改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法。具體地，本發(fā)明涉及在反應(yīng)器中于細(xì)胞培養(yǎng)基中于懸浮液中培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選E1-永生化的HER細(xì)胞，更優(yōu)選PER.C6細(xì)胞的工藝，其中，細(xì)胞產(chǎn)生生物物質(zhì)，優(yōu)選產(chǎn)生抗體，其中，向細(xì)胞培養(yǎng)物補(bǔ)料至少一種細(xì)胞培養(yǎng)基組分，并且，其中，包含細(xì)胞、生物物質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物在分離系統(tǒng)上循環(huán)，并且，其中，所述分離系統(tǒng)將生物物質(zhì)與比所述生物物質(zhì)分子量更低的物質(zhì)分開，并且，其中，所述生物物質(zhì)保留在反應(yīng)器中或被回送進(jìn)反應(yīng)器。優(yōu)選地，更低分子量的物質(zhì)的一部分持續(xù)從細(xì)胞培養(yǎng)物中移出。
【專利說明】改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法
[0001] 本申請是中國發(fā)明專利申請No. 200780026810. 2的分案申請。母案申請日為2007 年7月4日，發(fā)明題目為"改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法"。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及在反應(yīng)器中于細(xì)胞培養(yǎng)基中于懸浮液中培養(yǎng)細(xì)胞的工藝。

【背景技術(shù)】
[0003] 此類工藝?yán)鐝腤004/099396已知。該文中描述了如何通過優(yōu)化補(bǔ)料分批工藝中 的生長條件來提高細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞密度和想要的生物材料的產(chǎn)率。
[0004] 此外，W005/095578公開了一種培養(yǎng)細(xì)胞的工藝，其通過對包含細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞 的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行連續(xù)灌注培養(yǎng)來實現(xiàn)，其中，向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng) 物在包含中空纖維的過濾器模塊上循環(huán)，導(dǎo)致產(chǎn)生比細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞密度更低的液體流出 物，并且過濾器模塊內(nèi)部的流是交互切向流（alternating tangential flow),其中，所述 細(xì)胞產(chǎn)生生物物質(zhì)。在W005/095578的實施例中顯示，生產(chǎn)了 0. 9g/L/天的產(chǎn)物，這對應(yīng)于 流出物中大約0. 3g/L的產(chǎn)物濃度。
[0005] 含生物物質(zhì)的液體體積越大，對生物物質(zhì)的純化就越費力。W004/099396和 W005/095578公開的工藝中，獲得的生物物質(zhì)的濃度并不高。因此，對該生物物質(zhì)的下游 加工是麻煩的，因為需要在應(yīng)用后續(xù)純化步驟之前對生物物質(zhì)加以濃縮，或者需要對大 體積、低濃度的生物物質(zhì)加以純化。因此，以較低的細(xì)胞密度培養(yǎng)細(xì)胞導(dǎo)致體積生產(chǎn)力 (productivity)較低，因此對給定的生產(chǎn)水平需要更大和/或更多的培養(yǎng)容器以及由此需 要在裝備上投入更多。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種工藝，其中，以更高的濃度從細(xì)胞培養(yǎng)物獲得 產(chǎn)物。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是使得能夠在延長的時間段內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞和生產(chǎn)生物材料。
[0008] 這些目的通過在反應(yīng)器中于細(xì)胞培養(yǎng)基中于懸浮液中培養(yǎng)細(xì)胞的如下工藝來實 現(xiàn)，其中，所述細(xì)胞產(chǎn)生生物物質(zhì)，其中，向細(xì)胞培養(yǎng)物補(bǔ)料至少一種細(xì)胞培養(yǎng)基組分，并 且，其中，包含細(xì)胞、生物物質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物在分離系統(tǒng)上循環(huán)，并且，其中， 所述分離系統(tǒng)將生物物質(zhì)與比所述生物物質(zhì)分子量更低的物質(zhì)分開，并且，其中，所述生物 物質(zhì)保留在反應(yīng)器中或被回送進(jìn)反應(yīng)器。

【具體實施方式】
[0009] 例如，本發(fā)明涉及在反應(yīng)器中于細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的工藝，其中，所述細(xì)胞產(chǎn) 生生物物質(zhì)，其中，向所述反應(yīng)器補(bǔ)料營養(yǎng)物和/或細(xì)胞培養(yǎng)基，并且，其中，包含細(xì)胞和細(xì) 胞培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物在孔徑或分子量分離點在5至500kD之間的過濾器上循環(huán)。
[0010] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過使用將生物物質(zhì)與分子量比生物物質(zhì)低的物質(zhì)相分離的分離系 統(tǒng)，可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中以更高濃度積累生物物質(zhì)。
[0011] 因此，本發(fā)明不同于現(xiàn)有技術(shù)描述的細(xì)胞培養(yǎng)，其允許想要的生物材料與細(xì)胞物 質(zhì)一起積累。
[0012] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式中，更低分子量的物質(zhì)的一部分持續(xù)從細(xì)胞培養(yǎng) 物中移出。
[0013] 本發(fā)明的工藝的另一優(yōu)點在于，較之例如分批或補(bǔ)料分批工藝，可以達(dá)到更高的 存活細(xì)胞濃度。此外，較之例如分批或補(bǔ)料分批工藝，生產(chǎn)時間（即細(xì)胞產(chǎn)生生物物質(zhì)的時 間段）可被延長。此外，較之分批或補(bǔ)料分批工藝，有可能使用更小的反應(yīng)器。使用更小的 反應(yīng)器是有益的，因為這降低了裝備和設(shè)施相關(guān)的投入。
[0014] 此外，可在更短的時間內(nèi)獲得更高濃度的生物物質(zhì)。
[0015] 我們發(fā)現(xiàn)，可在反應(yīng)器內(nèi)獲得高濃度的生物物質(zhì)，而不會顯著減少細(xì)胞存活性以 及因此不需限制生產(chǎn)時間。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能預(yù)計到，將可能發(fā)生產(chǎn)物抑制，即，生物物 質(zhì)自身對生物物質(zhì)生產(chǎn)的抑制，或者細(xì)胞產(chǎn)生的其它大分子（例如，宿主細(xì)胞蛋白、酶或細(xì) 胞殘骸）造成的抑制。此外，我們發(fā)現(xiàn)，想要的生物材料的積累不會損害分離系統(tǒng)的功能。
[0016] 本發(fā)明的工藝在細(xì)胞密度、細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)物濃度以及延長的培養(yǎng)時間等方面， 較之根據(jù)W005/095578和W004/099396的工藝提供了相當(dāng)大的好處。由此，本發(fā)明的工藝 導(dǎo)致了對想要的生物材料的改進(jìn)的生產(chǎn)。
