專利名稱：處理培養(yǎng)的細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及處理培養(yǎng)的細(xì)胞(cultured cells)的方法，尤其是在組織工 程和細(xì)胞療法應(yīng)用中用于細(xì)胞操作或細(xì)胞遞送的方法。
背景技術(shù)：
再生醫(yī)學(xué)是醫(yī)療科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)即將來臨的新興學(xué)科。再生醫(yī)學(xué)中使用 許多方法和途徑。它們可以粗略地分為四個(gè)方面
在體外組織工程中，利用支架和細(xì)胞使組織在身體之外生長(zhǎng)。工程 化組織隨后植入患者以替換受損或缺損組織。
在體內(nèi)組織工程中，將支架置于受損組織區(qū)域，目的是誘導(dǎo)細(xì)胞從 周圍健康組織的生長(zhǎng)以修復(fù)受損組織。
細(xì)胞療法是基于將細(xì)胞，尤其是干細(xì)胞，遞送至受損組織區(qū)域以恢 復(fù)組織功能。
有一些療法利用生長(zhǎng)因子，例如細(xì)胞因子和趨化因子，以內(nèi)源性細(xì) 胞補(bǔ)充至受損組織區(qū)域。生長(zhǎng)因子可以直接遞送到感興趣區(qū)，例如通過 注射。
細(xì)胞在體外組織工程和細(xì)胞療法中都起著關(guān)鍵作用，其中首先從合 適的細(xì)胞源收集細(xì)胞，即從患者(自體細(xì)胞源)或從供體(異體細(xì)胞源)，和 隨后經(jīng)歷幾個(gè)不同步驟，直到它們最終導(dǎo)入患者而替換或修復(fù)受損組 織。盡管細(xì)胞療法和組織工程前幾年取得了巨大發(fā)展，但是基本并且必 需的步驟，例如分別在支架中進(jìn)行的細(xì)胞操作、細(xì)胞生長(zhǎng)或向內(nèi)生長(zhǎng)， 細(xì)胞分化，細(xì)胞遞送和細(xì)胞停留(cell retainment)仍舊是疑難問題，并且 在再生醫(yī)學(xué)變得適合臨床上使用前需要進(jìn)一步改進(jìn)。
在體外組織工程中，細(xì)胞在結(jié)構(gòu)基體(structural matrix)中被接種和 生長(zhǎng)，為了在生物反應(yīng)器中長(zhǎng)出新的組織，在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和直接分化 的生物活性分子存在下。隨后新生長(zhǎng)的組織將被植入體內(nèi)。在組織工程 技術(shù)現(xiàn)狀下，不可能精確控制不同細(xì)胞類型在組織工程化產(chǎn)品中的三維 分布。很難控制細(xì)胞在三維結(jié)構(gòu)中的向內(nèi)生長(zhǎng)。細(xì)胞接種到固體多孔支 架上典型地不產(chǎn)生均勻的均質(zhì)的細(xì)胞分布。產(chǎn)生這個(gè)問題的基礎(chǔ)是下述事實(shí)足夠的孔徑是細(xì)胞遷移入支架內(nèi)部和允許營(yíng)養(yǎng)成分和代謝物充分 擴(kuò)散所需要的，而另一方面，極少數(shù)細(xì)胞保留在具有大開孔的高度多孔 結(jié)構(gòu)中和高的表面/體積比對(duì)促進(jìn)具有大量細(xì)胞的支架的種群來說是必 要的?？刂聘杉?xì)胞或祖細(xì)胞在三維結(jié)構(gòu)基體中在不同位置分化為不同的 細(xì)胞類型就更成為問題。然而控制不同細(xì)胞類型的三維分布對(duì)復(fù)雜組織 如完整器官的構(gòu)建是必不可少的。此外，控制不同細(xì)胞類型的三維分布 是提供更大的組織工程化產(chǎn)品的血管形成所必不可少的。
作為使用預(yù)先制作的多孔支架的替換方案，在本領(lǐng)域已知將細(xì)胞包 封在水凝膠、光可聚合水凝膠和熱可逆水凝膠中。這通常導(dǎo)致細(xì)胞均勻、 勻質(zhì)的細(xì)胞分布，和凝膠的高溶脹狀態(tài)允許營(yíng)養(yǎng)成分和代謝物充分?jǐn)U 散。然而，水凝膠缺乏骨組織(例如骨和軟骨)工程化所需的機(jī)械穩(wěn)定性。 再次，在一種凝膠中控制不同細(xì)胞類型的三維分布是很困難的。
(干)細(xì)胞療法的基本原理是將(干)細(xì)胞導(dǎo)入受傷或疾病區(qū)域。新導(dǎo)入 的(干)細(xì)胞具有生長(zhǎng)、分裂和分化的能力，和可以用與本地組織具有相 同或類似結(jié)構(gòu)和功能的新形成的組織恢復(fù)受損部位。正在發(fā)展的細(xì)胞療 法中的主要問題在于許多療法需要大量過量的細(xì)胞的事實(shí)。通常，僅1% 的注入的細(xì)胞被遞送和/或保留在感興趣區(qū)域并在第一周后存活。細(xì)胞價(jià) 格昂貴并且難以大量獲得(耗費(fèi)時(shí)間)。
因此，大量過量應(yīng)用這些細(xì)胞是不希望的。更重要的是，不清楚注 入后過量細(xì)胞發(fā)生了什么。它們可能是有害的并形成例如癌癥風(fēng)險(xiǎn)。
當(dāng)單獨(dú)的細(xì)胞或許多細(xì)胞被包封入小細(xì)胞載體或容器中時(shí)，很大程 度上能夠克服上述問題。本領(lǐng)域已知在細(xì)胞培養(yǎng)中使用微載體。微載體 可以是固體(細(xì)胞僅附著到表面)或載體可以是多孔的(在內(nèi)部截留細(xì)胞)。 典型的微載體是基于生物相容材料，例如膠原、羥基磷灰石、PGLA和 生物陶瓷。
微載體的使用通常限于細(xì)胞培養(yǎng)。已知只有少數(shù)報(bào)道在組織工程中 使用微載體。最近一篇論文報(bào)道了與用作可注入支架的光可聚合材料聯(lián) 合的接種有成骨細(xì)胞的基于大孔明膠的微載體的用途，描述于Dedercq H等.，Biomacromolecules 2005 (6), 1608中。
其次，在WO 96/12510中，上皮細(xì)胞生長(zhǎng)在固體微載體表面上，和 為了獲得用于治療燒傷傷口和愈合遲緩傷口的移植物，報(bào)道了在水凝 膠，例如甲基纖維素、藻酸鹽(alginates)和瓊脂糖中包含所述載體。
5在現(xiàn)有技術(shù)微載體中，作為缺陷，細(xì)胞是附著于表面或停留在大開 孔中。實(shí)際上微載體并沒有保護(hù)細(xì)胞不受環(huán)境影響(細(xì)胞和環(huán)境之間的接 觸實(shí)際上是細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)所需的)。
此外，目前的微載體不是響應(yīng)性的，因此不可能在暴露于環(huán)境和保 護(hù)不受環(huán)境影響之間進(jìn)行切換。
最近，已經(jīng)提出了裝載能夠產(chǎn)生胰島素的專用活細(xì)胞的基于硅技術(shù)
的微加工的容器(D'Aquino, R: (2004): Good Drug Therapy: It's Not Just the Molecule — It's the Delivery, Chemical Engineering Progress 100(2), 15s)。這個(gè)裝置在體外裝載細(xì)胞，隨后植入。這個(gè)裝置包括多孔膜，其 允許營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)入它的內(nèi)腔并由此飼養(yǎng)細(xì)胞，但是T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被 保持在外，由此防止免疫反應(yīng)。然而，這個(gè)裝置的制造是非常勞動(dòng)密集 的，因此不適宜在組織工程和細(xì)月包療法應(yīng)用中進(jìn)4亍細(xì)胞操作和細(xì)月包遞 送。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供上述意義的微載體，其中可以提供細(xì)胞，并且 其中對(duì)于應(yīng)用過程中的至少部分時(shí)間，例如細(xì)胞才乘作或細(xì)胞遞送，細(xì)月包 可以被保護(hù)不受環(huán)境影響。
