一種腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明是將經(jīng)過酶法或機(jī)械法把腫瘤樣本制備成單細(xì)胞懸液，然后采用無血清懸浮培養(yǎng)法制得腫瘤細(xì)胞囊球，培養(yǎng)過程需添加堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、胰島素和牛血清白蛋白，然后撤除生長(zhǎng)因子，并在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)就可得到能連續(xù)傳代的貼壁細(xì)胞了。本發(fā)明培養(yǎng)周期短、并且提高了腫瘤原代培養(yǎng)的成功率。
【專利說明】一種腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]原代培養(yǎng)(primaryculture)也叫初代培養(yǎng),指直接從體內(nèi)取出的腫瘤細(xì)胞或組織進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。最常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)是將剪碎的組織塊直接移植在培養(yǎng)瓶壁上，加入培養(yǎng)基后進(jìn)行培養(yǎng)。分散細(xì)胞培養(yǎng)則是將組織塊用機(jī)械法或化學(xué)法使細(xì)胞分散。如欲從臨床活檢或切除的腫瘤組織分離到活性最好的游離細(xì)胞，經(jīng)典的方法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和膠原酶)消化細(xì)胞間的結(jié)合物，或用金屬離子螯合劑(如EDTA)除去細(xì)胞互相粘著所依賴的Ca2+，再經(jīng)機(jī)械輕度振蕩，使之成為單細(xì)胞。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)是:(1)惡性腫瘤組織類型復(fù)雜，體外原代培養(yǎng)成功率不能保證為100%。(2)通過酶消化法分離的腫瘤細(xì)胞，體外增殖后再進(jìn)行試驗(yàn)，操作復(fù)雜，最關(guān)鍵是體外擴(kuò)增本身具有細(xì)胞選擇作用，得到的細(xì)胞能否代表體內(nèi)真實(shí)細(xì)胞組成。(3)非腫瘤組織和壞死組織難以較好的去除，可明顯影響體外原代培養(yǎng)成功率。(4)對(duì)細(xì)胞量要求較高，量過多或過少都不利于原代培養(yǎng)的成功。(5)現(xiàn)有方法容易受到培養(yǎng)體系的影響，特別是小牛血清的質(zhì)量和數(shù)量，培養(yǎng)基種類，腫瘤細(xì)胞類型和污染等都是影響腫瘤細(xì)胞體外原代培養(yǎng)的主要因素。
[0004]因此，現(xiàn)有技術(shù)存在缺陷，需要改進(jìn)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)在腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)中存在的問題，提供了一種腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]—種腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，其特征是，其步驟如下:
[0008]( I)腫瘤樣本在實(shí)體瘤患者手術(shù)切除后的半小時(shí)內(nèi)進(jìn)行收集，收集方法為，在無菌環(huán)境下，切取非壞死部位的腫瘤樣本，其體積在Icm3以上，將其置于盛有提前在4°C冰箱中預(yù)冷的20mL RPMI1640培養(yǎng)液(對(duì)不同類型的腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)液類型可能不同)的50mL塑料無菌帶蓋離心管內(nèi)，離心管置冰上運(yùn)輸，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室；其中RPMI1640培養(yǎng)液中含10%Hyclone肽牛血清、100U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素；
[0009](2)在生物安全柜內(nèi)，將腫瘤樣本轉(zhuǎn)移至IOOmm細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning，430167)內(nèi)，用IXPBSlOmL沖洗三次，將血細(xì)胞清洗掉，然后剔除腫瘤樣本表面筋膜等非腫瘤組織；
[0010](3)將步驟(2)中處理后的腫瘤組織轉(zhuǎn)移至一新的IOOmm培養(yǎng)皿內(nèi)，滴加0.5mLPBS，用無菌手術(shù)刀片，手術(shù)剪和 手術(shù)鑷將腫瘤組織分割為直徑小于Imm的小碎塊；
[0011](4)將步驟(3)中切碎的腫瘤組織轉(zhuǎn)移至50mL離心管，用臺(tái)式離心機(jī)，500轉(zhuǎn)/分鐘，離心2分鐘；然后用移液器小心移除離心管內(nèi)上清，再用IOmL含膠原酶II (200U/mL或5mg/mL)(對(duì)不同類型的腫瘤細(xì)胞，所用消化酶類型可能不同；或者采用0.25%胰酶溶液，37°C下消化時(shí)間10分鐘)的無血清RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，置37 °C恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩消化，時(shí)間為I小時(shí)(消化時(shí)間取決于樣本大小；如果樣本大于Ig則消化時(shí)間增至
