專利名稱:輪狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)方法
輪狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及輪狀病毒,特別涉及一種輪狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)方法。背景技術(shù):
輪狀病毒(Rotavirus,RV)屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬,是各種幼齡動(dòng)物非細(xì) 菌性腹瀉的主要病原之一。RV基因由11個(gè)不連續(xù)的dsRNA節(jié)段組成,其平均長(zhǎng)度約為 660 3300bp,分別編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VPl,VP2, VP3, VP4, VP6, VP7)和5個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白 (NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5)。RV在電鏡下呈球形,無囊膜,由內(nèi)向外擁有核衣殼、內(nèi)衣 殼、外衣殼三層蛋白質(zhì)衣殼。根據(jù)RV群抗原的不同及病毒RNA末端指紋圖譜的分析,可將該 病毒共分為A G七個(gè)群;根據(jù)其中和抗原VP7的差異可將A組RV分為14個(gè)G型(Gl G14)及 21 個(gè) P 型(Pl P24)。輪狀病毒腹瀉是由RV引起的胃腸道感染性腹瀉,是流行廣泛的人獸共患病,也是 多種幼齡動(dòng)物與嬰幼兒的一種急性腸道傳染病。臨床上以嘔吐、腹瀉、脫水和酸堿平衡紊亂 為特征,主要發(fā)生于5歲以內(nèi)的兒童,是秋冬季引起小兒死亡的主要原因之一。幾乎所有兒 童在5歲以前都受到過RV感染。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年約有1. 11億-1. 35億例RV腹瀉病例, 導(dǎo)致65萬名嬰兒死亡。在我國(guó),每年也約有1800萬名嬰幼兒患RV感染性胃腸炎,死亡3-4 萬例。自從1968年在美國(guó)阿拉斯加州一農(nóng)場(chǎng)犢牛腹瀉病例中分離到牛輪狀病毒 (Bovine Rotavirus, BRV)后,隨后許多國(guó)家都有BRV感染的報(bào)道,我國(guó)亦有牛感染輪狀病 毒的報(bào)道。RV主要感染1 7日齡的犢牛,可引起犢牛消化道機(jī)能紊亂,感染牛、犬和豬往 往發(fā)生死亡,病死率可達(dá)50%。據(jù)報(bào)道英國(guó)犢牛RV腹瀉的發(fā)病率為60 80%,死亡率為 0 50%。該病發(fā)生于世界各地,主要造成犢牛腹瀉,給犢牛的生長(zhǎng)和生產(chǎn)帶來很大的經(jīng)濟(jì) 損失。目前尚無治療牛RV感染的特效藥物,常規(guī)治療效果不佳,因此仍以疫苗預(yù)防為 主。而細(xì)胞分離培養(yǎng)的成功與否是疫苗研制的關(guān)鍵之一。RV分離培養(yǎng)比較困難,應(yīng)用易感細(xì)胞并適當(dāng)處理是細(xì)胞培養(yǎng)RV的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。RV 的分離培養(yǎng)在最初多采用原代細(xì)胞,后來使用易感細(xì)胞系恒河猴腎傳代細(xì)胞(MA-104)。20 世紀(jì)80年代我國(guó)應(yīng)用MA-104細(xì)胞系分離到BRV,開始了 BRV的研究。國(guó)外己獲批準(zhǔn)的人用 輪狀病毒疫苗多采用非洲綠猴腎傳代細(xì)胞(Vero)或胎猴一倍體細(xì)胞(FIihL-幻培養(yǎng),一些 尚在研發(fā)中的疫苗也有采用原代猴腎細(xì)胞或雞胚細(xì)胞培養(yǎng)制備的疫苗。《中國(guó)藥典》規(guī)定原 代細(xì)胞可使用原始培養(yǎng)的細(xì)胞或傳了少數(shù)幾代的細(xì)胞,《中國(guó)生物制品規(guī)程》中規(guī)定輪狀病 毒疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)為原代或一代新生小牛腎細(xì)胞。由此可見,對(duì)于RV的細(xì)胞培養(yǎng)要求各不相同,而且培養(yǎng)的方法亦有差異,尤其是 人和動(dòng)物輪狀病毒對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性也不相同,BRV和豬輪狀病毒(PorcineRotaVirus,PRV) 對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性也不同。