這個(gè)目的是通過獨(dú)立權(quán)利要求所闡述的方法和二位物體實(shí)現(xiàn)的。從 屬權(quán)利要求提出優(yōu)選實(shí)施方案。在這方面，值得提及的是下面給出的所 有范圍應(yīng)理解為它們包括限定這些范圍的值。
根據(jù)本發(fā)明，提供了處理培養(yǎng)的細(xì)胞(culturedcells)的方法，包括步
驟
a) 提供平面的二維物體("薄片(flakes)"),其中這些物體包含在施 加外來刺激時(shí)由平面狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閹喦鸂顟B(tài)的材料，
b) 在所述平面薄片上提供細(xì)胞，和
c) 通過施加所述外來刺激，將所述薄片從平面狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閹喦鸂?態(tài)，由此包裹(wmpping)至少一部分所述細(xì)月包。
-通過所述"細(xì)胞包裹"技術(shù)，可以保護(hù)細(xì)胞，例如在貯存期間。 -所述"薄片，，允許建立復(fù)雜結(jié)構(gòu)；如稍后將描述的那樣。
6-由于所述外來刺激，可以把將細(xì)胞提供于薄片上的步驟和"包裹，， 步驟分開，而不是被迫在拓樸不利的環(huán)境中生長(zhǎng)和/或提供細(xì)胞。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，步驟b)包括分步驟 bl)在所述平面薄片上接種細(xì)胞；和 b2)使所述細(xì)胞生長(zhǎng)。
在所述轉(zhuǎn)變之后，從前的平面薄片可以例如采取圓柱形狀，末端開 放或基本上關(guān)閉。參見圖2和4，是這種形狀的實(shí)例。所述薄片典型的 尺寸大約是細(xì)胞的尺寸或比其稍大。這意味著根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí) 施方案，所述平面水凝膠薄片的大小或長(zhǎng)度是^10pm和5l00mm，更優(yōu) 選^10[im牙口5lOmm， 和更4尤選土20fim和^lmm,牙口最4尤選^50pm牙口 S500jum。
生長(zhǎng)的細(xì)胞包裹在巻曲的薄片之內(nèi)。所述方法確實(shí)由此提供了培養(yǎng) 的細(xì)胞的微載體。因此用根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的巻曲的薄片在下文中 將被稱作微載體。
根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，平面薄片的厚度是^100nm和 ￡lmm, 更優(yōu)選^500nm和5500[im,和最優(yōu)選三l[im和SlOOpm。
根據(jù)本發(fā)明又 一 個(gè)實(shí)施方案，巻起狀態(tài)的薄片(包括細(xì)胞)的內(nèi)徑是 ^lpm和S5mm, 更優(yōu)選^5pm和5500[im,最優(yōu)選^10(im和5訓(xùn),。
除起碼的細(xì)胞生長(zhǎng)之外，在薄片轉(zhuǎn)變?yōu)閹喦鸂顟B(tài)前，細(xì)胞可以保留 在平面薄片上進(jìn)行分化。這意味著在步驟b)和c)之間，可以加入分化步 驟。同樣地，可以在步驟b)和c)之間促進(jìn)細(xì)胞分裂、細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞增 殖(cell profilation)。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)他的知識(shí)或適當(dāng)?shù)膮⒖嘉墨I(xiàn)可 以容易地選擇為了實(shí)現(xiàn)如上提及的細(xì)胞分化將要應(yīng)用的條件。
在薄片轉(zhuǎn)變?yōu)閹喦鸂顟B(tài)之前或期間，優(yōu)選它們從它們所粘附的基底 被釋放出來。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，薄片的釋放和巻曲都由響應(yīng)性水 凝膠層的溶脹啟動(dòng)。在這個(gè)實(shí)施方案中，釋放和轉(zhuǎn)變?yōu)閹喦鸂顟B(tài)同時(shí)發(fā) 生。在非溶脹狀態(tài)下，薄片中具有極少應(yīng)力到?jīng)]有應(yīng)力，并且盡管薄片 對(duì)基底的粘附不是最佳的，但薄片也將粘附到基底。在溶脹狀態(tài)下，積 累的應(yīng)力和水凝膠層親水性的改變將引起薄片釋放。培養(yǎng)的細(xì)胞包括干 細(xì)胞和分化的細(xì)胞，例如人和非人來源的成年間充質(zhì)干細(xì)胞、成年造血 干細(xì)胞、脂肪來源的成年干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、 骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、紅細(xì)胞、淋巴祖細(xì)胞、骨髓祖細(xì)胞等等。然而，為了研究目的，
或?yàn)榱松a(chǎn)隨后用于生產(chǎn)生物物質(zhì)(biological matter)的細(xì)胞，甚至可以 使用無限增殖化細(xì)胞，即雜交瘤細(xì)胞等等。
這也意味著在使用全能干細(xì)胞的情況下，步驟c)將在細(xì)胞開始分化 前進(jìn)行。在使用多能細(xì)胞的情況下，可在誘導(dǎo)步驟c)之前進(jìn)行分化(至少 一部分)，如以上闡述的那樣。
大多數(shù)情況下，將使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件。哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括例 如人細(xì)胞，優(yōu)選在37。C、 5% COr氣氛下培養(yǎng)，以保持pH處于生理范 圍內(nèi)?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基例如FCS(胎牛血清)，和如有必要，可 以添加生長(zhǎng)因子、抗生素等等。然而，同樣落在本發(fā)明范圍內(nèi)的昆蟲細(xì) 胞、植物細(xì)胞和原核細(xì)胞將以不同條件處理，其是本領(lǐng)域所熟知的。
此外應(yīng)理解薄片的形狀可以類似正方形、矩形或平行四邊形。然而 為了實(shí)現(xiàn)更復(fù)雜的包裹狀態(tài)，可以使用更復(fù)雜的形狀。例如，為了實(shí)現(xiàn) 螺旋狀包裹狀態(tài)，薄片應(yīng)具有類似拉長(zhǎng)平行四邊形的形狀。同樣地，薄 片也可以具有圓形、橢圓形、梯形，六邊形、多邊形或三角形形狀，其 在每種情況下將引起不同的包裹狀態(tài)。拓樸地、機(jī)械地或以組合方式結(jié) 構(gòu)化的表面，和薄片內(nèi)更復(fù)雜的分層也可有助于實(shí)現(xiàn)更復(fù)雜的包裹狀 態(tài)。
在這方面，值得提及的是巻起狀態(tài)可以包括兩種情況，即至少部分 多層化的圓筒，如圖2中可見，或僅基本上閉合的圓柱體。后者意味著 兩個(gè)接觸邊緣基本上沒有重疊，這也將允許薄片閉合側(cè)邊之間更尖銳的 角度(sharper angles)。
通常，期望細(xì)胞僅僅存在于薄片上，不存在于薄片之間的基底上。 為了避免細(xì)胞安置在薄片之間的間質(zhì)(interstitium)中，可以改性下面的基 底表面使得細(xì)胞不粘附于它，或使得細(xì)胞具有明顯的偏好，生長(zhǎng)在薄片 上而不是基底上。然而，有時(shí)候即使細(xì)胞也生長(zhǎng)在基底上也無關(guān)緊要。 一旦薄片被釋放和巻起，就可以丟棄具有剩余細(xì)胞的基底。
