引物，TITFl (F)基因序列如 Seq ID No: 2所示,TITFl (R)基因序列如Seq ID No: 3所示,它包含了從轉(zhuǎn)錄起始位點下游47bp到上游2939bp的范圍。
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一種肺組織特異性TITFl啟動子，其特征在于:該啟動子的基因序列如Seq ID No:1所示。
【文檔編號】C12N15/85GK103820455SQ201410088300
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月12日
【發(fā)明者】姜運良, 王鵬飛, 劉根, 李艷平, 康麗, 孫億, 劉浩 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學