發(fā)明內(nèi)容有鑒于此,為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明提供一種同時(shí)適用于人和動(dòng)物的輪狀 病毒的細(xì)胞培養(yǎng)方法。一種輪狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)方法,包括以下步驟以10%小牛血清加高糖DMEM作 為細(xì)胞生長(zhǎng)液,將輪狀病毒腹瀉病人或動(dòng)物糞便標(biāo)本用0. IM的IXPBS制成10%懸液,經(jīng) 50yg/mL胰酶在37°C下作用1小時(shí)后接種于MA-104羅猴腎細(xì)胞,在37°C下吸附Ih;以及 加含5 μ g/mL胰酶的無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液,37°C下5% C2O2轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)3 4天,CPE達(dá)到 90%時(shí)收獲細(xì)胞培養(yǎng)液,凍融2次,作為下一代培養(yǎng)的接種物培養(yǎng)傳代。本發(fā)明的輪狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)方法可適用于人或動(dòng)物,通過對(duì)糞便標(biāo)本的多次培 養(yǎng),效果可靠,重復(fù)性良好。
具體實(shí)施方式為更好地理解本發(fā)明,以下將結(jié)合具體實(shí)例對(duì)發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。如前文所述,通過對(duì)患病幼兒、犢牛、仔豬和仔犬等輪狀病毒陽(yáng)性糞便樣品的處理 與培養(yǎng),以期為研發(fā)快速準(zhǔn)確的診斷試劑盒和有效疫苗奠定基礎(chǔ),本發(fā)明提供一種輪狀病 毒的細(xì)胞培養(yǎng)方法。1.糞便樣本的采集與檢測(cè)采集動(dòng)物醫(yī)學(xué)臨床和養(yǎng)殖場(chǎng)疑似輪狀病毒性腹瀉的犢牛、仔豬和幼犬糞便樣本 68、58和35份,用輪狀病毒酶標(biāo)診斷試劑盒檢測(cè),檢測(cè)出陽(yáng)性樣本17、5和20例。同時(shí)使用 ELISA檢測(cè)的幼兒陽(yáng)性糞樣10份作為樣本。2.細(xì)胞株和標(biāo)準(zhǔn)病毒株采用羅猴腎細(xì)胞株(MA-104)、豬輪狀病毒參考株(AV-5Q及牛輪狀病毒參考株 (AV52, G6 血清型)。3.主要試劑與設(shè)備儀器采用的試劑包括小牛血清(Calf serum)、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基 (Dulbecco ‘ sModified Eagle Medium, DMEM)、胰蛋白酶(trypsin)、磷酸鹽緩沖液 (Phosphatebuffered saline,PBS)、谷氨酰胺(Glutamine)、0. 01mol/L PBS(pH 7.2), D-Hanks 液,聚乙二酉享(Polyethylene glycol)。采用的儀器有美國(guó)Rayto RT-6000全自動(dòng)酶標(biāo)儀、電熱恒溫培養(yǎng)箱、C2O2培養(yǎng)箱 及德國(guó)Leica顯微鏡。4.溶液及其培養(yǎng)基的制備4.1胰蛋白酶溶液用IXPBS配制成0.25%溶液,過濾除菌。4. 2DMEM(高糖)培養(yǎng)基將DMEM配制成9. 4g/L的培養(yǎng)基溶液或按照產(chǎn)品說明書。4. 3細(xì)胞生長(zhǎng)液A液為10 %胎牛血清+高糖DMEM培養(yǎng)液;B液為5 %小牛血清+高糖DMEM培養(yǎng) 液;C液為10%小牛血清+高糖DMEM培養(yǎng)液。在IOOmL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入87mL DMEM培養(yǎng)基溶液及IOmL血清,加入3%的谷氨酰胺、PBS及7. 5% NaHCO3溶液各lmL,再加入青霉素100U/mL、鏈霉素100 μ g/mL。4. 5細(xì)胞培養(yǎng)液甲液2μ g/mL 胰酶,DMEM ;乙液3 μ g/mL 胰酶,DMEM ;丙液5 μ g/mL 胰酶 DMEM0 甲、乙、丙液中均加入青霉素100IU/mL、鏈霉素100 μ g/mL。5.實(shí)驗(yàn)方法5.1樣本處理與檢測(cè)5. 1. 1制備10%的糞便樣本懸液取糞便樣本0.2g或200 μ L移至EP管中,加入IXPBS (0. 1M)標(biāo)本處理液,振蕩3 次,每次20s。然后靜置10min,8000r/min離心5min,吸取上清,用0. 22nm的膜過濾除菌, 制備10%成樣本懸液,或分裝后-20°C保存。5. 1.2樣本檢測(cè)取適量糞便樣本懸液,移入EP管中,在包被板的每個(gè)孔加入糞便樣本懸液50 μ L, 并設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照各兩孔及空白,每孔50 μ L。每孔再加入50 μ L酶結(jié)合物,空白除外。封口后37°C水浴30min,甩去板中液體,拍干。如此反復(fù)5次。每孔加入50 μ L底物A和50 μ L底物B,37°C水浴lOmin,再加入50 μ L終止液,震 蕩混勻。用酶標(biāo)儀測(cè)定OD45tl值。5. 1.3陽(yáng)性樣本處理經(jīng)ELISA檢測(cè)呈陽(yáng)性的樣本,用0. IM的IXPBS制成10%懸液,4°C下3000r/min, 離心20min,取上清,4°C下再10000r/min,離心30min,再取上清,加入青霉素、鏈霉素和慶 大霉素,混合后置4°C冰箱過夜。