在一些特殊情況下，薄片之間的間質(zhì)中有細(xì)胞甚至可能有益。例如， 一些困難的細(xì)胞類型需要共飼養(yǎng)細(xì)胞(co-feeder cells)來生長(zhǎng)，即為了產(chǎn) 生適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)因子。這些飼養(yǎng)細(xì)胞可以接種在薄片之間，而感興趣的細(xì) 胞生長(zhǎng)在薄片上。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述刺激選自誘導(dǎo)的pH改變，誘導(dǎo)的溫度變化，誘導(dǎo)暴露于電磁波，誘導(dǎo)暴露于離子、特定的 鹽或有機(jī)化合物或暴露于其給定濃度，施加電場(chǎng)，施加磁場(chǎng)，施加聲音， 施加振動(dòng)，誘導(dǎo)暴露于酶及其他生物分子或誘導(dǎo)抑制酶及其他生物分 子，和/或誘導(dǎo)暴露于溶劑組合物。
至于熱刺激，優(yōu)選例如當(dāng)加熱(例如^36。C)時(shí)，薄片處于平面狀態(tài)， 而冷卻(例如S35。C)時(shí)，它們轉(zhuǎn)變?yōu)閹喦鸂顟B(tài)。這特別有益，因?yàn)橥ㄟ^冷 卻薄片(以及其中包含的細(xì)胞)，細(xì)胞將停止生長(zhǎng)，和它們的代謝速度下 降。因而細(xì)胞可以儲(chǔ)存用于運(yùn)輸或準(zhǔn)備用于各個(gè)應(yīng)用，沒有損傷或不利 影響。同樣優(yōu)選選擇施加的刺激，從而不損害細(xì)胞的生理機(jī)能 (physiology)。
此外，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供的是薄片包含具有可逆溶脹性 能的刺激響應(yīng)性材料，等等，即所述剌激可以施加多次。
應(yīng)理解術(shù)語(yǔ)"電磁波，，包括可見光、紫外線和紅外光、X射線、微 波、無線電波等等。還應(yīng)理解術(shù)語(yǔ)"聲音，，包括超聲和次聲，以及可聽 聲。
在一個(gè)另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，薄片包含標(biāo)記物或標(biāo)志物。這樣的 標(biāo)記化例如可以通過4吏用染料、i茲性珠、X射線標(biāo)志物、MRI標(biāo)志物或 靶向部分如抗原、凝集素、反應(yīng)基團(tuán)等等實(shí)現(xiàn)。
標(biāo)記薄片比標(biāo)記細(xì)胞本身是更好的方式，因?yàn)檫@種標(biāo)記可能不利地 影響細(xì)胞器，包括細(xì)胞核和核酸，以及細(xì)胞生理、細(xì)胞酶、細(xì)力包代i射等 等。
這種標(biāo)記例如確實(shí)允許設(shè)計(jì)由多種細(xì)胞類型組成的組織，因?yàn)楦鱾€(gè) 薄片可以例如通過它們的標(biāo)記被識(shí)別、選擇和在支架中定位。這種定位 還可以自動(dòng)進(jìn)行，例如通過專用機(jī)器人，在這種情況下由機(jī)器人自動(dòng)探 測(cè)各種標(biāo)記物或標(biāo)志物(例如熒光標(biāo)志物)。
此外所述標(biāo)記確實(shí)允許生長(zhǎng)因子的細(xì)胞類型特異性應(yīng)用，這在包括 不同細(xì)胞類型的組織工程中非常有益。同樣，移液機(jī)器人可以用于這個(gè) 目的。
當(dāng)在細(xì)月包療法中4吏用時(shí)，可以用組織特異性抗原標(biāo)記不接觸細(xì)月包的 層。從而支持將薄片及其內(nèi)容物遞送至靶位點(diǎn)。
在這方面，X射線標(biāo)記物和MRI標(biāo)記物也可以促進(jìn)巻曲的薄片的粑 向。為了這個(gè)目的，可以使用X射線斷層攝影機(jī)(tomograph)或MRI斷層攝影機(jī)。此外，各標(biāo)記物可分別用于控制耙生物體內(nèi)部薄片的包裹和 打開，或它們的完整性或降解。
這個(gè)方式有助于減少細(xì)胞療法中所需細(xì)胞的數(shù)量，例如這引起降低
成本和資源，因?yàn)榕囵B(yǎng)的細(xì)胞;f艮昂貴，并且它們的生產(chǎn)是時(shí)間和勞動(dòng)密 集型的。更重要的是，不保留在治療區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量被降低。這再次 減少了自由漂浮在耙體內(nèi)并可能因此引起癌癥或其他疾病的細(xì)胞的任 何不需要的副作用。
當(dāng)根據(jù)上面定義的多個(gè)微容器被用于組織工程時(shí)，可以使用如上所 述的反應(yīng)基團(tuán)以彼此連接微載體，并由此形成機(jī)械穩(wěn)定的負(fù)載有細(xì)胞的 支架。
這種反應(yīng)基團(tuán)例如可以在不同的微載體之間形成共價(jià)鍵或離子鍵。 然而，其他部分同樣落在這里提及的定義"反應(yīng)基團(tuán)"中。這些部分是 例如都與微載體連接的抗原和它們相應(yīng)的抗體對(duì)，凝集素、鏈霉親和素
/生物素等等。
此外，優(yōu)選薄片包括提高生物相容性的試劑。例如，不接觸細(xì)胞的 層可以包括抗凝劑(anticoagulat),例如肝素部分，以避免血液凝固。本 領(lǐng)域技術(shù)人員將根據(jù)特殊需要選擇提高生物相容性的其他試劑。例如， 可以用特定錨固分子、生長(zhǎng)因子等等改性接觸細(xì)胞的層。
在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，薄片包括由水凝膠組成的材料。
這里使用的術(shù)語(yǔ)"水凝膠"意味著各材料的至少一部分包含在水中 形成水溶脹網(wǎng)絡(luò)的聚合物和/或水溶性的聚合物鏈的網(wǎng)絡(luò)。優(yōu)選地，水凝 膠滲透層在溶脹狀態(tài)包含250%的水和/或溶劑，更優(yōu)選^70%和最優(yōu)選 280%,其中優(yōu)選的溶劑包括有機(jī)溶劑，優(yōu)選有機(jī)極性溶劑和最優(yōu)選鏈烷 醇例如乙醇、甲醇和/或(異)丙醇。
特別優(yōu)選響應(yīng)性水凝膠。在本發(fā)明意義上，術(shù)語(yǔ)"響應(yīng)性"意思是 和/或包括尤其是水凝膠是以這樣的方式響應(yīng)在特定參數(shù)改變或施加特 定刺激時(shí)，其經(jīng)歷形狀和總體積的改變，所述特定刺激的性質(zhì)上面有進(jìn) 一步說明(例如誘導(dǎo)的pH改變、誘導(dǎo)的溫度變化、誘導(dǎo)暴露于電磁波、 誘導(dǎo)暴露于特定的鹽或有機(jī)化合物或其給定濃度、施加電場(chǎng)、施加磁場(chǎng)、 施加聲音、施加振動(dòng))。其他刺激包括專用分析物例如酶或其他生物分子 的存在或濃度。(見上述評(píng)論)。
已知水凝膠形狀對(duì)pH、離子濃度、溫度、溶劑組成和電勢(shì)敏感。
10這些參數(shù)可以引起物相(phase)、形狀、機(jī)械學(xué)(mechanics)、折射率、識(shí) 別率或滲透率的改變，其之后可以逆轉(zhuǎn)以將材料回復(fù)其原始狀態(tài)。刺激 敏感性水凝膠也已經(jīng)與酶、蛋白模擬物和抗體結(jié)合以設(shè)計(jì)可控的制動(dòng)器 (actuators)。這些水凝月交已經(jīng)^皮示出當(dāng)添加草巴分子(target molecule)時(shí)溶 脹。這些水凝膠的溶脹量歸因于聚合物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部非共價(jià)相互作用的改 變。水凝膠還可以^支設(shè)計(jì)成在把分子存在下溶脹；甚至可以以溶脹大小 與存在的配體的濃度成比例的方式構(gòu)建它們。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，水凝膠材料包括選自包含聚(甲基)丙 烯酸類材料、取代的乙烯基材料或其混合物的組的材料，以及包括 epoxydes、氧雜環(huán)丁烷類和石危醇烯類(thiolenes)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，水凝膠材料包括由至少一種(曱基) 丙烯酸類單體和至少一種多官能(曱基)丙烯酸類單體聚合制成的聚(曱 基)丙烯酸類材料。