[0017] 可用于生產(chǎn)生物物質(zhì)的細(xì)胞原則上是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的能生產(chǎn)生物產(chǎn) 物的所有細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是真核的，例如，有絲真菌，例如，Aspergillus niger、 Aspergillus oryzae、Trichoderma reesei、Penicillium chrysogenum,酵母，例如 Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces lactis、Phaffia rhodozyma,來自 Pichia 屬的酵母，例如，Pichia pastoris，或原核的，例如，Escherichia coli、Bacillus sp, 例 如，B. licheniformis、B. subtilis、B. amylolipuefaciens、B. alkalophilus、 Streptomycessp.、Corynebacterium glutamicum、Pseudomonassp。真核細(xì)胞的例子還例如 描述于 Chu，L. , Robinson，D. K.，（2001) Curr. Opinion Biotechn.，vol. 12, P. 180-187 中。 優(yōu)選地，用于本發(fā)明工藝中的細(xì)胞是動物細(xì)胞，特別是哺乳動物細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞的例子 包括CHO(中華倉鼠卵巢）細(xì)胞、雜交瘤、BHK(幼倉鼠腎）細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、人細(xì)胞（例如 ΗΕΚ-293細(xì)胞、人淋巴母細(xì)胞）、E1永生化的HER細(xì)胞、小鼠細(xì)胞（例如NSO細(xì)胞）。更優(yōu)選 地，使用El永生化的HER細(xì)胞，最優(yōu)選使用PER. C6細(xì)胞。
[0018] 可從胎兒分離初級人胚視網(wǎng)膜（HER)細(xì)胞（Byrd P，Brown KW，Gallimore PH.1982.Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA. Nature 298 :69-71, Byrd PJ, Grand RJA, Gallimore PH. 1988. Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus El regions and combinations of ElA+ras. Oncogene 2 :477-484) 〇 培養(yǎng)若干傳代后， 初級細(xì)胞將死亡。就本發(fā)明的目的而言，El永生化的HER細(xì)胞得自初級HER細(xì)胞，這是通 過在其中表達(dá)編碼腺病毒ElA和ElB蛋白的DNA，來獲得永生化細(xì)胞的。這類經(jīng)永生化的 細(xì)胞可培養(yǎng)超過100次傳代。用于獲得El永生化HER細(xì)胞的方法例如已被描述于美國專 利 5, 994, 128,描述于 Byrd P，Brown KW，Gallimore PH. 1982 Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA. Nature 298 :69-71, 描述于 Byrd PJ, Grand RJA, Gallimore PH. 1988. Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus El regions and combinations of ElA+ras. Oncogene 2 :477-484,且描述于 Gallimore, P.H. , Grand, R.J. A. and Byrd, P. J. (1986). Transformation of human embryo retinoblasts with simian virus 40, adenovirus and ras oncogenes. AntiCancer Res. 6，p499_508 中。例如，通過用含腺病毒 血清型5 (Ad5) ElA-和ElB-編碼序列（Ad5核苷酸459-3510)的質(zhì)粒（處于人磷酸甘油酸激 酶（"PGK"）啟動子控制下）轉(zhuǎn)染初級HER細(xì)胞，來產(chǎn)生永生化的HER細(xì)胞，包括PER. C1、 PER. C3、PER. C4、PER. C5、PER. C6、PER. C8 和 PER. C9 細(xì)胞（見，美國專利 5, 994, 128)。
[0019] 在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明工藝中的細(xì)胞是El-永生化的HER細(xì)胞，更優(yōu)選 地,是PER. C6細(xì)胞（見美國專利5, 994, 128)。PER. C6細(xì)胞的例子是以ECACC No. 96022940 保藏的細(xì)胞（見，例如，美國專利5, 994, 128、EP 0833934 BI)。
[0020] 在本發(fā)明的工藝中，可以在懸浮液中對任何形式的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，例如，作為被固 定的細(xì)胞、單個細(xì)胞或在細(xì)胞簇中或者作為其組合。優(yōu)選地，細(xì)胞作為單個細(xì)胞和/或作為 不超過100個細(xì)胞（更優(yōu)選不超過20個細(xì)胞）的小細(xì)胞簇被培養(yǎng)。細(xì)胞例如可被固定到 微載體上，例如，可從例如GE Healthcare商業(yè)獲得的微載體（Cytodex)。
[0021] 反應(yīng)器在本文中被定義為包含細(xì)胞培養(yǎng)物的系統(tǒng)，所述細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)而包含細(xì)胞 和細(xì)胞培養(yǎng)基。其優(yōu)選提供無菌屏障，例如空氣過濾器，以防止其它細(xì)胞污染想要的細(xì)胞， 并且，其通過提供正確的培養(yǎng)條件（例如，混合、溫度、pH、氧濃度等）來保持對細(xì)胞有利的 環(huán)境。
[0022] 反應(yīng)器例如可以是更為永久的性質(zhì)的，例如，反應(yīng)器可以是不銹鋼或玻璃的，或者 例如可以是可棄置的，例如，反應(yīng)器可以是塑料瓶或塑料袋。適合用于本發(fā)明的反應(yīng)器的 例子包括但不限于：攪拌槽容器、空運用（airlift)容器和可棄置容器，它們可通過搖動、 振蕩運動或攪拌來進(jìn)行混合。優(yōu)選使用可棄置（生物）反應(yīng)器，因為它們僅需要相對低的 投資成本，具有強(qiáng)大的操作靈活性、短的周轉(zhuǎn)時間，并且易于針對工藝對其加以配置?？蓷?置（生物）反應(yīng)器可商業(yè)獲得，例如從Hyclone、Sartorius、Applikon或Wave獲得。
[0023] 術(shù)語"分離系統(tǒng)"在本發(fā)明上下文中被定義為能基于分子量進(jìn)行分離的系統(tǒng)。用 于本發(fā)明工藝中的分離系統(tǒng)能將生物物質(zhì)與分子量比所述生物物質(zhì)低的物質(zhì)分開。換句話 說，分子量分離點被選擇為：使得所述分子量分離點（MWCO)小于所述生物物質(zhì)的分子量， 更優(yōu)選以至少2的因子，最優(yōu)選以至少3的因子小于所述生物物質(zhì)的分子量。典型地，分離 系統(tǒng)的MWCO優(yōu)選為至少5kDa，更優(yōu)選至少IOkDa,最優(yōu)選至少30kDa，優(yōu)選至多500kDa，更 優(yōu)選至多300kDa，最優(yōu)選至多IOOkDa,但是當(dāng)然這將取決于本發(fā)明的工藝所生產(chǎn)的生物物 質(zhì)的分子量。例如，對于分子量為150kDa的IgG來說，具有至多50kDa的MWCO的分離系統(tǒng) 是最優(yōu)選的。
[0024] 分離系統(tǒng)的例子包括但不限于：過濾器、離心機(jī)和水性兩相萃取系統(tǒng)。
