細(xì)胞飼養(yǎng)層及其在培養(yǎng)人原代腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種細(xì)胞飼養(yǎng)層，是通過以下方法制備得到的：采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)BALB3T3細(xì)胞，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)至鋪滿培養(yǎng)瓶70%～80%時，進(jìn)行照射。以3000cGy作為放射劑量進(jìn)行X線照射；照射后改用改良F培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)8小時后，所得培養(yǎng)物即為細(xì)胞飼養(yǎng)層。所述細(xì)胞飼養(yǎng)層可以用于培養(yǎng)人原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞。本發(fā)明改進(jìn)了細(xì)胞飼養(yǎng)層的細(xì)胞類型和制備方法，制備飼養(yǎng)層的3T3細(xì)胞較J2細(xì)胞容易獲得，且在其培養(yǎng)的過程中細(xì)胞濃度與狀態(tài)容易控制。用于培養(yǎng)人原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞時，能更好地促進(jìn)原代腫瘤細(xì)胞的生長，獲得更高比例的人腫瘤干細(xì)胞（CD44陽性細(xì)胞數(shù)提高約80%）。
【專利說明】細(xì)胞飼養(yǎng)層及其在培養(yǎng)人原代腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)胞飼養(yǎng)層，及其制備方法，以及在培養(yǎng)人原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前常用的人腫瘤干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法多采用無血清懸浮培養(yǎng)法，從細(xì)胞株中對含量極少的干細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)或者直接購買干細(xì)胞株進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，而通過原代腫瘤細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的方法較難成功分離培養(yǎng)人腫瘤干細(xì)胞。
[0003]飼養(yǎng)層在細(xì)胞培養(yǎng)中的使用情況:國外有報道使用J2 (3T3細(xì)胞的一種亞型)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)，但未提及使用其進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)。而且，J2細(xì)胞在作為飼養(yǎng)層的過程中需要嚴(yán)格控制其濃度與狀態(tài)，不易操作，且目前在國內(nèi)購買不到。
[0004]目前常用的飼養(yǎng)層制備方法:多采用Co60或者絲裂霉素處理細(xì)胞制備飼養(yǎng)層，存在以下缺陷:目前國內(nèi)較難找到Co60放射源；使用絲裂霉素處理飼養(yǎng)層，不同廠家不同批號的絲裂霉素效價濃度較難把握，且存在耐藥細(xì)胞，甚至致纖維細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷與不足，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞飼養(yǎng)層，及其制備方法，以及在培養(yǎng)人原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞中的應(yīng)用。 [0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種細(xì)胞飼養(yǎng)層，通過以下方法制備得到:采用DMEM培養(yǎng)基(現(xiàn)有技術(shù)中已有的通用常規(guī)培養(yǎng)基)培養(yǎng)BALB3T3細(xì)胞，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)至鋪滿培養(yǎng)瓶70%~80%時，選細(xì)胞生長狀態(tài)好的培養(yǎng)瓶進(jìn)行照射(按照30%的底面積濃度接種，一般底面積為25cm2的培養(yǎng)瓶2天能夠達(dá)到所需細(xì)胞量)，以2900~3100cGy (優(yōu)選3000cGy)作為放射劑量進(jìn)行X線照射(照射時儀器從O開始加量，達(dá)到需要的放射劑量立即停止)；照射后的細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中，改用改良F培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為常規(guī)培養(yǎng)條件，比如:保持溫度37°C，CO2濃度為5%)(此時使用改良F培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的目的是:促進(jìn)BALB3T3細(xì)胞釋放一些有利于人原代腫瘤細(xì)胞或者腫瘤干細(xì)胞生長所需要的物質(zhì)，以便于接種之人原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞更好地生長)；培養(yǎng)8小時后，所得培養(yǎng)物可用作細(xì)胞飼養(yǎng)層。制備好的飼養(yǎng)層在一周之內(nèi)都可使用，超過一周應(yīng)以同樣方法重新制備。若照射后的BALB3T3細(xì)胞暫時不作為細(xì)胞飼養(yǎng)層使用，也可收集凍存或用原DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待使用前8小時左右再換成改良F培養(yǎng)基制備細(xì)胞飼養(yǎng)層。
[0008]所述改良F培養(yǎng)基的配方為:DMEM/High Glucose (DMEM高糖培養(yǎng)基)33.33ml ；HAM’ S/F-12培養(yǎng)基66.67ml ;植物源重組人血清白蛋白(Oryzogen，購自武漢禾元生物科技有限公司)3~5mg/mL ;青霉素100U/ml ;鏈霉素100 μ g/ml ;兩性霉素B2.5 μ g/mL ;氫化可的松0.2~0.5 μ g/ml ;胰島素3~6 μ g/ml ;霍亂毒素B6~10ng/ml ;人表皮生長因子EGF9~12ng/ml ;腺嘌呤22~25 μ g/ml ;Y_27632 (Rho相關(guān)的卷曲蛋白激酶抑制劑)7~9 μ mol/L。如表1所示。