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案，所述(曱基)丙烯酸類單體選自包含 以下的組(甲基)丙烯酰胺、(曱基)丙烯酸羥乙基酯、(曱基)丙烯酸乙 氧基乙氧基乙基酯或其混合物。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案，所述多官能(曱基)丙烯酸類單體是 雙(曱基)丙烯?；?或三(曱基)丙烯?；?或四(曱基)丙烯酰基和/或五 (曱基)丙烯?；鶈误w。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述多官能(曱基)丙烯酸類單體選自 包含以下的組二(甲基)丙烯酰胺、二甘醇二 (曱基)丙烯酸酯、三甘醇 二 (曱基)丙烯酸酯、四甘醇二(曱基)丙烯酸酯、三丙二醇二(曱基)丙烯 酸酯、季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二 (甲基)丙烯酸酯、乙氧 基化雙酚-A二(曱基)丙烯酸酯、己二醇二 (曱基)丙烯酸酯或其混合物。
在發(fā)明人所進(jìn)行的測(cè)試中被證明適于上述目的的其他材料包括丙 烯酸乙基己基酯、曱基丙烯酸羥乙酯、PNIPAA-co-曱基丙烯酸異丁酯 (80:20)、 PMMA 、 PMMA-co-三羥曱基丙烷三丙烯酸酯、TMPT A 、 DEGDA 、 DEGDMA、聚苯乙烯、PMMA-co-DEGDA (2:1)、 PMMA-co-DEGDMA (2:1)、 PS-co-TMPTA (2:1)、 PS-co-DEGDA (2:1)、 PS-co畫DEGDMA (2:1)和 三2-羥乙基異氰脲酸酯三丙烯酸酯(tris 2-hydroxyethyl isocyanurate triacrylate)。
根據(jù)本發(fā)明的 一 個(gè)實(shí)施方案，水凝膠材料包括陰離子聚(曱基)丙烯酸類材料，優(yōu)選選自包括以下的組(曱基)丙烯酸類、芳基磺酸、尤其 是苯乙烯磺酸、衣康酸、巴豆酸、磺酰胺類或其混合物，和/或陽(yáng)離子聚 (曱基)丙烯酸類材料，優(yōu)選選自包含以下的組乙烯基吡咬、乙烯基咪 唑、(曱基)丙烯酸氨基乙基酯或其混合物，與選自中性單體組的至少一 種單體共聚，優(yōu)選選自下組醋酸乙烯酯、(曱基)丙烯酸羥乙基酯(曱基) 丙烯酰胺、(曱基)丙烯酸乙氧基乙氧基乙基酯或其混合物，或它們的混 合物。
已知4艮多這些共聚物作為pH的函數(shù)改變它們的形狀和響應(yīng)施加的 電場(chǎng)和/或電流而改變它們的形狀。因此這些材料可能對(duì)本發(fā)明內(nèi)的各種 各樣的應(yīng)用有用。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，水凝膠材料包括被取代的乙烯基材 料，優(yōu)選乙烯基己內(nèi)酰胺和/或被取代的乙烯基己內(nèi)酰胺。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，水凝膠材料是基于熱響應(yīng)性單體，選 自包含以下的組N-異丙基酰胺、二乙基丙烯酰胺、羧基異丙基丙烯酰 胺、羥曱基丙基甲基丙烯酰胺、丙烯?；榛?。秦，和其與選自親水性 單體組的單體的共聚物，親水性單體包括(曱基)丙烯酸羥乙基酯、(曱基) 丙烯酸、丙烯酰胺、聚乙二醇(曱基)丙烯酸酯或其混合物，和/或與選自 疏水性單體組的單體的共聚，疏水性單體包括(甲基)丙烯酸(異)丁基酯、 曱基丙烯酸甲酯、(曱基)丙烯酸異水片酯或其混合物。已知這些共聚物 是熱響應(yīng)性的，因此可以用在本發(fā)明中的各種各樣的應(yīng)用中。
這些響應(yīng)性水凝膠的 一 個(gè)優(yōu)選實(shí)例是聚-n-異丙基丙烯酰胺 (PNIPAA)。
上述水凝膠對(duì)低分子化合物，即鹽、糖類、類脂類、生長(zhǎng)因子、氧 氣等等是高度可滲透的。因此，包括這些凝膠的薄片將為細(xì)胞提供合適 的生長(zhǎng)條件，甚至在包裹狀態(tài)下。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，與細(xì)胞接觸的層不是水凝膠材料。在這些情 況下，優(yōu)選接觸層被如此構(gòu)建以使它含有允許營(yíng)養(yǎng)成分和代謝物運(yùn)輸?shù)?洞或樣i孔。然而，也可以通過包裹物的"開口側(cè)"進(jìn)行運(yùn)輸。
此外，優(yōu)選薄片包含雙層結(jié)構(gòu)。通過為不同層選擇合適材料，在給 定刺激時(shí)可以實(shí)現(xiàn)兩層的不同溶脹，例如由于不同的熱膨脹系數(shù)、水吸 收等等。這個(gè)差異提供了薄片運(yùn)動(dòng)即巻曲所需的驅(qū)動(dòng)力，其導(dǎo)致巻曲狀 態(tài)。在前者的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，薄片由非響應(yīng)性層和由響應(yīng)性水凝膠制成的層組成。
薄片也可以包括三或更多層結(jié)構(gòu)或梯度結(jié)構(gòu)，即溶脹或膠凝組分的 垂直濃度梯度，其可以引起類似的行為。上述梯度可以用本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知的方法產(chǎn)生。例如，通常用于產(chǎn)生用于電泳的梯度凝膠的梯度混 合器可以用于這個(gè)目的。產(chǎn)生組成梯度的另一個(gè)方法是通過利用聚合速 度垂直梯度(例如通過使用UV吸收劑產(chǎn)生強(qiáng)度梯度)來引起后者。
在這方面，值得提及的是上述層中的至少一個(gè)可以包含結(jié)構(gòu)化的表面。
三層的實(shí)施方案例如可以包含非常薄的頂層，從而不影響引起巻曲
運(yùn)動(dòng)的應(yīng)力機(jī)械學(xué)(stress mechanics),但是它包含與細(xì)胞生長(zhǎng)非常相容 或甚至促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的組成。
然而，在其中在薄片上生長(zhǎng)具有高融合的粘附細(xì)胞片的情況下，也 可使用單層薄片，即無梯度或分層設(shè)置的薄片。在這些情況下，細(xì)胞片 本身作為第二層并且單層薄片和粘附細(xì)胞片之間的膨脹行為的差異引 起薄片巻曲成包裹狀態(tài)。這個(gè)特征對(duì)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案特別 有用，其中細(xì)胞的粘附被用于確定細(xì)胞所處的細(xì)胞周期狀態(tài)，因?yàn)樵谝?些狀態(tài)下，細(xì)胞比在其他狀態(tài)下對(duì)其粘附點(diǎn)施加更大的拉力。
在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供的是薄片包含結(jié)構(gòu)化的細(xì)胞接觸表 面。這可以刺激細(xì)胞粘附，或有助于特定地引導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)和定向。在 這些情況下，結(jié)構(gòu)化的細(xì)胞接觸層或結(jié)構(gòu)化的非接觸層可以誘導(dǎo)薄片的 優(yōu)選巻曲方向。
此外，優(yōu)選在細(xì)胞培養(yǎng)過程中施加外部刺激以影響細(xì)月包生長(zhǎng)或細(xì)胞 分化。
這種刺激例如可以選自由以下組成的組施加生長(zhǎng)因子、施加機(jī)械 應(yīng)力或施加電或磁場(chǎng)。特別是，根據(jù)細(xì)胞類型和各自的應(yīng)用，這些刺激 可以增強(qiáng)或阻止細(xì)胞分化，以及可以控制細(xì)胞生長(zhǎng)的方向和形狀。
為了在細(xì)胞已纟皮包裹后仍然刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，還可以向接觸細(xì)胞的層 中添加生長(zhǎng)因子。