[0025] 術(shù)語"過濾器"在本文中使用時表示包括具有基于分子量或大小來分離顆粒的能 力的所有設(shè)備。原則上，在本發(fā)明的工藝中，任何過濾器都可使用，只要選用的孔徑或MWCO 能使得生物物質(zhì)與分子量比生物物質(zhì)低的物質(zhì)分開即可，典型地，這將是5至500kDa之間 的MWCO或孔徑。適合用于本發(fā)明的過濾器的例子包括膜過濾器、陶瓷過濾器和金屬過濾 器。過濾器可以以任何形式來使用，過濾器可以例如是螺旋卷繞狀（spiral wound)或管狀 的，或者可以以片狀形式使用。優(yōu)選地，在本發(fā)明的工藝中，所用的過濾器是膜過濾器，優(yōu)選 地，中空纖維過濾器。術(shù)語"中空纖維"表示管狀的膜。所述管的內(nèi)徑為至少0.1mm，更優(yōu)選 為至少0· 5mm，最優(yōu)選為至少0· 75mm，優(yōu)選地，管的內(nèi)徑至多10mm，更優(yōu)選至多6mm，最優(yōu)選 至多1mm。包含中空纖維的過濾器模塊可從例如General Electric(GE，以前的Amersham) 商業(yè)獲得。
[0026] 通過將包含生物物質(zhì)、細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物在分離系統(tǒng)上循環(huán)，生物 物質(zhì)和細(xì)胞留在反應(yīng)器中，液體流出物因此比具有比細(xì)胞培養(yǎng)物更低的生物物質(zhì)含量和更 低的細(xì)胞密度。通常，在本發(fā)明的工藝中，液體流出物不含或很少含任何生物物質(zhì)和細(xì)胞。 通常，液體流出物基本上僅含分子量比所述生物物質(zhì)低的組分。因此，基本上所有細(xì)胞和基 本上所有生物物質(zhì)通常都留在反應(yīng)器中。
[0027] 優(yōu)選地，過濾器的孔徑或MWCO被選擇為：使得過濾器的孔徑或MWCO比產(chǎn)物的直徑 或分子量要小，更優(yōu)選以至少2的因子，最優(yōu)選至少3的因子小，以確保產(chǎn)物的高駐留。典型 地，分離系統(tǒng)的孔徑或MWCO優(yōu)選為至少5kDa，更優(yōu)選至少IOkDa,最優(yōu)選至少30kDa，和/或 所述過濾器/膜的孔徑或MWCO優(yōu)選至多500kDa，更優(yōu)選至多300kDa，最優(yōu)選至多IOOkDa, 但是當(dāng)然這將取決于本發(fā)明的工藝所生產(chǎn)的生物物質(zhì)的分子量。
[0028] 分子量分尚點（MWCO)表不：分子量大于其的顆粒中至少90%都留在分尚系統(tǒng)中。
[0029] 將細(xì)胞培養(yǎng)物在分離系統(tǒng)（例如過濾器）上循環(huán)表示：細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)過分離系統(tǒng) (例如過濾器），產(chǎn)生液體流出物和其中內(nèi)含物被保持在反應(yīng)器中或回送進(jìn)反應(yīng)器的流。其 中內(nèi)含物被保持在反應(yīng)器中或回送進(jìn)反應(yīng)器的流通?；旧蟽H含分子量至少等于生物物 質(zhì)或分子量更高的組分，因此所述的流將比液體流出物包含更多的生物物質(zhì)。
[0030] 原則上，在本發(fā)明的工藝期間，細(xì)胞培養(yǎng)物何時在分離系統(tǒng)上循環(huán)并非關(guān)鍵。細(xì)胞 培養(yǎng)物的循環(huán)可例如從工藝開始時直接開始，或者當(dāng)細(xì)胞的存活細(xì)胞密度達(dá)到某個水平時 才開始。
[0031] 細(xì)胞培養(yǎng)物在過濾器上的循環(huán)可以是相對過濾器表面來說基本垂直的流，這也被 稱為盡頭（dead-end)流，或其可以是與過濾器表面基本平行的流，這也被稱為切向流，例 如單向切向流（TFF)或交叉流（cross-flow)。交叉流的一種優(yōu)選例子是交互切向流（ATF)， 因為采用ATF時發(fā)現(xiàn)，不會（迅速）發(fā)生過濾器阻塞，即使是在非常高的細(xì)胞密度下。通常 公知，在深度過濾中，需要通過漸進(jìn)的前過濾器來保護(hù)最后的小孔徑過濾器免受阻塞。該實 踐基于下述公知常識：具有較小孔或較小MWCO的的過濾器更容易阻塞，由此限制了生產(chǎn)時 間。如果使用ATF，那么就不必要使用前過濾器了。
[0032] 可通過移動細(xì)胞培養(yǎng)物，或者通過移動過濾器，或者移動兩者，來引導(dǎo)流。例如可 通過旋轉(zhuǎn)（旋轉(zhuǎn)式過濾器）或振動（振動式過濾器）來移動過濾器。或者，如果僅通過移 動細(xì)胞培養(yǎng)物來引導(dǎo)流，那么過濾器是靜止的，例如可以通過泵或壓力來移動細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0033] "交互切向流"表示，有一條與過濾器表面同樣方向（即，與其切向）的流，所述的 流往復(fù)運動，并且，還有一條與所述過濾器表面方向基本垂直的流。交互切向流可根據(jù)本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的方法來獲得（例如，如US 6, 544, 424所述）。
[0034] 在對細(xì)胞的培養(yǎng)期間，至少一種細(xì)胞培養(yǎng)基組分,例如,一種或多種營養(yǎng)物和/或 細(xì)胞培養(yǎng)基，可被補(bǔ)料給細(xì)胞。在根據(jù)本發(fā)明的工藝中，部分補(bǔ)充，或者優(yōu)選地，全部補(bǔ)充消 耗的營養(yǎng)物中的至少一種是有好處的，這通過將該營養(yǎng)物或這些營養(yǎng)物補(bǔ)料至反應(yīng)器來實 現(xiàn)。例如，可向反應(yīng)器補(bǔ)料完全細(xì)胞培養(yǎng)基，這是有好處的，因為這樣就無須再分別制備單 獨的補(bǔ)料了。細(xì)胞培養(yǎng)基例如還可以更濃縮的形式補(bǔ)料給細(xì)胞，這是有好處的，因為較小的 體積更易于操作。此外，可向反應(yīng)器補(bǔ)料一種或多種營養(yǎng)物。例如，碳水化合物，例如葡萄 糖或果糖；氨基酸，例如谷氨酰胺；和/或肽可有利地補(bǔ)料至反應(yīng)器。
[0035] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式中，選用這樣的細(xì)胞培養(yǎng)條件，使得細(xì)胞生長速 率和/或細(xì)胞的比生產(chǎn)力不受限制，更優(yōu)選地，使得細(xì)胞培養(yǎng)基組分中的至少一種的濃度 保持基本上恒定。限制細(xì)胞培養(yǎng)條件的例子是營養(yǎng)物限制和抑制性代謝物（例如氨、二氧 化碳和乳酸鹽）的形成。例如，細(xì)胞培養(yǎng)條件（例如，補(bǔ)料）可被選擇為：使得細(xì)胞生長速 率不受限制，這例如通過提供足夠的營養(yǎng)物以補(bǔ)償消耗和/或避免抑制性代謝物（例如如 酸鹽或氨）的產(chǎn)生來實現(xiàn)。例如，可選用通氣條件，使得二氧化碳形成不會限制細(xì)胞生長速 率。從Good Manufacturing Practice(GMP)的觀點來看，在非限制性條件下培養(yǎng)細(xì)胞是 高度有好處的，因為，1)這能提供恒定的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，在很多情況下還會提供恒定、良好 的產(chǎn)物品質(zhì)，以及2)這可導(dǎo)致高的細(xì)胞存活率，在一些情況下，導(dǎo)致細(xì)胞存活率超過98%。 高細(xì)胞存活率降低了細(xì)胞相關(guān)污染物（例如宿主細(xì)胞蛋白）的釋放，這有助于對產(chǎn)物的純 化。此外，以不受限制的細(xì)胞培養(yǎng)速率和/或不受限制的比生產(chǎn)力來培養(yǎng)細(xì)胞具有商業(yè)優(yōu) 點，從而得以在進(jìn)一步更短的時間內(nèi)生產(chǎn)出更多的生物物質(zhì)，因為，在所述工藝中可更早達(dá) 到更高的細(xì)胞密度。
[0036] 細(xì)胞的"比生產(chǎn)力"是每時間單位每個細(xì)胞產(chǎn)生的給定生物物質(zhì)的量，其通常被表 示為Pg.細(xì)胞H天'
[0037] 向細(xì)胞培養(yǎng)物添加至少一種細(xì)胞培養(yǎng)基組分（例如營養(yǎng)物和/或細(xì)胞培養(yǎng)基）的 速率（流入速率或灌注速率）影響細(xì)胞的存活性和密度。在本發(fā)明的工藝中，細(xì)胞培養(yǎng)基 組分（例如營養(yǎng)物和/或細(xì)胞培養(yǎng)基）可例如以連續(xù)的流、半連續(xù)的流（例如分步的流） 或間隔的（staggered)流來補(bǔ)料。優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基組分（例如營養(yǎng)物和/或細(xì)胞培養(yǎng) 基）以連續(xù)的流添加。