1.5-2小時(shí))；之后用臺(tái)式離心機(jī)500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去上清液，消化的腫瘤組織用IOmLlXPBS重懸,研磨過篩,其細(xì)胞篩為100目，孔徑0.16mm,將過篩的腫瘤細(xì)胞懸液收集于IOOmm培養(yǎng)皿中；
[0012](5)將步驟(4)中收集的腫瘤細(xì)胞懸液過40 μ m孔徑的細(xì)胞篩并收集于5OmL離心管內(nèi)，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；然后將其在1200轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，棄去上清，再用無血清RPMI1640培養(yǎng)基(對(duì)不同類型的腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)基類型可能不同)重懸，使其腫瘤細(xì)胞懸液的密度為IX IO3細(xì)胞/mL ;其中無血清RPMI1640培養(yǎng)基含有10ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、20ng/mL 表皮生長(zhǎng)因子(epithelialgrowth factor, EGF)>5 μ g/mL 胰島素(insulin)和 0.4g/IOOmL 的牛血清白蛋白(bovineserum albumin, BSA)(對(duì)于不同組織類型的腫瘤，除了通用的bFGF和EGF外,其他需要添加的生長(zhǎng)因子會(huì)有所不同；培養(yǎng)基要現(xiàn)配現(xiàn)用)；
[0013](6)將步驟(5)中IX IO3細(xì)胞/mL的腫瘤細(xì)胞懸液置入超低粘附細(xì)胞培養(yǎng)6孔板(康寧公司，corning company)中，每孔2mL,置于37°C, 5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天,期間每3天添加(5)所述無血清RPMI1640培養(yǎng)基100 μ L/孔；該培養(yǎng)基于4°C下保存不應(yīng)超過2周；
[0014](7)培養(yǎng)后，當(dāng)無血清培養(yǎng)基中形成的瘤球最大直徑達(dá)200 μ m時(shí)，利用重力作用沉降10分鐘，棄去上清，收集瘤球置于15mL離心管中；
[0015](8)在步驟(7)中收集的瘤球細(xì)胞中加入l_5mL Accutase酶(貨號(hào)A1110501,Gibco by life technologies)進(jìn)行消化裂解,室溫下10分鐘；然后用移液器吹打消化液，1200轉(zhuǎn)/分離心5分鐘后棄去上清液；
[0016](9)用含10% (v/v) Hyclone肽牛血清，100U/mL青霉素和100g/mL鏈霉素的培養(yǎng)液5mL重懸步驟(8)中處理后的細(xì)胞，其密度≤1O5細(xì)胞/mL，置入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行貼壁擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿85%瓶壁時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)代數(shù)超過50代而沒有衰老跡象，說明細(xì)胞原代培養(yǎng)和建系成功。
[0017]本發(fā)明的有益效果為:(I)提高腫瘤原代培養(yǎng)的成功率，特別是難培養(yǎng)腫瘤，例如某些結(jié)腸癌和獲取組織塊較小的腫瘤原代培養(yǎng)成功率。(2)保證體外原代培養(yǎng)的腫瘤能夠最好的再現(xiàn)其在體內(nèi)的遺傳表型和異質(zhì)性。(3)原代培養(yǎng)不受成纖維細(xì)胞，脂肪細(xì)胞等非腫瘤細(xì)胞的干擾能得到純化的腫瘤細(xì)胞。(4)不用血清所以不受血清質(zhì)量和數(shù)量的影響。(5)瘤球細(xì)胞的培養(yǎng)不需要很多細(xì)胞，只要有IO4級(jí)別的細(xì)胞就可成功培養(yǎng)瘤球，形成的瘤球本身也可以連續(xù)傳代。(6)只有腫瘤細(xì)胞才可以形成瘤球(按照腫瘤干細(xì)胞理論只有腫瘤干細(xì)胞才能形成瘤球)，其他非腫瘤細(xì)胞無法成活，就會(huì)死亡裂解成碎片，不管怎么樣，形成的瘤球來自腫瘤樣本中的腫瘤細(xì)胞無疑，并且其生長(zhǎng)是懸浮狀態(tài)的，當(dāng)瘤球形成后由于是多細(xì)胞組成的，很容易利用重力自然沉降或密度離心的方法去除雜質(zhì)，例如非腫瘤細(xì)胞碎片等等。這樣就可以得到相當(dāng)純化的腫瘤細(xì)胞。(7)培養(yǎng)周期較短，從無血清培養(yǎng)開始到形成瘤球大概10天左右,不同的腫瘤差別不大。形成瘤球后用accutrase消化瘤球可以連續(xù)傳代，或者采用常規(guī)方法培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，獲取細(xì)胞自由靈活，可以在較短周期內(nèi)(I個(gè)月內(nèi))得到穩(wěn)定傳代的腫瘤細(xì)胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為用腎透明細(xì)胞癌臨床組織樣本獲得的細(xì)胞進(jìn)行瘤球培養(yǎng)效果圖。