此外，在接種細(xì)胞前，優(yōu)選薄片被安置或產(chǎn)生在支撐結(jié)構(gòu)上。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，薄片包含可生物降解的和/或生物學(xué)上安全 的材料。這對(duì)于組織工程和對(duì)于在細(xì)胞療法中使用所述薄片都是重要的 特征。例如，使用可生物降解材料在某些情況下允許薄片被直接給予對(duì)象。同樣地，當(dāng)使用所述薄片進(jìn)行體外組織工程時(shí)，可以選擇所述材料 從而緩慢分解，其中分解速度對(duì)應(yīng)于細(xì)胞生長(zhǎng)的速度以及由生長(zhǎng)細(xì)胞產(chǎn)
生胞外基體(extra cellular matrix)的速度。在這個(gè)實(shí)施方案中，胞外凝膠 基質(zhì)逐步被活細(xì)胞物質(zhì)替代。
例^(口 Gunatillake P牙口 Adhikari R, European Cells and Materials (5) 2003, 1-16中描述了合適的可生物降解材料，其全部?jī)?nèi)容引入這里作為 參考。這些當(dāng)中是聚(羥基乙酸)(PGA),聚(乳酸)(PLA)和它們的共聚物 和衍生物，如聚(d,l-乳酸-co-羥基乙酸)，聚內(nèi)酯如聚(己內(nèi)酯)(PCL)和它 們的衍生物，聚(反丁烯二酸丙二醇酯)(PPF)和它的衍生物，聚酸酐如聚 [1,6-二(羧基苯氧基)己烷],酪氨酸衍生的聚碳酸酯和它們的衍生物，聚 原酸酯(POE)和它們的衍生物，降解產(chǎn)物無毒的聚氨酯(PU)如賴氨酸二 異氰酸酯(LDI, 2,6-二異氰酸根合己酸S旨)及其他脂肪族二異氰酸酯如六 亞甲基二異氰酸酯(HDI)和1,4-丁烷二異氰酸酯，例如聚(乙交酷-co-y-己 內(nèi)酯)、聚磷腈如甘氨酸乙酯聚磷腈和它們的衍生物，等等。
其他可生物降解的聚合物包括聚(馬來酸)、聚對(duì)二氧環(huán)己酮 (poly(p-dioxanone))、 聚(碳酸三亞曱基酯)、聚(3-羥基丁酸 酯)(poly(3畫hydroxibutarate))、聚(3-羥基戊酸酯)(poly(3畫hydroxyvalorate)) 和它們的共聚物。 一類合適的響應(yīng)性可生物降解聚合物是聚(N-(2-羥丙 基)甲基丙烯酰胺一/二乳酸鹽/酯)，如Soga O等人，Biomacromolecules 2004 (5) 818-821中所描述，其全部?jī)?nèi)容引入這里作為參考。
其他合適的可生物降解材料包括藻酸鹽、透明質(zhì)酸、脫乙酰幾丁質(zhì)、 膠原、明膠、蠶絲(silk)或它們的組合。
這些可生物降解材料可以使用它們本身，或它們與交聯(lián)劑 一起在網(wǎng) 絡(luò)中來使用。產(chǎn)生的網(wǎng)絡(luò)將在一定時(shí)間之后分解，并且由于交聯(lián)劑具有 小分子量，后者將被洗掉。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可生物降解材料被固 定在由不能生物降解的物質(zhì)組成的網(wǎng)絡(luò)中。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供的是薄片包含在施加外來刺激時(shí)分 解的材料。這個(gè)特征例如對(duì)于細(xì)胞療法有用，以便提高細(xì)胞在靶部位的 釋放。這可以例如通過施加超聲或紅外光實(shí)現(xiàn)，因?yàn)槎呔@示良好穿
透進(jìn)入人體或動(dòng)物體o
為了這個(gè)目的，巻曲的薄片被注入并通過在巻曲的薄片外側(cè)的靶向 部分靶向，并且當(dāng)施加外部刺激時(shí)，后者可以打開并由此使細(xì)胞暴露于
14感興趣區(qū)域。作為選擇，薄片不被靶向，而是在整個(gè)身體均勻分布，而 外部刺激僅僅集中于感興趣區(qū)域。只有在那里巻曲的薄片才將會(huì)打開并 釋放它們的細(xì)胞內(nèi)容物。
優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的過程中使用的細(xì)胞是貼壁細(xì)胞(adhering cells)。然而，也可以使用懸浮細(xì)胞。在這些情況下，可以提供的是包含 懸浮細(xì)胞的液體由于毛細(xì)力而保持在巻曲的薄片中。
用上述方法生產(chǎn)的薄片的一個(gè)優(yōu)選應(yīng)用包括在薄片由平面狀態(tài)轉(zhuǎn) 變?yōu)閹喦鸂顟B(tài)后，將巻曲的薄片以預(yù)定空間圖案分布，以便產(chǎn)生三維組 織。這種方式同樣可以用于體外和體內(nèi)組織工程。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的， 可以使用支架，其分別預(yù)先決定待生產(chǎn)的組織或器官的形狀，和其中沉 積有根據(jù)本發(fā)明的微載體。
采用這種方式，可以得到不同細(xì)胞類型的不均勻分布，這些細(xì)胞類 型已經(jīng)在不同的細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)并且進(jìn)行特殊處理并隨后包裹在不同 薄片中。用這種方式可以精確控制新生長(zhǎng)組織中哪種細(xì)胞類型在哪個(gè)地
方。作為選擇， 一種單一全能或多能細(xì)胞類型(干細(xì)胞或祖細(xì)胞)可以在 含有刺激分化為不同細(xì)胞類型的不同因子的不同薄片上培養(yǎng)。然后包裹 物可以以預(yù)定方式分配和細(xì)月包將在組織工程期間成熟為不同的組織類 型。因此，例如可以獲得骨-軟骨界面結(jié)構(gòu)體。
同樣地，可以通過如上闡迷的反應(yīng)基團(tuán)以三維方式裝配許多微載 體，從而分別生產(chǎn)組織或器官，而不使用專用支架。這同樣優(yōu)選通過機(jī) 器人來完成。
巻曲的薄片被調(diào)整為它們的開放末端彼此對(duì)準(zhǔn)(the rolled flakes are being aligned with their open ends to one another)。 通過這種方式,可以形成脈
管或連續(xù)神經(jīng)元?？梢酝ㄟ^外部因素刺激巻曲的薄片的這種排列，外部 因素例如幾何限制、外部》茲場(chǎng)或電場(chǎng)、流動(dòng)和剪切等等。
然而，當(dāng)使用轉(zhuǎn)變后采取如上所述的螺旋狀形狀的薄片時(shí)，可以獲 得相同類型的脈管狀組織。
薄片的又一個(gè)優(yōu)選應(yīng)用提供承載生長(zhǎng)的細(xì)胞的不同薄片在薄片由 平面狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閹喦鸂顟B(tài)前被疊加。通過將疊加的薄片轉(zhuǎn)變?yōu)閹喦鸂?態(tài)，獲得可能具有不同來源的細(xì)胞的同軸排列。這使得能夠使用不同細(xì) 胞(如內(nèi)皮、結(jié)締組織、血管平滑肌細(xì)胞和外膜(包含神經(jīng)))的分層排列生產(chǎn)管狀組織，如血管。
然而通過使巻起的薄片沉淀和排列到帶有承載有細(xì)胞的圖案化平 面薄片的基底上可以獲得相同結(jié)果。當(dāng)施加上述刺激時(shí)，這些薄片將由 平面狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閹喦鸂顟B(tài)薄片，由此包裹在沉積的巻起的薄片周圍。同 樣，當(dāng)使用轉(zhuǎn)變后采取如上所述的螺旋狀形狀的薄片時(shí)，可以獲得相同 類型的脈管狀組織。
所述薄片的另 一個(gè)優(yōu)選應(yīng)用提供巻曲的薄片被深度冷凍。用這種方 式，它們可以保存以備將來使用，后者在說明書中另外的地方詳細(xì)說明。
所述薄片的另 一個(gè)優(yōu)選應(yīng)用提供巻曲的薄片被遞送至受損組織區(qū) 域。在這個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選使用有助于修復(fù)受損組織的組織功能的干 細(xì)胞。這種方法對(duì)于治療神經(jīng)變性疾病像阿爾茨海默氏病或帕金森氏