[0038] 細(xì)胞培養(yǎng)基組分，例如完全細(xì)胞培養(yǎng)基和/或營養(yǎng)物，原則上可以在所述工藝期 間的任何時候補(bǔ)料至反應(yīng)器。優(yōu)選地，補(bǔ)料在谷氨酰胺和葡萄糖等底物達(dá)到低至導(dǎo)致細(xì)胞 停止生長的水平前啟動，或在抑制性代謝物（例如乳酸鹽或氨）達(dá)到高至生長將停止的水 平前啟動。從該時起，細(xì)胞培養(yǎng)基組分（例如營養(yǎng)物和/或完全細(xì)胞培養(yǎng)基）優(yōu)選以使得 達(dá)到底物需求的速率補(bǔ)料至反應(yīng)器。
[0039] 在本發(fā)明的一種實施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基以根據(jù)式（1)的補(bǔ)料速率添加：
[0040] 補(bǔ)料速率=SFRX (總細(xì)胞培養(yǎng)物體積）X (存活細(xì)胞密度）（1)
[0041] 其中，補(bǔ)料速率以每天的升數(shù)表示，其中，SFR是比補(bǔ)料速率，S卩，以每時間單位相 對于每個存活細(xì)胞添加的培養(yǎng)基體積表示的細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)料至細(xì)胞培養(yǎng)物的速率，其中， 存活細(xì)胞密度是每體積單位存活細(xì)胞的數(shù)量。存活細(xì)胞的數(shù)量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來測 定，例如，通過臺盼藍(lán)（Trypan Blue)排除方法。比補(bǔ)料速率優(yōu)選被選擇為0.01至0.3nL/ 細(xì)胞/天之間，更優(yōu)選在〇. 01至〇. 2nL/細(xì)胞/天之間。
[0042] 調(diào)節(jié)補(bǔ)料速率時考慮到其它參數(shù)可能是有好處的，例如，向培養(yǎng)物補(bǔ)料的葡萄糖 的量和/或氧吸收速率。例如，對于PER. C6而言，細(xì)胞培養(yǎng)基和/或營養(yǎng)物的補(bǔ)料速率優(yōu) 選被選擇為：使得葡萄糖濃度保持在3至20mmol/L之間，更優(yōu)選在5至15mmol/L之間。優(yōu) 選地，葡萄糖濃度為至少3mmol/L，更優(yōu)選至少5mmol/L，優(yōu)選至多20mmol/L，更優(yōu)選至多 15mmol/L〇
[0043] 在本發(fā)明的一種特別的實施方式中，至少一次從反應(yīng)器移出細(xì)胞培養(yǎng)物（包含細(xì) 胞、生物物質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)基），并向反應(yīng)器中加入液體（例如，細(xì)胞培養(yǎng)基或營養(yǎng)物補(bǔ)料）， 以補(bǔ)償細(xì)胞培養(yǎng)物的移出。細(xì)胞培養(yǎng)物的移出可導(dǎo)致更高細(xì)胞密度下進(jìn)行更長的處理時 間，并且組合高的細(xì)胞存活率，這導(dǎo)致了更高的生產(chǎn)力。細(xì)胞培養(yǎng)物可連續(xù)或分步移出。
[0044] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式中，只要達(dá)到想要的細(xì)胞密度，例如，至少 10 X IO6個存活細(xì)胞/ml，優(yōu)選至少20 X IO6個存活細(xì)胞/ml，更優(yōu)選至少30 X IO6個存活細(xì) 胞/ml，例如，至多200 X IO6個存活細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度，就從反應(yīng)器中移出細(xì)胞培養(yǎng)物（包 含細(xì)胞、生物物質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)基），并且向反應(yīng)器中加入液體（例如細(xì)胞培養(yǎng)基或營養(yǎng)物補(bǔ) 料），以補(bǔ)償細(xì)胞培養(yǎng)物的移出。優(yōu)選地，以使得細(xì)胞密度保持在想要的細(xì)胞密度范圍內(nèi)的 速率來移出細(xì)胞培養(yǎng)物。較之傳統(tǒng)的分批或補(bǔ)料分批工藝，本發(fā)明的該實施方式是高度有 利的，因為其將本發(fā)明工藝的優(yōu)點與可被保持更長時間的高存活率組合起來，使得得以實 現(xiàn)進(jìn)一步更高的總體積生產(chǎn)力。"體積生產(chǎn)力"表示每單位時間每單位反應(yīng)器體積產(chǎn)生的生 物物質(zhì)的量，其通常被表示為g.L'天'較之傳統(tǒng)灌注工藝，本發(fā)明的該實施方式是高度 有好處的，因為其將本發(fā)明工藝的優(yōu)點和具有高濃度生物物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物移出流組合到 一起。細(xì)胞培養(yǎng)物移出流中高濃度的生物物質(zhì)使得從其中收獲生物物質(zhì)具有商業(yè)價值。在 其中移出細(xì)胞培養(yǎng)物的傳統(tǒng)灌注工藝中，細(xì)胞培養(yǎng)物移出流含有的生物物質(zhì)并不足以使得 收獲所述生物物質(zhì)具有商業(yè)價值，因此細(xì)胞培養(yǎng)物移出流通常被認(rèn)為是廢料。因此，本發(fā)明 的該實施方式中，理論上可以以直接、經(jīng)濟(jì)可行且簡單的方式收獲產(chǎn)生的所有生物物質(zhì)。
[0045] 在本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的實施方式中，選用這樣的細(xì)胞培養(yǎng)條件，使得細(xì)胞的 細(xì)胞生長速率和/或比生產(chǎn)力不受限制，更優(yōu)選地，還使得細(xì)胞培養(yǎng)基的至少一種組分（例 如葡萄糖或谷氨酰胺）的濃度保持恒定，并且，只要達(dá)到想要的細(xì)胞密度，至少進(jìn)行一次從 反應(yīng)器移出細(xì)胞培養(yǎng)物的操作，并且，向反應(yīng)器加入液體（例如細(xì)胞培養(yǎng)基），以補(bǔ)償細(xì)胞 培養(yǎng)物的移出。
[0046] 優(yōu)選地，流出物的速率被選擇為：使得其與至少一種細(xì)胞培養(yǎng)基組分（例如營養(yǎng) 物和/或細(xì)胞培養(yǎng)基）的添加速率減去任選的細(xì)胞培養(yǎng)基移出速率基本等同。
[0047] 產(chǎn)生生物物質(zhì)的細(xì)胞例如是能表達(dá)編碼生物物質(zhì)的基因的細(xì)胞?？衫缤ㄟ^用 含有編碼生物物質(zhì)的基因和編碼合適的選擇標(biāo)記的基因（例如，編碼新霉素抗性的基因 (Neo標(biāo)記基因））的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而制備能表達(dá)編碼生物物質(zhì)的基因的細(xì)胞。然后 可通過選擇壓力來選出經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，例如，在Neo標(biāo)記基因的情況下，通過在存在 G418 (genericin)的情況下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以及針對展示出生物物質(zhì)高水平表達(dá)的細(xì)胞 對細(xì)胞加以立即篩選。用于制備表達(dá)蛋白的El-永生化HER細(xì)胞的克隆的方法以及用于培 養(yǎng)此類細(xì)胞以生產(chǎn)所述蛋白的方法都是技術(shù)人員公知的，例如可在US 6, 855, 544中找到。
[0048] 可通過細(xì)胞產(chǎn)生的生物物質(zhì)，例如通過表達(dá)編碼（重組）基因編碼來產(chǎn)生的生物 物質(zhì)，因此例如是（重組）蛋白，特別是受體、酶、融合蛋白、血蛋白（例如來自凝血級聯(lián)的 蛋白）、多功能蛋白（例如促紅細(xì)胞生成素）、病毒或細(xì)菌蛋白（例如用于疫苗的）、免疫球 蛋白（例如抗體，例如IgG或IgM)等；優(yōu)選地，通過細(xì)胞產(chǎn)生蛋白，更優(yōu)選地，產(chǎn)生抗體。優(yōu) 選地，通過細(xì)胞產(chǎn)生的生物物質(zhì)，例如蛋白或疫苗可用作為藥物制劑中的活性成分。在本發(fā) 明的上下文中，術(shù)語"產(chǎn)物"和"生物物質(zhì)"可交換使用。