病毒懸液濾過除菌后,緩慢滴加濃度為400g/L的PEG6000, 至終濃度70g/L,調(diào)節(jié)至PH7.5,4°C冰箱過夜,即得到陽(yáng)性處理樣品(+)。另取ELISA檢測(cè)呈 陰性的樣品,經(jīng)上述步驟進(jìn)行處理,制成陰性處理樣品(_),作為對(duì)照。5. 2MA-104細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)取出細(xì)胞凍存管,于37°C溫水融化,放入IOmL細(xì)胞生長(zhǎng)液的培養(yǎng)瓶中,并用細(xì)胞 生長(zhǎng)液沖洗凍存管數(shù)次,5% C2O2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 池取出細(xì)胞瓶,倒去細(xì)胞生長(zhǎng)液,移入 13 15mL新細(xì)胞生長(zhǎng)液,再放入5% C2O2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將MA-104細(xì)胞分為三組,分別接種于含有IOmLA液、B液和C液的細(xì)胞生長(zhǎng) 液中,5% C2&37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng),每3 5d傳代1次;如此重復(fù),直至細(xì)胞長(zhǎng)到90%以上 進(jìn)行傳代。傳代時(shí)取長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞,用少量PBS溶液清洗細(xì)胞表面,加入胰酶消化液 ^iiL/75Cm2)37°C消化,觀察到大部分細(xì)胞腫脹、變圓時(shí),輕拍并翻轉(zhuǎn)細(xì)胞瓶,使細(xì)胞自瓶壁 脫落,補(bǔ)充適量含10%小牛血清的DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)液,用吸管上下吹打數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán) 塊,混合均勻后,按1 :2比例移至新的細(xì)胞瓶中,5% C2O2,37 °C繼續(xù)培養(yǎng)。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,比較MA-104細(xì)胞在三種細(xì)胞生長(zhǎng)液中的生長(zhǎng) 情況,以選擇最佳細(xì)胞生長(zhǎng)液。表1. MA-104細(xì)胞在不同細(xì)胞生長(zhǎng)液的生長(zhǎng)情況
權(quán)利要求
1. 一種輪狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)方法,包括以下步驟以10%小牛血清加高糖DMEM作為細(xì)胞生長(zhǎng)液,將輪狀病毒腹瀉病人或動(dòng)物糞便標(biāo)本 用0. IM的IXPBS制成10%懸液,經(jīng)50 μ g/mL胰酶在37°C下作用1小時(shí)后接種于MA-104 羅猴腎細(xì)胞,在37°C下吸附Ih ;以及加含5 μ g/mL胰酶的無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液,37°C下5% C2O2轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)3 4天,CPE 達(dá)到90%時(shí)收獲細(xì)胞培養(yǎng)液,凍融2次,作為下一代培養(yǎng)的接種物培養(yǎng)傳代。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種輪狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)方法,包括以下步驟以10%小牛血清加高糖DMEM作為細(xì)胞生長(zhǎng)液,將輪狀病毒腹瀉病人或動(dòng)物糞便標(biāo)本用0.1M的1×PBS制成10%懸液,經(jīng)50μg/mL胰酶在37℃下作用1小時(shí)后接種于MA-104羅猴腎細(xì)胞,在37℃下吸附1h;以及加含5μg/mL胰酶的無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液,37℃下5%C2O2轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)3~4天,CPE達(dá)到90%時(shí)收獲細(xì)胞培養(yǎng)液,凍融2次,作為下一代培養(yǎng)的接種物培養(yǎng)傳代。本發(fā)明的輪狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)方法可適用于人或動(dòng)物,通過對(duì)糞便標(biāo)本的多次培養(yǎng),效果可靠,重復(fù)性良好。
文檔編號(hào)C12N7/00GK102120986SQ20101056396
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者何麗, 馮若飛, 宋昌軍, 鞏轉(zhuǎn)娣, 魏鎖成 申請(qǐng)人:魏鎖成