癥，以及修補(bǔ)壞死組織，例如由心臟中風(fēng)(cardiac stroke)引起，很有前景。
同樣，根據(jù)本發(fā)明的微載體提供了將細(xì)胞直接靶向給受損部位的方 式。這引起成本降低和資源節(jié)約，和此外減少不保留在治療區(qū)域內(nèi)并最 終可以引起癌癥等等的細(xì)胞的數(shù)量。
此外，另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供口服給予對(duì)象包含細(xì)胞的薄片，即 它們凈皮吞咽。才艮據(jù)薄片的組成，它們可以選擇抗唾液、胃液和酶和/或抗 小腸、胰腺或膽的酶。用這種方式，可以實(shí)現(xiàn)薄片保持完整無損，以便 保護(hù)細(xì)胞直至它們到達(dá)腸內(nèi)預(yù)定部位。在那里薄片可以由于局部pH或 特定試劑例如酶的存在而各自打開或分解，并讓細(xì)胞發(fā)揮它們的作用。
又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括通過注入或手術(shù)將巻曲的薄片植入對(duì)象 中，以便接管內(nèi)分泌功能。在這種情況下，薄片含有內(nèi)分泌細(xì)胞，即胰 腺細(xì)胞，或產(chǎn)生內(nèi)分泌試劑如胰島素的細(xì)胞。薄片的靶向是可能的，如 上面所描述的那樣。
由于薄片的滲透性，營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)入內(nèi)腔并由此飼養(yǎng)細(xì)胞。同樣地， 可以分泌內(nèi)分泌試劑。同時(shí)，T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凈皮保持在外，由此防止 免疫反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了制備根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的 二維物體("薄片")的方法，包括步驟
a) 提供包括柵格的模具，其產(chǎn)生限定薄片形狀的池(wells);
b) 將前體材料澆鑄到所述模具中；和
c) 固化澆鑄的材料獲得薄片。優(yōu)選在固化后，從模具釋放薄片，并然后根據(jù)上面描述的方法使用。 然而，薄片也可以保留在模具中。在這個(gè)實(shí)施方案中，模具可以例如充 當(dāng)支撐結(jié)構(gòu)用于隨后的細(xì)胞培養(yǎng)。
可提供的是這個(gè)方法被用于提供二、三或多層薄片。在這種情況下， 將要重復(fù)澆鑄和固化步驟。通過使用用于不同層的不同前體材料，如上 所述，可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生的薄片可通過施加外來刺激由平面狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閹喦?狀態(tài)。合適的材料已在上面詳細(xì)描述。所述固化例如可以通過應(yīng)用紫外 線、電子束、熱或?qū)Ｓ霉袒瘎?shí)現(xiàn)。然而，也可以使用自固化材料。
在這個(gè)方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供幾個(gè)層被澆鑄入模具中以 便獲得多層薄片。同樣地，可以提供在整個(gè)澆鑄過程中，在薄片中獲得 梯度結(jié)構(gòu)，例如溶脹或膠凝組分的垂直濃度梯度。
在這個(gè)方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供幾個(gè)層被澆鑄入模具中以 便獲得多層薄片。這意味著首先澆鑄和固化第一層。其后澆鑄和固化第 二層，等等。同樣地，可以提供在整個(gè)澆鑄過程中，在薄片中獲得梯度 結(jié)構(gòu)，例如溶脹或膠凝組分的垂直濃度梯度。例如所述梯度可以通過在 固化期間在層上施加光強(qiáng)度梯度而形成。
此外，可以提供下列任何添加劑被添加到前體材料中
a) 提高生物相容性的試劑；b) 可生物降解的和/或生物學(xué)上安全的材料
c) 標(biāo)"i己物或才示志物；和/或
d) 生長(zhǎng)因子；
e) 抗生素。
在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供在固化之前或之后，在薄片中實(shí)現(xiàn) 結(jié)構(gòu)化的表面。這例如可以通過使用壓在薄片表面上的結(jié)構(gòu)化的模板來 進(jìn)行。也可以光聚合所述水凝膠層，例如使用吸收劑以得到厚度方向上 的梯度。在這方面，例如可以使用兩次(或更多次)UV曝露。優(yōu)選地， 步驟之一可包括使用掩模以獲得表面圖案。
另一個(gè)選擇是使用偏振光以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)化的表面。在這種情況下，通 過在偏振面中選擇性固化或光解(photolysation )可以獲得線性化的結(jié) 構(gòu)。通過用不同偏振面重復(fù)這個(gè)過程，可以在表面上產(chǎn)生柵格圖案等等。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了二維物體("薄片")，具有在上 述方法中闡述的結(jié)構(gòu)和/或材料性質(zhì)，或用上述制備方法制備。上述部件，以及要求保護(hù)的部件和根據(jù)本發(fā)明在描述的實(shí)施方案中 要使用的部件在它們的大小、形狀、材料選擇和技術(shù)概念方面不受任何 特殊例外的影響，從而相關(guān)領(lǐng)域中已知的選擇標(biāo)準(zhǔn)可以不受限制地應(yīng) 用。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了制備根據(jù)上述權(quán)利要求任一
項(xiàng)的二維物體("薄片")的方法，其包括下列步驟
a) 提供平面基底，
b) 用前體材料涂敷所述基底，
c) 利用圖案化的光源固化涂料材料，和
d) 漂洗未固化的前體材料。
薄片形狀通過光刻法獲得是一個(gè)可供選擇的方法。這意味著由光源 的如上提及的圖案確定薄片的形狀，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中光源是紫外 光源。所述圖案例如可以通過圖案掩模，或通過掃描激光獲得。
同樣，可提供的是這個(gè)方法用于提供二、三或多層薄片。在這種情 況下，將要重復(fù)涂敷和固化步驟。通過使用用于不同層的不同前體材料， 如上所述，可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生的薄片可通過施加外來刺激由平面狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)?巻曲狀態(tài)。
實(shí)施例中給出了落在上述方法定義中的實(shí)例。


在從屬權(quán)利要求、附圖和各個(gè)附圖和實(shí)施例的下列描述中公開了本 發(fā)明目的的另外細(xì)節(jié)、特征、特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，其中實(shí)施例以示例方式展示 了根據(jù)本發(fā)明的方法和薄片的優(yōu)選實(shí)施方案。
圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明方法的第一步驟，
圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明方法的后續(xù)步驟，
圖3顯示了由此生產(chǎn)的微載體的不同用途，
圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的兩個(gè)微載體的顯微照片，包括含有響應(yīng)性 水凝膠材料的雙層結(jié)構(gòu)。
圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明方法的第一步驟。其中，提供在其上設(shè)置或 制造薄片11的支撐結(jié)構(gòu)10。然后將細(xì)胞接種到薄片上，和將基底保持 在能夠使細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下。在對(duì)薄片進(jìn)行另外的處理之前，從支撐結(jié) 構(gòu)釋放它們。薄片典型的尺寸是大約細(xì)胞的尺寸或比其稍大，例如100x100 pm。
由圖1明顯看出細(xì)胞僅僅存在于薄片上，不在薄片之間的基底上。 為了避免細(xì)胞安置在薄片之間的間質(zhì)中，可以改性下面的基底表面使得 細(xì)胞不粘附于它，或使得細(xì)胞具有明顯的偏好，生長(zhǎng)在薄片上而不是基 底上。然而，有時(shí)候即使細(xì)胞也生長(zhǎng)在基底上也無關(guān)緊要。 一旦薄片被 釋放和巻起，就可以丟棄具有剩余細(xì)胞的基底。
在這里未顯示的一些特殊情況下，薄片之間的間質(zhì)中有細(xì)胞甚至可 能有益。例如， 一些困難的細(xì)胞類型需要共銅養(yǎng)細(xì)胞來生長(zhǎng)，即為了產(chǎn) 生適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)因子。這些飼養(yǎng)細(xì)胞可以接種在薄片之間，而感興趣細(xì)胞 生長(zhǎng)在薄片上。
圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明方法的后續(xù)步驟。具有細(xì)胞21的薄片20暴 露于外來刺激，用波浪形箭頭表示。
所述刺激可以包括熱、pH改變，或暴露于電磁波，例如(更多細(xì)節(jié) 參見說明書)。暴露于所述剌激在薄片中引起響應(yīng)，即前者被由平面狀態(tài) 轉(zhuǎn)變成巻曲狀態(tài)，如相應(yīng)箭頭指出的那樣。用這樣的方式，生產(chǎn)了如上 定義的微載體。
圖3顯示了由此生產(chǎn)的微載體的不同用途。例如，微載體可以用于 細(xì)胞療法。為了這個(gè)目的，微載體可以通過注射給予患者，由注射器31 表示。此外，微載體可以安置在用于體外組織工程的支架32中。然而 微載體可以用于保存細(xì)胞，例如通過冷凍，其然后用于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)， 由培養(yǎng)皿33表示。最后但并非最不重要的，微載體自身可以被用于三 維組織工禾呈。
為了這個(gè)目的，例如幾個(gè)微載體可以在反應(yīng)基團(tuán)幫助下，其構(gòu)建離 子鍵或共價(jià)鍵，或用抗原/抗體部分、鏈霉親和素/生物素等等相互連接 在一起，以構(gòu)建三維網(wǎng)絡(luò)34。
圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的兩個(gè)微載體的顯微照片，包括含有響應(yīng)性 水凝膠材料的雙層結(jié)構(gòu)。微載體大小是700x 1400|iim,和巻起時(shí)它們具 有大約500pm的直徑。用于將薄片由平面狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榘鼱顟B(tài)的刺激是 熱刺激。為誘發(fā)包裹運(yùn)動(dòng)，薄片被置于室溫的水浴中。在室溫，響應(yīng)性 水凝膠在水中顯示出強(qiáng)烈的溶脹，結(jié)果圖案化的薄片從基底釋放出來并 巻曲。 一旦將水浴加熱到高于33°C,水凝膠塌陷(PNIPAA具有33。C的 低臨界溶液溫度(LCST))和水凝膠層收縮。結(jié)果，當(dāng)加熱水浴高于33°C時(shí)，所述雙層打開。 實(shí)施例
在下文中，用實(shí)施例闡明本發(fā)明，其決不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范圍。
1.響應(yīng)性雙層薄片的生產(chǎn)
1.1. 包含Ebecryl的非響應(yīng)性頂層
為闡明用于包裹細(xì)胞目的的雙層薄片的生產(chǎn)，將Ebecryl 1810(其被 用作非響應(yīng)性頂層)，補(bǔ)充有0.1wt。/。引發(fā)劑(Irgacure651)和1:10引發(fā)劑 抑制劑(4-曱氧基苯酚)，以3000 RPM旋轉(zhuǎn)涂敷在玻璃基底(用UV-臭氧 處理10分鐘)上30秒。隨后，將基底置于兩個(gè)掩模下面， 一個(gè)具有矩形 (尺寸700|iim x 1400ium)以限定薄片和一個(gè)被條紋化以限定每個(gè)薄片內(nèi) 的條紋化Ebecryl圖案，并在帶有濾光器的UV-裝置UV-2中照射1秒。 其后，用異丙醇漂洗產(chǎn)物。
隨后，將帶有圖案化的Ebecryl層的玻璃板用作兩個(gè)基底之一以制 造由兩個(gè)平面平行基底形成的盒。圖案化的Ebecryl層設(shè)置在該盒的內(nèi) 部。通過使用50微米厚的帶作為隔離物，將該盒的間距設(shè)置為50微米， 并用由在50/50wt%水/曱醇中的50wt% n-異丙基丙烯酰胺(NIPAA)(l mol% 二乙二醇二丙烯酸酯(DEGDA))組成的反應(yīng)混合物通過毛細(xì)力填 充該盒。將該盒置于遮光掩模(正方形特征)底下并用紫外光照射4分鐘。 照射后，通過移走頂端基底打開該盒并用水漂洗。然后，將含有形成薄 片的聚合的復(fù)合材料元件的底基底置于室溫水浴中。在室溫PNIPAA水 凝膠在水中顯示強(qiáng)烈溶脹，結(jié)果圖案化的薄片從基底釋放出來并在垂直 于Ebecryl 1810條紋的方向上巻起。 一旦將水浴加熱到高于33°C, PNIPAA水凝膠塌陷(PNIPAA具有33。C的低臨界溶液溫度(LCST))和水 凝膠層收縮。結(jié)果，當(dāng)加熱水浴高于33。C時(shí)，所述雙層打開。
1.2. 通過MMA聚合制備的聚(甲基丙烯酸曱酯)作為非響應(yīng)性頂層 為闡明用于包裹細(xì)胞的目的的雙層薄片的生產(chǎn)，將曱基丙烯酸曱
酯，補(bǔ)充有3wt。/o交聯(lián)劑(DEGDMA)、 2wt。/。引發(fā)劑(Irgacure 651)和3:1 引發(fā)劑:抑制劑(4-曱氧基苯酚)，以1000 RPM旋轉(zhuǎn)涂敷在玻璃基底(用UV-臭氧處理10分鐘)上30秒。隨后在UV裝置中通過一組兩個(gè)掩才莫照 射基底100秒(以獲得與實(shí)施例1描述的相同的圖案)，置于在氮?dú)鈿夥?下的帶有UV透明玻璃蓋的不銹鋼容器中。隨后，用異丙醇漂洗產(chǎn)物。 進(jìn)一步的步驟類似于用ebecryl 1810作為非響應(yīng)性層產(chǎn)生雙層的過程。
1.3. 通過PMMA纏結(jié)制備的聚(曱基丙烯酸曱酯)作為非響應(yīng)性頂層 為闡明用于包裹細(xì)胞目的的雙層薄片的生產(chǎn)，由一個(gè)粘附側(cè)(A174
硅烷)和一個(gè)氟硅烷涂敷側(cè)組成并且以50微米厚的帶作為隔離物的盒， 用由在50/50wt%水/曱醇中的50wt% n-異丙基丙烯酰胺(NIPAA)(l mol% 二乙二醇二丙烯酸酯(DEGDA))組成的反應(yīng)混合物毛細(xì)填充。將該 盒置于遮光掩模(正方形特征)底下并用紫外光照射3分鐘。照射后，通 過移走頂端基底打開該盒并用水漂洗。然后置于90。C熱板上2分鐘，在 UV裝置中置于光掩模底下并照射120秒。最后，在茴香醚中洗滌基底 (3分鐘)，和通過將基底保持在10% HF中5分鐘，從基底釋放薄片而獲 得各個(gè)薄片。
1.4. 單一紫外線暴露