[0009]優(yōu)選的，所述改良F培養(yǎng)基的配方為:DMEM/High Glucose (DMEM高糖培養(yǎng)基)33.33ml ;HAM’S/F-12培養(yǎng)基66.67ml ;植物源重組人血清白蛋白(Oryzogen，購自武漢禾元生物科技有限公司)5mg/mL ;青霉素100U/ml ;鏈霉素100 μ g/ml ;兩性霉素B2.5 μ g/mL ;氫化可的松0.4 μ g/ml ;胰島素5 μ g/ml ;霍亂毒素B8.4ng/ml ;人表皮生長因子EGF10ng/ml ；腺嘌呤24 μ g/ml ；Y-27632 (Rho相關(guān)的卷曲蛋白激酶抑制劑)7 μ mol/L。
[0010]表1改良的F細(xì)胞培養(yǎng)液成分及含量
[0011]
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞飼養(yǎng)層，通過以下方法制備得到:采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)BALB3T3細(xì)胞，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)至鋪滿培養(yǎng)瓶70%~80%時，進(jìn)行照射。以3000cGy作為放射劑量進(jìn)行X線照射；照射后改用改良F培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)8小時后，所得培養(yǎng)物即為細(xì)胞飼養(yǎng)層。制備好的飼養(yǎng)層在一周之內(nèi)都可使用，超過一周應(yīng)以同樣方法重新制備。若照射后的BALB3T3細(xì)胞暫時不作為細(xì)胞飼養(yǎng)層使用，也可收集凍存或用原DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待使用前8小時左右再換成改良F培養(yǎng)基制備細(xì)胞飼養(yǎng)層； 所述改良F培養(yǎng)基的配方為:DMEM/High Glucose (DMEM高糖培養(yǎng)基)33.33ml ；HAM’ S/F-12培養(yǎng)基66.67ml ;植物源重組人血清白蛋白3~5mg/mL ;青霉素100U/ml ;鏈霉素100 μ g/ml ;兩性霉素B2.5 μ g/mL ;氫化可的松0.2~0.5 μ g/ml ;胰島素3~6 μ g/ml ;霍亂毒素B6~10ng/ml ;人表皮生長因子EGF9~12ng/ml ;腺嘌呤22~25 μ g/ml ；Y-276327 ~9ymol/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞飼養(yǎng)層，其特征在于:所述放射劑量為3000cGy。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞飼養(yǎng)層，其特征在于:所述進(jìn)行X線照射的具體方式為:照射時儀器從O開始加量，達(dá)到需要的放射劑量立即停止。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞飼養(yǎng)層，其特征在于:所述采用改良F培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為:保持溫度37°C，CO2濃度為5%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞飼養(yǎng)層，其特征在于:所述改良F培養(yǎng)基的配方為:DMEM/High Glucose (DMEM 高糖培養(yǎng)基)33.33ml ;HAM’ S/F-12 培養(yǎng)基 66.67ml ;植物源重組人血清白蛋白5mg/mL ;青霉素100U/ml ;鏈霉素100 μ g/ml ;兩性霉素B2.5 μ g/mL ;氫化可的松0.4 μ g/ml ;胰島素5 μ g/ml ;霍亂毒素B8.4ng/ml ;人表皮生長因子EGF10ng/ml ;腺嘌呤 24 μ g/ml ;Y-276327 μ mol/L。
6.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備方法，其特征在于:采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)BALB3T3細(xì)胞，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)至鋪滿培養(yǎng)瓶70%~80%時，進(jìn)行照射。以3000cGy作為放射劑量進(jìn)行X線照射；照射后改用改良F培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)8小時后，所得培養(yǎng)物即為細(xì)胞飼養(yǎng)層。 所述改良F培養(yǎng)基的配方為:DMEM/High Glucose (DMEM高糖培養(yǎng)基)33.33ml ；HAM’ S/F-12培養(yǎng)基66.67ml ;植物源重組人血清白蛋白3~5mg/mL ;青霉素100U/ml ;鏈霉素100 μ g/ml ;兩性霉素B2.5 μ g/mL ;氫化可的松0.2~0.5 μ g/ml ;胰島素3~6 μ g/ml ;霍亂毒素B6~10ng/ml ;人表皮生長因子EGF9~12ng/ml ;腺嘌呤22~25 μ g/ml ；Y-276327 ~9μ mol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備方法，其特征在于:所述放射劑量為3000cGy。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備方法，其特征在于:所述改良F培養(yǎng)基的配方為:DMEM/High Glucose(DMEM高糖培養(yǎng)基)33.33ml ;HAM’S/F-12 培養(yǎng)基66.67ml ;植物源重組人血清白蛋白5mg/mL ;青霉素100U/ml ;鏈霉素100 μ g/ml ;兩性霉素B2.5 μ g/mL ；氫化可的松0.4 μ g/ml ;胰島素5 μ g/ml ;霍亂毒素B8.4ng/ml ;人表皮生長因子EGFlOng/ml ;腺嘌呤 24 μ g/ml ;Y_276327 μ mol/L。
9.權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng) 所述的細(xì)胞飼養(yǎng)層在培養(yǎng)人原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述人原代腫瘤細(xì)胞包括人原代結(jié)腸癌細(xì)胞。
【文檔編號】C12N5/095GK103898043SQ201410088260
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】孫青 , 賈茹, 張建東, 岳龍濤 申請人:山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院