[0049] 在本發(fā)明的上下文中，藥物制劑表示可用作為藥品（特別是用于人的藥品）的任 何制劑。此類藥品可以例如用于診斷或用于預(yù)防目的（例如，疫苗）和/或用于治療目的， 例如患者缺乏的酶或蛋白，或者用于殺死不想要的細(xì)胞的抗體。藥物制劑還可含有可藥用 載體或賦形劑，它們的例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0050] PER. C6細(xì)胞系可用于生產(chǎn)生物物質(zhì)，例如El-缺失的腺病毒（見，例如美國專利 6,994, 128 ;Nichols et al，2002， Propagation of adenoviral vectors ：use of PER. C6 cells. In ：Curiel D，Douglas JT, editors. Adenoviral vectors for gene therapy. San Diego :Elsevier.p 129-167)、其它病毒（見，例如，TO 01/38362)或重組蛋白（見， 例如美國專利 6, 855, 544;Yallop et al，2005，PER. C6 cells for the manufacture of biopharmaceutical proteins， Modern Biopharmaceuticals :Design， Development and Optimization,4Volumes, 779-807, Kkg Kniiblein (編輯））。
[0051] 可用作為藥物制劑中活性成分的蛋白的例子包括（括號內(nèi)是商品名）： Tenecteplase (TN Kase?)、（重組）抗血友病因子（ReFacto?)、淋巴母細(xì)胞干擾 素 a-nl (Wellferon?)、（重組）凝血因子（NovoSeven?)、Etanercept (Enbre 1?)、 Trastuzumab(Herceptin?) > Infliximab(Remicade?) > Palivizumab(Synagis?) > Basiliximab (Simulect?)、Daclizumab (Zenapaz?)、Rituximab (Rituxan?),(重組）凝血 因子 IX(Benefix?)和干擾素 β -la(Avonex?)。
[0052] 可用作為藥物制劑中活性成分的疫苗的例子包括：經(jīng)分離的蛋白抗原，其例子包 括但不限于活的、口服的、四價的輪狀病毒疫苗（RotaShield?)、狂犬病疫苗（RanAvert?)、 流感疫苗和滅活甲肝疫苗（VAQTA tm)。
[0053] 細(xì)胞培養(yǎng)基的pH、溫度、溶解氧濃度和同滲容摩（osmolarity)原則上并非關(guān)鍵， 它們?nèi)Q于所選用的細(xì)胞的類型。優(yōu)選地，pH、溫度、溶解氧濃度和同滲容摩被選擇為：使得 對于細(xì)胞的生長和生產(chǎn)力來說是最佳的。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何找到培養(yǎng)物的最佳pH、 溫度、溶解氧濃度和同滲容摩（見，例如WO 2004/099396)。優(yōu)選地，對于本發(fā)明的工藝而 言，當(dāng)使用El永生化的HER細(xì)胞時，選用6. 6至7. 6之間的pH，和/或選用30至39°C之間 的溫度和/或選用260至400m0sm/kg之間的同滲容摩。為保持最佳工藝條件，對工藝條件 控制的自動化是人們想要的。為了對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，例如為了獲得生長阻礙用于增加 細(xì)胞生產(chǎn)力，在培養(yǎng)期間，可應(yīng)用培養(yǎng)條件的變更。這可例如通過溫度變更（例如從37至 32 °C )、pH變更或同滲容摩變更來實現(xiàn)。
[0054] 本發(fā)明的工藝原則上可以在適于培養(yǎng)細(xì)胞的任何類型的細(xì)胞培養(yǎng)基上進(jìn)行。選 擇細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)條件的指導(dǎo)是公知的，例如被提供于Freshney，R. I. Culture of animal cells (a manual of basic techniques),4th edition 2000, Wiley-Liss and in Doyle, A. , Griffiths, J. B. , Newell, D. G. Cell&Tissue culture !Laboratory Procedures 1993, John Wiley&Sons 的第 8 和 9 章中。
[0055] 例如，細(xì)胞培養(yǎng)基可例如包含碳水化合物來源、鹽和/或氨基酸和/或維生素和/ 或脂類和/或去垢劑和/或緩沖劑和/或生長因子和/或激素和/或細(xì)胞因子和/或痕量 元素作為細(xì)胞培養(yǎng)基組分。碳水化合物來源的例子包括葡萄糖、果糖、半乳糖和丙酮酸鹽。 鹽的例子包括：鎂鹽，例如MgCl2. 6H20、MgSO4和MgSO4. 7H20,鐵鹽，例如FeSO4. 7H20,鉀鹽，例 如KH2P04、KC1 ;鈉鹽，例如NaH2P04、Na2HP04，和鈣鹽，例如CaCl 2. 2H20。氨基酸的例子包括所 有已知的形成蛋白質(zhì)的氨基酸，例如組氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、甲硫氨酸。維生素的例子 包括：抗壞血酸鹽、生物素、膽堿氯、肌醇、D-泛酸鹽、核黃素。脂類的例子包括：脂肪酸，例 如，亞油酸和油酸；去垢劑的例子包括Tween? 80和Pluronic? F68。緩沖劑的例子包括 HEPES和Na2CO3。生長因子/激素/細(xì)胞因子的例子包括IGF (胰島素樣生長因子）、腎上 腺皮質(zhì)素和（重組）胰島素。痕量元素的例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其包括Zn、Mg和 Se。細(xì)胞培養(yǎng)基還可例如包含其它細(xì)胞培養(yǎng)基組分，例如大豆蛋白胨或乙醇胺。
[0056] 為按照本發(fā)明來生產(chǎn)生物物質(zhì)，特別是如果生物物質(zhì)將要用作為藥物制劑中的 活性成分的話，不含血清的培養(yǎng)基相對含血清來源的培養(yǎng)基是優(yōu)選的。其理由是：血清來 源的培養(yǎng)基可能被病毒污染，存在朊性（prionic)感染的風(fēng)險，并且可能對生物藥物產(chǎn)品 的下游加工（即，從細(xì)胞培養(yǎng)物中對生物物質(zhì)的進(jìn)一步純化）造成大的障礙。因此，本發(fā) 明的工藝優(yōu)選在不包含來自動物（包括人）來源的血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行。鑒于來自 哺乳動物來源的化合物也存在感染風(fēng)險，因此，優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基是非哺乳動物來源的， 艮P，細(xì)胞培養(yǎng)基不包含來自哺乳動物來源的血清或組分。更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基是非動物 來源的，即，細(xì)胞培養(yǎng)基不包含來自動物（包括人）來源的血清或組分?？捎糜谂囵B(yǎng)PER. C6細(xì)胞的不含血清的培養(yǎng)基的例子包括可商業(yè)獲得的培養(yǎng)基，例如，EX Cell? VPRO培養(yǎng) 基（SAFC)、HyQ? CDM4Retino?(HyClone)、IS ProVec CD(Irvine scientific)、293-SFM II (invitrogen)〇
[0057] 在一些優(yōu)選實施方式中，從其中內(nèi)含物被保持在反應(yīng)器中或優(yōu)選被回送進(jìn)反應(yīng)器 的流來收獲本發(fā)明的工藝中產(chǎn)生的生物物質(zhì)，或從由反應(yīng)器移出的細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲，或 者從兩者中收獲。還可在所謂的下游加工中使用取決于生物物質(zhì)的方法（所述方法是技術(shù) 人員公知的），從細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲本發(fā)明工藝中產(chǎn)生的生物物質(zhì)。下游加工通常包含以各 種組合和順序進(jìn)行的若干純化步驟。下游加工中純化步驟的例子是分離步驟（例如，通過 親和色譜和/或離子交換色譜和/或通過水性兩相系統(tǒng)萃取和/或通過例如硫酸銨沉淀）、 用于濃縮生物物質(zhì)的步驟（例如通過超濾或滲濾）、用于更換緩沖液的步驟和/或用于移出 或滅活病毒的步驟（例如，通過病毒過濾、PH變更或溶劑去垢劑處理）。
