細(xì)胞培養(yǎng)基及其在培養(yǎng)人原代腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)胞培養(yǎng)基，原料配方為：DMEM/High?Glucose（DMEM高糖培養(yǎng)基）33.33ml；HAM’S/F-12培養(yǎng)基66.67ml；植物源重組人血清白蛋白3～5mg/mL；青霉素100U/ml；鏈霉素100μg/ml；兩性霉素B2.5μg/mL；氫化可的松0.2～0.5μg/ml；胰島素3～6μg/ml；霍亂毒素B6～10ng/ml；人表皮生長(zhǎng)因子EGF9～12ng/ml；腺嘌呤22～25μg/ml；Y-276327～9μmol/L。所述細(xì)胞培養(yǎng)基可以用于培養(yǎng)人原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞。本發(fā)明改進(jìn)了培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)人原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞時(shí)，能更好地促進(jìn)原代腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，獲得更高比例的人腫瘤干細(xì)胞。
【專利說(shuō)明】細(xì)胞培養(yǎng)基及其在培養(yǎng)人原代腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)基，以及在培養(yǎng)人原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前常用的人腫瘤干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法多采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法，從細(xì)胞株中對(duì)含量極少的干細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)或者直接購(gòu)買(mǎi)干細(xì)胞株進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，而通過(guò)原代腫瘤細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的方法較難成功分離培養(yǎng)人腫瘤干細(xì)胞。
[0003]飼養(yǎng)層在細(xì)胞培養(yǎng)中的使用情況:①國(guó)外有報(bào)道使用J2 (3T3細(xì)胞的一種亞型)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)，但未提及使用其進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)。而且，J2細(xì)胞在作為飼養(yǎng)層的過(guò)程中需要嚴(yán)格控制其濃度與狀態(tài)，不易操作，且目前在國(guó)內(nèi)購(gòu)買(mǎi)不到。②國(guó)外報(bào)道，使用J2細(xì)胞作為飼養(yǎng)層要配合F培養(yǎng)基進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)。我們?cè)趯2細(xì)胞更換為BALB3T3細(xì)胞并使用F培養(yǎng)基進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在原代細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)初期，會(huì)有很長(zhǎng)一段時(shí)間的適應(yīng)期，之后才會(huì)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。而使用改良F培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，相比于F培養(yǎng)基，培養(yǎng)的人原代腫瘤細(xì)胞能夠盡快在飼養(yǎng)層脫落之前進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其生長(zhǎng)速度與飼養(yǎng)層的脫落速度達(dá)到了更好地平衡，原代細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯高于使用F培養(yǎng)基時(shí)原代細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，且可獲得更高比例的腫瘤干細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷與不足，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)基，以及在培養(yǎng)人原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0006]一種細(xì)胞培養(yǎng)基(改良F培養(yǎng)基)，其原料配方為:DMEM/High Glucose (DMEM高糖培養(yǎng)基)33.33ml ;HAM’ S/F-12培養(yǎng)基66.67ml ;植物源重組人血清白蛋白(Oryzogen，購(gòu)自武漢禾元生物科技有限公司)3~5mg/mL ;青霉素100U/ml ;鏈霉素100 μ g/ml ;兩性霉素B2.5 μ g/mL ;氫化可的松0.2~0.5 μ g/ml ;胰島素3~6 μ g/ml ;霍亂毒素B6~10ng/ml ；人表皮生長(zhǎng)因子EGF9~12ng/ml ;腺嘌呤22~25 μ g/ml ;Y_27632 (Rho相關(guān)的卷曲蛋白激酶抑制劑)7~9 μ mol/L。如表1所示。
[0007]優(yōu)選的，所述改良F培養(yǎng)基的原料配方為:DMEM/High GlucoseCDMEM高糖培養(yǎng)基)33.33ml ;HAM’S/F-12培 養(yǎng)基66.67ml ;植物源重組人血清白蛋白(Oryzogen，購(gòu)自武漢禾元生物科技有限公司)5mg/mL ;青霉素100U/ml ;鏈霉素100 μ g/ml ;兩性霉素B2.5 μ g/mL ;氫化可的松0.4 μ g/ml ;胰島素5 μ g/ml ;霍亂毒素B8.4ng/ml ;人表皮生長(zhǎng)因子EGF10ng/ml ；腺嘌呤24 μ g/ml ；Y-27632 (Rho相關(guān)的卷曲蛋白激酶抑制劑)7 μ mol/L。
[0008]表1改良的F細(xì)胞培養(yǎng)液成分及含量
[0009]
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于:原料配方為:DMEM/High Glucose(DMEM高糖培養(yǎng)基)33.33ml ;HAM’S/F-12培養(yǎng)基66.67ml ;植物源重組人血清白蛋白3~5mg/mL ;青霉素IOOU/ml ;鏈霉素100 μ g/ml ;兩性霉素B2.5 μ g/mL ;氫化可的松0.2~0.5 μ g/ml ;胰島素3~6 μ g/ml ;霍亂毒素B6~10ng/ml ;人表皮生長(zhǎng)因子EGF9~12ng/ml ;腺嘌呤22~25 μ g/ml ；Y-276327 ~9ymol/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于:所述原料配方為:DMEM/HighGlucose (DMEM高糖培養(yǎng)基)33.33ml ;HAM’S/F_12培養(yǎng)基66.67ml ;植物源重組人血清白蛋白5mg/mL ;青霉素100U/ml ;鏈霉素100 μ g/ml ;兩性霉素B2.5 μ g/mL ;氫化可的松0.4 μ g/ml ;胰島素5 μ g/ml ;霍亂毒素B8.4ng/ml ;人表皮生長(zhǎng)因子EGF10ng/ml ;腺嘌呤24 μ g/ml ；Y-276327ymol/L。
3.權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞培養(yǎng)基在培養(yǎng)人原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:具體應(yīng)用方式如下:用權(quán)利要求1或2的細(xì)胞培養(yǎng)基重懸人原代腫瘤細(xì)胞后，接種到用權(quán)利要求1或2的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)8小時(shí)后的細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)； 所述細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備方法為:采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)BALB3T3細(xì)胞，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)至鋪滿培養(yǎng)瓶70%~80%時(shí)，以3000cGy作為放射劑量進(jìn)行X線照射；照射后的BALB3T3細(xì)胞若暫時(shí)不進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)使用，則用原DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)或收集凍存；若進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)使用，則改用權(quán)利要求1或2的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)8小時(shí)后，所得培養(yǎng)物即為細(xì)胞飼養(yǎng)層。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述放射劑量為3000cGy。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述進(jìn)行X線照射的具體方式為:照射時(shí)儀器從O開(kāi)始加量，達(dá)到需要的放射劑量立即停止。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述采用細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為:保持溫度37°C，CO2濃度為5%。
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK103898056SQ201410087758
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】孫青 , 賈茹, 張建東, 岳龍濤 申請(qǐng)人:山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院