[0019]圖2為用Accutase酶消化瘤球后進(jìn)行常規(guī)貼壁培養(yǎng)效果圖；圖為第五代傳代細(xì)胞。
[0020]圖3為在瘤球培養(yǎng)過程中直接將無血清培養(yǎng)基換為常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)基后腫瘤細(xì)胞從瘤球爬出后貼壁生長(zhǎng)效果圖。
[0021]圖4為瘤球培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過貼壁培養(yǎng)后分化為各種不同形態(tài)的腫瘤細(xì)胞圖。
[0022]圖5為用本發(fā)明獲得的腫瘤細(xì)胞與其來源腫瘤樣本細(xì)胞有相同的表面抗原表型；其中A為CD68-FITC熒光強(qiáng)度；B為CK8-FITC熒光強(qiáng)度；C為CK18-FITC熒光強(qiáng)度；D為EMA-PE熒光強(qiáng)度；圖中，實(shí)線為同型對(duì)照，點(diǎn)虛線為臨床腫瘤樣本細(xì)胞，段虛線為用本發(fā)明方法培養(yǎng)的細(xì)胞；圖中數(shù)值為以同型對(duì)照右邊界做門設(shè)定的陽性細(xì)胞區(qū)域。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0024]實(shí)施例腎透明細(xì)胞癌原代培養(yǎng)
[0025]1、腎透明細(xì)胞癌患者行手術(shù)單側(cè)全切或部分切除，其腫瘤樣本在手術(shù)切除后的半小時(shí)內(nèi)進(jìn)行收集，收集方法為取50mL塑料無菌帶蓋離心管，內(nèi)裝RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液20mL(提前在4°C冰箱中預(yù)冷)，培養(yǎng)`液內(nèi)含10%HyClOne肽牛血清、100U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素。在無菌環(huán)境下，切取非壞死部位的腫瘤樣本，體積在Icm3以上置于所述無菌離心管內(nèi)，離心管置冰上運(yùn)輸，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。
[0026]2、在生物安全柜內(nèi)，將腫瘤樣本轉(zhuǎn)移至IOOmm細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning，430167)內(nèi)，用IXPBSlOmL沖洗三次，將血細(xì)胞清洗掉，剔除表面筋膜等非腫瘤組織。
[0027]3、將2中處理后的腫瘤組織轉(zhuǎn)移至一新的IOOmm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，滴加0.5mL PBS,用無菌手術(shù)刀片、手術(shù)剪和手術(shù)鑷將腫瘤組織全部被分割為直徑小于Imm的小碎塊。
[0028]4、將3中切碎的腫瘤組織轉(zhuǎn)移至50mL離心管，用臺(tái)式離心機(jī)，500轉(zhuǎn)/分鐘，離心2分鐘，用移液器移除離心管內(nèi)上清，再用IOmL含膠原酶II (200U/mL或5mg/mL)的無血清RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，置37°C恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩消化，時(shí)間I小時(shí)(消化時(shí)間取決于樣本大小；如果樣本大于Ig則消化時(shí)間增至1.5-2小時(shí))。
[0029]5、將4中消化后的腫瘤組織懸液用臺(tái)式離心機(jī)500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去上清液，消化的腫瘤組織用IOmLlXPBS重懸，研磨過篩(100目，孔徑0.16mm)，將其收集于10Omm培養(yǎng)皿中。
[0030]6、將5中收集的細(xì)胞懸液過40 μ m孔徑的細(xì)胞篩并收集于50mL離心管內(nèi)，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。然后將其1200轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，棄去上清，用無血清RPMI1640重懸，懸液的密度為I X IO3細(xì)胞/mL。所述無血清RPMI1640培養(yǎng)基中含有10ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF), 20ng/mL 表皮生長(zhǎng)因子(epithelialgrowth factor, EGF), 5 μ g/mL 胰島素(insulin)和 0.4g/IOOmL 的牛血清白蛋白(bovineserum albumin, BSA)。[0031]7、將6中IX IO3細(xì)胞/mL細(xì)胞懸液置入超低粘附細(xì)胞培養(yǎng)6孔板(康寧公司，corning company)中，2mL/孔,置于37°C, 5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，期間每3天，添加6中所述的無血清RPMI1640培養(yǎng)基100 μ I/孔。新配制的無血清RPMI1640培養(yǎng)基在4V下保存應(yīng)不超過2周。