為闡明用于包裹細(xì)胞目的的雙層薄片的生產(chǎn)，將在茴香醚(或曱苯) 中的50wt% PMMA (70:30三羥曱基丙烷三丙烯酸酯)，補(bǔ)充有1\^%光 引發(fā)劑(Irgacure651),以3000 RPM旋轉(zhuǎn)涂敷在玻璃基底上30秒。涂敷 的基底在8(TC保持1分鐘。然后，通過將這個(gè)基底與第二基底偶合制備 盒，同時(shí)通過將透明膠帶作為隔離物使它們保持間隔50微米的距離。 隨后，用由在50/50 wt。/。水/曱醇中的60 wt% n-異丙基丙烯酰胺(NIPAA) (1 mol% 二乙二醇二丙烯酸酯(06。0八))+ 1% Irgacure 651組成的反應(yīng) 混合物毛細(xì)填充所述盒。將該盒置于遮光掩模(正方形特征)底下并用紫 外光照射90秒。最后，打開該盒，并且在茴香醚中洗滌含薄片的基底(3 分鐘)。通過在水中溶脹，從基底釋放薄片而獲得各個(gè)薄片。
2. 在構(gòu)建的雙層薄片中的細(xì)胞包裹
為了闡明真核細(xì)胞的包裹，制備基底，含有根據(jù)方法3制備的一定
圖案的雙層。圖案化的薄片的典型的尺寸大約是細(xì)胞的尺寸或比其稍 大，700 x 1400[am。附著于基底的下層是PNIPAA層。在PNIPAA層之上，施加PMMA 以提供良好的細(xì)胞粘附。將薄片維持在37。C。在這個(gè)溫度下，PNIPAA
底玻璃和pnip1a之間的粘附相對(duì)低，但是^圖案化的薄-保持它:的^
坦形狀并保持粘附于玻璃基底。小心地保持玻璃和雙層薄片的復(fù)合物處 于37°C ,將它們置于Nunclon Asurface Easyflask中。將A-431人表皮狀 癌纟田胞(human carcinoma epidermoid cells)才妾種到基底上并補(bǔ)充適當(dāng)?shù)呐?養(yǎng)基D畫MEM (Dulbecco，s Modified Eagle Medium),其中補(bǔ)充了 10% FCS (胎牛血清)、1% PenStrep (青霉素/鏈霉素)和1% GlutaMAX培養(yǎng)基，在 37。C在具有5% C02的濕潤(rùn)氣氛中。細(xì)胞在37。C在培養(yǎng)箱中在具有5%
C02的濕潤(rùn)氣氛中生長(zhǎng)。
在細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到足夠的融合并且細(xì)胞粘附于PMMA頂層之后，使 溫度達(dá)到室溫。通過這種操作，PNIPAA水凝膠層溶脹和薄片巻起，喪 失它們對(duì)玻璃基底的粘附和細(xì)胞被自動(dòng)包裹到小的微載體。
在上述詳細(xì)實(shí)施方案中的要素和特征的特殊組合僅僅是示例性的； 還特意設(shè)想了這些教導(dǎo)與本申請(qǐng)和通過參考引入的專利/申請(qǐng)中的其他 教導(dǎo)的互換和替換。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)到的那樣，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以想到這里描述的內(nèi)容的改變、改進(jìn)和其他執(zhí)行方式，而不背離要 求保護(hù)的本發(fā)明的精神和范圍。因此，上文的描述僅僅是示例性的并且 沒意圖作為限制。本發(fā)明的范圍由下列權(quán)利要求和其等同物限定。此外， 說明書和權(quán)利要求中使用的附圖標(biāo)記不限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.處理培養(yǎng)的細(xì)胞的方法，包括步驟a)提供平面的二維物體(薄片)，其中這些物體包含在施加外來刺激時(shí)由平面狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫砬鸂顟B(tài)的材料，b)在所述薄片上提供細(xì)胞，和c)通過施加所述外來刺激，將所述薄片從平面狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫砬鸂顟B(tài)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中步驟b)包括分步驟 bl)在所述薄片上接種細(xì)胞，和b2)使所述細(xì)胞生長(zhǎng)。
3. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述刺激選自由以下組成 的組誘導(dǎo)的pH改變、誘導(dǎo)的溫度變化、誘導(dǎo)暴露于電磁波、誘導(dǎo)暴 露于特定的鹽或有才幾化合物或其給定濃度、施加電場(chǎng)、施加i茲場(chǎng)、施加 聲音、施力。振動(dòng)。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述薄片包含由水凝膠組 成的材料。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述薄片包含雙層結(jié)構(gòu)、 三層結(jié)構(gòu)、更多層的結(jié)構(gòu)和/或梯度結(jié)構(gòu)。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在所述薄片由平面狀態(tài)轉(zhuǎn) 變?yōu)閹喦鸂顟B(tài)后，所述巻曲的薄片被以預(yù)定空間圖案分布，以便產(chǎn)生三 維組織。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在所述薄片由平面狀態(tài)轉(zhuǎn) 變?yōu)閹喦鸂顟B(tài)后，包含不同細(xì)胞類型的巻曲的薄片被以預(yù)定空間圖案分 布，以便產(chǎn)生三維的異形組織。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在所述薄片由平面狀態(tài)轉(zhuǎn) 變?yōu)閹喦鸂顟B(tài)后，巻曲的薄片被調(diào)整為它們的開放末端彼此對(duì)準(zhǔn)。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中承載經(jīng)生長(zhǎng)的細(xì)胞的不同 薄片在薄片由平面狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閹喦鸂顟B(tài)之前被疊加。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在所述薄片由平面狀態(tài) 轉(zhuǎn)變?yōu)閹喦鸂顟B(tài)后，巻曲的薄片被遞送至受損的組織區(qū)域。
11. 制備根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的二維物體(薄片)的方法，包括 步驟a) 提供包括柵格的模具，其形成限定所述薄片的形狀的池；b) 將前體材料澆鑄入所述模具中；和c) 固化澆鑄的材料以獲得薄片。
12. 二維物體(薄片)，根據(jù)權(quán)利要求1至IO任一項(xiàng)使用或用根據(jù)權(quán) 利要求11的方法制備。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明，提供了處理培養(yǎng)的細(xì)胞的方法，其包括步驟a)提供平面的二維物體(“薄片”)，其中這些物體包含在施加外來刺激時(shí)由平面狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫砬鸂顟B(tài)的材料，b)所述薄片上提供細(xì)胞，和c)通過施加所述外來刺激，將所述薄片從平面狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫砬鸂顟B(tài)。
文檔編號(hào)C12N5/00GK101600792SQ200880003077
公開日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2008年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月24日
發(fā)明者D·J·布羅爾, E·彼得斯, R·庫(kù)爾特, R·彭特曼, S·范利羅普 申請(qǐng)人:皇家飛利浦電子股份有限公司