[0058] 在一個方面，本發(fā)明涉及包含哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選El-永生化的HER細(xì)胞，更優(yōu)選 PER. C6細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其具有至少50 X IO6個細(xì)胞/mL，優(yōu)選至少60 X IO6個細(xì)胞/mL， 特別是至少90 X IO6個細(xì)胞/mL的存活細(xì)胞密度以及至少5g/L，更優(yōu)選至少10g/L，特別是 至少llg/L的生物物質(zhì)濃度。原則上生物物質(zhì)的濃度可高達(dá)至生物物質(zhì)的溶解度所允許的 程度。存活細(xì)胞的濃度典型地不超過200 X IO6個細(xì)胞/mL，優(yōu)選在80-150 X IO6個細(xì)胞/mL 的范圍內(nèi)。
[0059] 存活細(xì)胞密度例如可這樣來測定：使用臺盼藍(lán)排除方法，例如通過使用細(xì)胞計數(shù) 器（可從例如Innovatis (Cedex細(xì)胞計數(shù)器）商業(yè)獲得）來進(jìn)行。
[0060] 細(xì)胞培養(yǎng)物表示包含細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞和生物物質(zhì)的液體，所述液體是在反應(yīng)器 中在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的工藝的結(jié)果，其中，所述細(xì)胞產(chǎn)生所述生物物質(zhì)。
[0061] 現(xiàn)在將通過下述實施例來闡述本發(fā)明，但下述實施例并不對本發(fā)明加以限制。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0062] 圖1顯示了針對工藝A (分批）、B (補(bǔ)料分批）和Cl (本發(fā)明的工藝）的存活細(xì)胞 密度YdO^rnr1)對工藝時間X(天）的作圖。
[0063] 圖2顯示了針對工藝A(分批）、B(補(bǔ)料分批）和Cl (本發(fā)明的工藝）的反應(yīng)器Z 中的IgG濃度（相對于工藝A中的IgG濃度的％ )對工藝時間X(天）的作圖。
[0064] 圖3顯示了針對工藝A (分批）、B (補(bǔ)料分批）和C2 (本發(fā)明的工藝）的存活細(xì)胞 密度YdO^rnr1)對工藝時間X(天）的作圖。
[0065] 圖4顯示了針對工藝A(分批）、B(補(bǔ)料分批）和C2(本發(fā)明的工藝）的反應(yīng)器Z 中的IgG濃度（相對于工藝A中的IgG濃度的％ )對工藝時間X(天）的作圖。
[0066] 圖5顯示了針對工藝A (分批）、B (補(bǔ)料分批）和C3 (本發(fā)明的工藝）的存活細(xì)胞 密度YdO^rnr1)對工藝時間X(天）的作圖。
[0067] 圖6顯示了針對工藝A和C3的反應(yīng)器Z中的IgG濃度（相對于工藝A3中的IgG 濃度的％ )對工藝時間X(天）的作圖。
[0068] 圖7顯示了針對工藝A、B和C3的累積產(chǎn)率Q (相對于工藝A中的產(chǎn)率的％，每升 反應(yīng)器體積）對工藝時間X(天）的作圖。
[0069] 圖8顯示了針對工藝C4(本發(fā)明的工藝）的細(xì)胞數(shù)量ΥαΟ^πιΓ1)對工藝時間 χ(天）的作圖。
[0070] 圖9顯示了針對工藝C4(本發(fā)明的工藝的一種實施方式）的反應(yīng)器Z中的IgG濃 度（相對于達(dá)到的最大IgG濃度的％ )對工藝時間X(天）的作圖。
[0071] 實施例
[0072] 實施例1 :對分枇工藝、補(bǔ)料分枇工藝和根據(jù)本發(fā)明的工藝之間的比較
[0073] 在該實施例中，將根據(jù)本發(fā)明的工藝的表現(xiàn)與分批和補(bǔ)料分批工藝相比較。
[0074] 圖1顯示了針對工藝A (分批）、B (補(bǔ)料分批）和Cl (本發(fā)明的工藝）的存活細(xì)胞 密度YdO^rnr1)對工藝時間X(天）的作圖。
[0075] 圖2顯示了針對工藝A(分批）、B(補(bǔ)料分批）和Cl (本發(fā)明的工藝）的反應(yīng)器Z 中的IgG濃度（相對于工藝A中的IgG濃度的％ )對工藝時間X(天）的作圖。
[0076] 所有發(fā)酵都采用Sartorius Biostat B控制器，將溫度控制為36. 5°C，pH控制為 7. 2至6. 8之間，在DO為50%空氣飽和度以及200rpm條件下進(jìn)行。在所有實驗中都使用 相同的產(chǎn)生IgG的PER. C6細(xì)胞系（見WO 2004/099396)。
[0077] 分枇工藝A
[0078] 分批工藝以4L的工作體積在Sartorius B5容器中進(jìn)行。將細(xì)胞以3X 10e5個細(xì) 胞/mL接種于補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基（SAFC)中，隨后培養(yǎng)17天。
[0079] 補(bǔ)料分枇工藝B
[0080] 補(bǔ)料分批工藝以4L的工作體積在Sartorius B5容器中進(jìn)行。將細(xì)胞以3X 10e5 個細(xì)胞/mL接種于補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基（SAFC)中。在培養(yǎng)期間，加入葡 萄糖和谷氨酰胺，以保持濃度分別超過15mM和ImM。從第5天起添加氨基酸和肽，以補(bǔ)充消 耗的氨基酸。
[0081] 本發(fā)明的工藝Cl
[0082] 本發(fā)明的工藝在2L Applikon容器中進(jìn)行。用ATF-2系統(tǒng)（Refine Technology) 以ATF流模式操作的具有IOOkDa分子量分離點（MWCO)的中空纖維膜（從General Electric(GE)獲得）被用于保留細(xì)胞和IgG產(chǎn)物。培養(yǎng)以補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO 培養(yǎng)基（SAFC)中的3 X 10e5個細(xì)胞/mL開始。使用0. 05至0. 2nL/細(xì)胞/天之間的比流 速（SFR)，經(jīng)由懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物灌注補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基（SAFC)。獲得 的最高產(chǎn)物濃度為I. 4g/L。
[0083] 本發(fā)明的工藝較之前文提到的培養(yǎng)模式而言，以較少的時間產(chǎn)生了增加的存活細(xì) 胞密度以及增加的產(chǎn)物濃度，這可從圖1和圖2中看到。
[0084] 實施例2 :對分枇工藝、補(bǔ)料分枇工藝和根據(jù)本發(fā)明的工藝之間的比較
[0085] 在該實施例中，再次將根據(jù)本發(fā)明的工藝的表現(xiàn)與分批和補(bǔ)料分批工藝相比較； 在工藝C2中，CO 2壓力被控制，并且使用50kDa的分離系統(tǒng)。
[0086] 圖3顯示了針對工藝A (分批）、B (補(bǔ)料分批）和C2 (本發(fā)明的工藝）的存活細(xì)胞 密度YdO^rnr1)對工藝時間X(天）的作圖。
[0087] 圖4顯示了針對工藝A (分批）、B (補(bǔ)料分批）和C2 (本發(fā)明的工藝）的反應(yīng)器Z 中的IgG濃度（相對于工藝A中的IgG濃度的％ )對工藝時間X(天）的作圖。
[0088] 所有發(fā)酵都采用Sartorius Biostat B控制器，將溫度控制為36. 5°C，pH控制為 7. 2至6. 8之間，在DO為50%空氣飽和度以及200rpm條件下進(jìn)行。在所有實驗中都使用 相同的產(chǎn)生IgG (大約150kDa)的PER. C6細(xì)胞系（見WO 2004/099396)。
[0089] 分枇工藝A
[0090] 分批工藝以4L的工作體積在Sartorius B5容器中進(jìn)行。將細(xì)胞以3X IO5個細(xì) 胞.mL-1接種于補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基（SAFC)中，隨后培養(yǎng)17天。
[0091] 補(bǔ)料分枇工藝B
[0092] 補(bǔ)料分批工藝以4L的工作體積在Sartorius B5容器中進(jìn)行。將細(xì)胞以3X IO5 個細(xì)胞.ml/1接種于補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基（SAFC)中。在培養(yǎng)期間，加入 葡萄糖和谷氨酰胺，以保持濃度分別超過15mM和ImM。從第5天起添加氨基酸和肽，以補(bǔ)充 消耗的氨基酸。