[0032]8、無血清培養(yǎng)基中形成的瘤球最大直徑達(dá)200 μ m時(shí)，只需利用重力作用，沉降10分鐘,棄去上清,收集瘤球置于15mL離心管中。
[0033]9、在8中收集的瘤球細(xì)胞加入Accutase酶(Life technologies) ImL (可根據(jù)瘤球數(shù)量調(diào)整為l_5mL)進(jìn)行消化裂解，室溫下10分鐘。然后用移液器吹打消化液，1200轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，吸取棄去上清液。
[0034]10、用含 10%(v/v)Hyclone 肽牛血清、100U/mL 青霉素和 100 μ g/mL 鏈霉素的 1640培養(yǎng)液5mL重懸9中處理后的細(xì)胞，密度≤IO5細(xì)胞/mL，將其置入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行貼壁擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿85%瓶壁時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)代數(shù)超過50代而沒有衰老跡象，即說明細(xì)胞原代培養(yǎng)和建系成功。
[0035]11、對(duì)腎透明細(xì)胞癌的臨床樣本細(xì)胞和經(jīng)過上述步驟得到的培養(yǎng)細(xì)胞分別用熒光素連接的單克隆抗體(對(duì)于不同類型的腫瘤，選用不同的抗體，具體請(qǐng)參閱相關(guān)專業(yè)文獻(xiàn))與腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原進(jìn)行免疫雜交，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度。分析結(jié)果并以此作為本法培養(yǎng)細(xì)胞是否與其來源細(xì)胞遺傳表型一致的依據(jù)。
[0036]12、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0037](I)圖1為采取上述實(shí)施例步驟7得到的腎癌瘤球，圖示為培養(yǎng)第5天的照片，用相差顯微鏡，放大100 倍拍攝。
[0038]圖2為采取上述實(shí)施例步驟9得到的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，該細(xì)胞在常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)基中可連續(xù)傳代培養(yǎng)，圖示為貼壁培養(yǎng)第5代傳代細(xì)胞。
[0039]圖3為瘤球培養(yǎng)過程中撤去無血清培養(yǎng)基，模擬傳統(tǒng)原代培養(yǎng)方式中組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，為上述實(shí)施例省去步驟9的簡(jiǎn)便方法。
[0040]圖4為采取上述實(shí)施例步驟10得到的第一代貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，由于瘤球細(xì)胞富含腫瘤干細(xì)胞，其貼壁后分化為具有不同的形態(tài)的腫瘤細(xì)胞且細(xì)胞亞群間有明顯的界限，表明腫瘤的異質(zhì)性，隨著貼壁培養(yǎng)與傳代，細(xì)胞達(dá)到終末分化，形態(tài)差異不再明顯。
[0041 ] 圖5為采取上述實(shí)施步驟11得到的細(xì)胞表面免疫表型結(jié)果。經(jīng)過原代培養(yǎng)的細(xì)胞與腎癌組織細(xì)胞具有相同的細(xì)胞膜免疫表型，因此體外原代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞很好的再現(xiàn)了體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的遺傳表型。免疫表型與腎透明細(xì)胞癌類似，腫瘤細(xì)胞呈細(xì)胞角蛋白8(CK8)、CK18及上皮細(xì)胞膜抗原(EMA)陽性，⑶68陰性。
[0042](2)用傳統(tǒng)組織塊法和酶法進(jìn)行原代培養(yǎng)共實(shí)施11例，成功I例。成功率為1/11X100%=9.1% ;用本發(fā)明實(shí)施腎癌原代培養(yǎng)9例，胃癌原代培養(yǎng)3例，均獲成功，成功率
100% ο
[0043](3)對(duì)所得腫瘤樣本進(jìn)行前處理(見技術(shù)方案1-5)后所得單細(xì)胞統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)其平均數(shù)為4.34X 106,最大值為2.01 X 107(腫瘤樣本較大)，最小值為1.05X 104(腫瘤樣本較小)，本法統(tǒng)一只用3.6 X IO4個(gè)細(xì)胞，不夠的按2000個(gè)細(xì)胞/孔孵育瘤球。
[0044]應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，其特征是，其步驟如下: (1)腫瘤樣本在實(shí)體瘤患者手術(shù)切除后的半小時(shí)內(nèi)進(jìn)行收集，收集方法為，在無菌環(huán)境下，切取非壞死部位的腫瘤樣本，其體積在Icm3以上，將其置于盛有提前在4°C冰箱中預(yù)冷的20mLRPMI1640培養(yǎng)液的50mL塑料無菌帶蓋離心管內(nèi)，離心管置冰上運(yùn)輸，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室；其中RPMI1640培養(yǎng)液中含10%Hyclone肽牛血清、100U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素； (2)在生物安全柜內(nèi)，將腫瘤樣本轉(zhuǎn)移至IOOmm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，用IXPBSlOmL沖洗三次，將血細(xì)胞清洗掉，然后剔除腫瘤樣本表面筋膜等非腫瘤組織； (3)將步驟(2)中處理后的腫瘤組織轉(zhuǎn)移至一新的IOOmm培養(yǎng)皿內(nèi)，滴加0.5mL PBS,用無菌手術(shù)刀片，手術(shù)剪和手術(shù)鑷將腫瘤組織分割為直徑小于Imm的小碎塊； (4)將步驟(3)中切碎的腫瘤組織轉(zhuǎn)移至50mL離心管，用臺(tái)式離心機(jī)，500轉(zhuǎn)/分鐘，離心2分鐘；然后用移液器小心移除離心管內(nèi)上清，再用IOmL含200U/mL或5mg/mL膠原酶II的無血清1640培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，置37°C恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩消化，時(shí)間為I小時(shí)；之后用臺(tái)式離心機(jī)500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去上清液，消化的腫瘤組織用IOmLl XPBS重懸，研磨過篩，其細(xì)胞篩 為100目，孔徑0.16mm，將過篩的腫瘤細(xì)胞懸液收集于IOOmm培養(yǎng)皿中； (5)將步驟(4)中收集的腫瘤細(xì)胞懸液過40μ m孔徑的細(xì)胞篩并收集于50mL離心管內(nèi)，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；然后將其在1200轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，棄去上清，再用無血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸，使其腫瘤細(xì)胞懸液的密度為I X IO3細(xì)胞/mL ;該無血清RPMI1640培養(yǎng)基包含有10ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、20ng/mL表皮生長(zhǎng)因子、5 μ g/mL胰島素和，0.4g/100mL的牛血清白蛋白； (6)將步驟(5)中IX IO3細(xì)胞/mL的腫瘤細(xì)胞懸液置入超低粘附細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中，每孔2mL，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，期間每3天添加(5)所述無血清RPMI1640培養(yǎng)基100 μ L/孔；該培養(yǎng)基于4°C下保存不超過2周； (7)培養(yǎng)后，當(dāng)無血清培養(yǎng)基中形成的瘤球最大直徑達(dá)200μ m時(shí)，利用重力作用沉降，10分鐘，棄去上清，收集瘤球置于15mL離心管中； (8)在步驟(7)中收集的瘤球細(xì)胞中加入l-5mLAccutase酶進(jìn)行消化裂解，室溫下10分鐘；然后用移液器吹打消化液，1200轉(zhuǎn)/分離心5分鐘后棄去上清液； (9)用含10%v/vHyclone肽牛血清、100U/mL青霉素和100μ g/mL鏈霉素的常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)液5mL重懸步驟(8)中處理后的細(xì)胞，其密度≤IO5細(xì)胞/mL，置入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行貼壁擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿85%瓶壁時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)代數(shù)超過50代而沒有衰老跡象，說明細(xì)胞原代培養(yǎng)和建系成功。
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK103865876SQ201410117528
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月26日
【發(fā)明者】宋雷 申請(qǐng)人:西北民族大學(xué)