[0093] 本發(fā)明的工藝C2
[0094] 本發(fā)明的工藝在2L Applikon容器中進(jìn)行。用ATF-2系統(tǒng)（Refine Technology) 以ATF流模式操作的具有50kDa分子量分離點（MWCO)的中空纖維膜（GE)被用于保留細(xì)胞 和IgG產(chǎn)物。培養(yǎng)以補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基（SAFC)中的3X 10e5個細(xì)胞 /mL開始。使用0.05至0. 2nL.細(xì)胞 ' 天+1之間的SPR，經(jīng)由懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物灌注補(bǔ)充有 6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基（SAFC)。CO2壓力被控制為低于15%。
[0095] 結(jié)果
[0096] 如從圖3和圖4可見，根據(jù)本發(fā)明的工藝在相等或更短的時間（分批時間的100%; 補(bǔ)料分批時間的81%)內(nèi)產(chǎn)生了顯著增加的存活細(xì)胞密度和增加的產(chǎn)物濃度（2415% X分 批的產(chǎn)率；690% X補(bǔ)料分批的產(chǎn)率）。
[0097] 本發(fā)明工藝總生產(chǎn)力（以g. L'天^的增加是分批生產(chǎn)力（以g. Γ1·天^的 23. 9倍，是補(bǔ)料分批生產(chǎn)力（以g.171.天_〇的8. 5倍。在本發(fā)明的工藝C2中，產(chǎn)生了 11. Ig 產(chǎn)物/L。17天期間沒有發(fā)生駐留設(shè)備的阻塞，即使是非常高細(xì)胞密度的情況下。
[0098] 實施例3 :對分批工藝、補(bǔ)料分批工藝和根據(jù)本發(fā)明的工藝之間的比較
[0099] 在該實施例中，再次將根據(jù)本發(fā)明的采用細(xì)胞培養(yǎng)物移出的工藝的表現(xiàn)與分批和 補(bǔ)料分批工藝相比較；在工藝C3中，移出了細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0100] 圖5顯示了針對工藝A (分批）、B (補(bǔ)料分批）和C3 (本發(fā)明的工藝）的存活細(xì)胞 密度YdO^rnr1)對工藝時間X(天）的作圖。
[0101] 圖6顯示了針對工藝A和C3的反應(yīng)器Z中的IgG濃度（相對于工藝A3中的IgG 濃度的％ )對工藝時間X(天）的作圖。
[0102] 圖7顯示了針對工藝A、B和C3的累積產(chǎn)率Q (相對于工藝A中的產(chǎn)率的％，每升 反應(yīng)器體積）對工藝時間X(天）的作圖。
[0103] 所有發(fā)酵都采用Sartorius Biostat B控制器，將溫度控制為36. 5°C，pH控制為 7. 2至6. 8之間，在DO為50%空氣飽和度以及200rpm條件下進(jìn)行。在所有實驗中都使用 相同的產(chǎn)生IgG (大約150kDa)的PER. C6細(xì)胞系（見WO 2004/099396)。
[0104] 分枇工藝A
[0105] 分批工藝以4L的工作體積在Sartorius B5容器中進(jìn)行。將細(xì)胞以3X IO5個細(xì) 胞.mL-1接種于補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基（SAFC)中，隨后培養(yǎng)17天。
[0106] 補(bǔ)料分枇工藝B
[0107] 補(bǔ)料分批工藝以4L的工作體積在Sartorius B5容器中進(jìn)行。將細(xì)胞以3X IO5個 細(xì)胞.ml/1接種于補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基（SAFC)中。在培養(yǎng)期間，加入葡 萄糖和谷氨酰胺，以保持濃度分別超過15mM和ImM。從第5天起添加氨基酸和肽，以補(bǔ)充消 耗的氨基酸。
[0108] 本發(fā)明的工藝C3
[0109] 本發(fā)明的工藝在2L Applikon容器中進(jìn)行。用ATF-2系統(tǒng)（Refine Technology) 以ATF流模式操作的具有IOOkDa分子量分離點（MWCO)的中空纖維膜（GE)被用于保留細(xì) 胞和IgG產(chǎn)物。培養(yǎng)以補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基（SAFC)中的3X10e5個細(xì) 胞/mL開始。使用0. 05至0. 2nL.細(xì)胞 ' 天η之間的SPR，經(jīng)由懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物灌注補(bǔ)充 有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基（SAFC)。當(dāng)存活細(xì)胞密度大于IOX IO6個細(xì)胞.mL-1時， 每天以工作體積的10%移出細(xì)胞培養(yǎng)物，當(dāng)存活細(xì)胞密度超過30X IO6個細(xì)胞.ml/1時，每 天以工作體積的30%移出細(xì)胞培養(yǎng)物。
[oho] MM
[0111] 如可從圖5看到的，采用本發(fā)明的工藝，快速達(dá)到了更高的存活細(xì)胞密度。此外， 圖5還顯示，采用本發(fā)明的工藝細(xì)胞的存活性可保持更長時間，例如工藝C3保持運行了接 近40天，因為即使在高細(xì)胞密度的情況下也不會發(fā)生對駐留設(shè)備的阻塞。
[0112] 圖6顯示，本發(fā)明工藝的產(chǎn)物濃度要比分批工藝中的產(chǎn)物濃度高得多。以分批工 藝A中終濃度的大約200%至250%倍從工藝C3收獲了含有產(chǎn)物的產(chǎn)物流。
[0113] 圖7顯示，本發(fā)明的工藝形成了最多的產(chǎn)物，并且本發(fā)明的工藝能比分批工藝A和 補(bǔ)料分批工藝B保持更長的時間。在第17天，工藝C3的累積產(chǎn)率為分批工藝（A3)累積產(chǎn) 率的8. 1倍，是補(bǔ)料分批工藝（B)累積產(chǎn)率的2. 1倍。此外，在第17天，分批工藝終止。在 第21天，工藝C3的累積產(chǎn)率是補(bǔ)料分批工藝B的累積產(chǎn)率的3. 0倍。在第21天，補(bǔ)料分 批工藝終止。39天后，工藝C3的總累積產(chǎn)率是分批工藝A累積產(chǎn)率的25倍，是補(bǔ)料分批工 藝B產(chǎn)率的6倍。
[0114] 從該實驗可以推斷出，在根據(jù)本發(fā)明的工藝中，當(dāng)細(xì)胞密度超過一定高水平后，可 通過應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)物的移除，來進(jìn)一步提高想要的生物材料的總產(chǎn)率。
[0115] 實施例4 :培養(yǎng)和牛產(chǎn)CHO細(xì)朐
[0116] 在該實施例中，采用生產(chǎn)IgG的CHO細(xì)胞系來進(jìn)行了根據(jù)本發(fā)明的工藝，其中包括 溫度降低以減少細(xì)胞生長。
[0117] 圖8顯示了針對工藝C4(本發(fā)明的工藝）的細(xì)胞數(shù)量ΥαΟ^πιΓ1)對工藝時間 χ(天）的作圖。
[0118] 圖9顯示了針對工藝C4(本發(fā)明的工藝的一種實施方式）的反應(yīng)器Z中的IgG濃 度（相對于達(dá)到的最大IgG濃度的％ )對工藝時間X(天）的作圖。
[0119] 發(fā)酵米用Sartorius Biostat B控制器，將溫度控制為36. 5°C, pH控制為7. 1至 6. 9之間，在DO為40%空氣飽和度以及IOOrpm條件下進(jìn)行。溫度在第5天降低至32°C。
[0120] 本發(fā)明的工藝C4
[0121] 本發(fā)明的工藝在2L Applikon容器中進(jìn)行。用ATF-2系統(tǒng)（Refine Technology)以 ATF流模式操作的具有50kD分子量分離點（MWCO)的中空纖維膜（General Electric)被用 于保留細(xì)胞和IgG產(chǎn)物。培養(yǎng)以MTCM-49培養(yǎng)基（Hyclone)中的5X IO6個細(xì)胞/mL開始。 使用〇. 1至〇. 4nL.細(xì)胞 ' 天η之間的SPR，經(jīng)由懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物灌注培養(yǎng)基。CO2壓力被 控制為低于15%。
[0122] 益果
[0123] 數(shù)據(jù)顯示，使用產(chǎn)生蛋白的CHO細(xì)胞系時，本發(fā)明的工藝同樣能夠工作。獲得的細(xì) 胞密度和產(chǎn)物濃度較之分批培養(yǎng)有所增加。數(shù)據(jù)還顯示，在根據(jù)本發(fā)明的工藝中，細(xì)胞生長 可被阻礙（例如，通過溫度降低），而培養(yǎng)系統(tǒng)中的產(chǎn)物積累能夠繼續(xù)。
[0124] 實施例5 :采用骨髓瘤細(xì)朐系講行的本發(fā)明的工藝
[0125] 根據(jù)本發(fā)明的工藝還可應(yīng)用到骨髓瘤細(xì)胞系上。為達(dá)到此目的，發(fā)酵采用 Sartorius Biostat B控制器，將溫度控制為36. 5°C，pH控制為7. 2至6. 8之間，在DO為 40%空氣飽和度以及IOOrpm條件下進(jìn)行。培養(yǎng)以在5L Sartorius容器中的SFM4Mab培養(yǎng) 基（Hyclone)中以3X10e5個細(xì)胞/mL接種骨髓瘤細(xì)胞開始。細(xì)胞和產(chǎn)物駐留設(shè)備是用 ATF-4系統(tǒng)（Refine Technology)以ATF流模式操作的具有30kD分子量分離點（MWCO)的中 空纖維膜（General Electric)。使用0. 1至0. 4nL.細(xì)胞 '天η之間的SPR，經(jīng)由懸浮細(xì) 胞培養(yǎng)物灌注SFM4Mab培養(yǎng)基（Hyclone)。CO2壓力被控制為低于15%。
[0126] 實施例6 :采用MDCK細(xì)朐系講行的本發(fā)明的工藝
[0127] 根據(jù)本發(fā)明的工藝還可應(yīng)用到懸浮液中的經(jīng)轉(zhuǎn)化的MDCK細(xì)胞系上。為達(dá)到此目 的，發(fā)酵采用Sartorius Biostat B控制器，將溫度控制為36. 5°C，pH控制為7. 2至6. 8之 間，在DO為40%空氣飽和度以及IOOrpm條件下進(jìn)行。培養(yǎng)以在5L Sartorius容器中的 VP-SFM培養(yǎng)基（Invitrogen)中以3X10e5個細(xì)胞/mL接種經(jīng)轉(zhuǎn)化的MDCK細(xì)胞開始。細(xì)胞 和產(chǎn)物駐留設(shè)備是用ATF-4系統(tǒng)（Refine Technology)以ATF流模式操作的具有30kD分子 量分離點（MWCO)的中空纖維膜（General Electric)。使用0.1至0.4nL.細(xì)胞'天η之 間的SPR，經(jīng)由懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物灌注VP-SFM培養(yǎng)基（Invitrogen)。CO 2壓力被控制為低于 15%。
【權(quán)利要求】
1. 在反應(yīng)器中于細(xì)胞培養(yǎng)基中于懸浮液中培養(yǎng)真核細(xì)胞的工藝， 其中，所述細(xì)胞能產(chǎn)生由轉(zhuǎn)染進(jìn)所述細(xì)胞的至少一種基因編碼的生物物質(zhì)， 其中，向細(xì)胞培養(yǎng)物補(bǔ)料至少一種細(xì)胞培養(yǎng)基組分，并且， 其中，包含所述細(xì)胞、所述生物物質(zhì)和所述細(xì)胞培養(yǎng)基的所述細(xì)胞培養(yǎng)物在包括過濾 器的分離系統(tǒng)上以與所述分離系統(tǒng)表面基本平行的流循環(huán)，產(chǎn)生液體流出物和其中細(xì)胞培 養(yǎng)物內(nèi)含物被保持在反應(yīng)器中或被回送進(jìn)反應(yīng)器的流， 其中，所述過濾器具有孔徑，孔徑的特征在于分子量分離點小于所述生物物質(zhì)的分子 量，以便使所述生物物質(zhì)與比所述生物物質(zhì)分子量更低的物質(zhì)分開，并且 其中，所述液體流出物基本上由分子量比所述生物物質(zhì)分子量低的組分組成，并且，其 中細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)含物被保持在反應(yīng)器中或被回送進(jìn)反應(yīng)器的所述流基本上由分子量與所 述生物物質(zhì)分子量相同或分子量更高的組分組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的工藝，其中，所想要的生物物質(zhì)的分子量比所述分子量分離點大 至少2倍。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的工藝，其中，所想要的生物物質(zhì)的分子量比所述分子量分離點 大至少3倍。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的工藝，其中，所述分子量更低的物質(zhì)的一部分持續(xù)從 所述細(xì)胞培養(yǎng)物中移出。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的工藝，其中，所述養(yǎng)真核細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的工藝，其中，所述哺乳動物細(xì)胞是CHO (中華倉鼠卵巢）細(xì)胞、雜交 瘤、BHK(幼倉鼠腎）細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、人細(xì)胞或小鼠細(xì)胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的工藝，其中，所述人細(xì)胞是E1永生化的HER細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6的工藝，其中，所述人細(xì)胞是PER. C6細(xì)胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的工藝，其中，所述生物物質(zhì)是重組蛋白
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的工藝，其中，所述生物物質(zhì)是抗體。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項的工藝，其中，所述分離系統(tǒng)是膜過濾器。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的工藝，其中，所述分離系統(tǒng)是中空纖維過濾器。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的工藝，其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物在所述過濾器上以交 互切向流循環(huán)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項的工藝，其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基組分被補(bǔ)料到所述反 應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)物中。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項所述的工藝，其中，至少進(jìn)行一次從所述反應(yīng)器移 出細(xì)胞培養(yǎng)物的操作，并且，向所述反應(yīng)器添加液體以補(bǔ)償所述細(xì)胞培養(yǎng)物的移出。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的工藝，其中，所述液體是細(xì)胞培養(yǎng)基。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1-16中任意一項所述的工藝，其中，從所述細(xì)胞培養(yǎng)物收獲所述生 物物質(zhì)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求15-17中任意一項所述的工藝，其中，從所述至少一次被從所述反應(yīng) 器移出的細(xì)胞培養(yǎng)物收獲所述生物物質(zhì)。
【文檔編號】C12N5/073GK104263700SQ201410250626
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2007年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2006年7月14日
【發(fā)明者】格本·梅勒·茲吉爾斯特瑞, 羅伯特·帕特里克·浩弗, 雅各布·史德勒 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司