專利名稱:處理用于生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法
處理用于生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法
發(fā)明背景
I.發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及利用紫外線C(UVC)光和過濾法處理用于生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法。
2.發(fā)明背景
細(xì)胞培養(yǎng)基和上清液的病毒污染向全世界的生物藥物制造廠家提出了巨大的挑戰(zhàn)。幾種方法已被用于滅活和/或清除細(xì)胞上清液中大或小，包膜或無包膜(或裸露)的DNA或RNA病毒顆粒。這些方法的實例包括20nm過濾技術(shù)，Q膜色譜法，和厚度過濾器技木。然而，這些方法主要用作從細(xì)胞系或組織收集的培養(yǎng)基和上清液中(即，蛋白質(zhì)生產(chǎn)的下游)病毒滅活(即，病毒清除)的方法。
因為幾個原因，這些病毒清除的方法尚沒有用于在細(xì)胞培養(yǎng)基與細(xì)胞系或組織接觸之前(即，蛋白質(zhì)生產(chǎn)的上游)處理細(xì)胞培養(yǎng)基。首先，時間和費用不允許使用這些技術(shù)處理大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)基，達(dá)到每天處理20，000L細(xì)胞培養(yǎng)基。第二，這些方法歷史上曾用于從大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)上清液除去污染物，作為治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)品施用于患者之前從大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)品的最初步驟。第三，本領(lǐng)域沒要求或記錄在蛋白質(zhì)生產(chǎn)的上游方法中對滅活或清除病毒顆粒的需要。最后，生物反應(yīng)器和發(fā)酵罐常常沒有裝備實施這些技術(shù)所需的機(jī)械裝置，并且為添加所述機(jī)械裝置而翻新現(xiàn)有設(shè)備的花費會過度高昂。
除上述技術(shù)之外，紫外線光已被用于處理大規(guī)模蛋白質(zhì)制劑，該處理先于從細(xì)胞 培養(yǎng)上清液中純化這些蛋白質(zhì)進(jìn)行。然而，與其它從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離和純化治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)品之前，處理大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)上清液的方法一祥，紫外線光照射已主要用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的下游。換言之，現(xiàn)有技術(shù)中不存在將細(xì)胞培養(yǎng)基加入生物反應(yīng)器之前，以紫外線(単獨或與其它純化和處理方法聯(lián)合)處理細(xì)胞培養(yǎng)基的方法。因此，本領(lǐng)域需要處理用于生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法。這類方法對于保護(hù)貴重細(xì)胞系不受病毒污染尤其有效，節(jié)省由于污染和不可用培養(yǎng)基造成的損失，并提高以上述細(xì)胞系生產(chǎn)蛋白質(zhì)的效率。因此，這類方法的開發(fā)將在生物藥物的生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了處理用于生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，其包括將細(xì)胞培養(yǎng)基暴露于紫外線C(UVC)光；將細(xì)胞培養(yǎng)基通過無菌過濾器；和將細(xì)胞培養(yǎng)基注入生物反應(yīng)器。
本發(fā)明還提供了處理用于生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，其包括將細(xì)胞培養(yǎng)基暴露于UVC光；將細(xì)胞培養(yǎng)基通過厚度過濾器；將細(xì)胞培養(yǎng)基通過無菌過濾器；和將細(xì)胞培養(yǎng)基注入生物反應(yīng)器。
通過以下對某些優(yōu)選實施方案和權(quán)利要求
更詳細(xì)的描述，本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案將變得清晰明白。

附圖簡述
圖I顯示了光的波長與病毒DNA/RNA破壞之間的關(guān)系。[0014]圖2顯示了以兩種類型厚度過濾器從細(xì)胞培養(yǎng)基中清除鼠白血病病毒(murineleukemia virus) (MuLV)或小鼠細(xì)小病毒(minute mouse virus) (MMV)的效率。
圖3顯示了以兩種類型厚度過濾器從細(xì)胞培養(yǎng)基中清除豬細(xì)小病毒(porcineparvovirus) (PRV)或呼腸孤病毒 3 型(reovirus3) (Reo-3)的效率。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了處理用于生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，其包括將細(xì)胞培養(yǎng)基暴露于紫外線(UVC)光；將細(xì)胞培養(yǎng)基通過無菌過濾器；和將細(xì)胞培養(yǎng)基注入生物反應(yīng)器。本發(fā)明還提供了處理用于生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，其包括將細(xì)胞培養(yǎng)基暴露于UVC光；將細(xì)胞培養(yǎng)基通過厚度過濾器；將細(xì)胞培養(yǎng)基通過無菌過濾器；和將細(xì)胞培養(yǎng)基注入生物反應(yīng)器。
在本發(fā)明的方法中，在將細(xì)胞培養(yǎng)基注入生物反應(yīng)器之前，將細(xì)胞培養(yǎng)基暴露于 UVC光。術(shù)語“紫外線”是指光的電磁波譜的ー個區(qū)段，從X-射線區(qū)域(IOOnm)直到可見光區(qū)域(400nm)。具體地，紫外線通常分為四部分(I)真空紫外線_具有100到200nm的波長，(2)紫外線C(UVC)-具有200到280nm的波長，(3)紫外線B(UVB)-具有280到315nm的波長，和⑷紫外線A(UVA)-具有315到400nm的波長(參見圖I)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基在注入生物反應(yīng)器之前暴露于具有200到280nm之間波長的UVC光。在本發(fā)明的另ー個實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基在注入生物反應(yīng)器之前，暴露于具有254nm波長的UVC光。在本發(fā)明的其它實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基暴露于具有 254nm+/_lnm 波長,或 254nm+/_2nm 波長,或 254nm+/_3nm 波長,或 254nm+/_4nm 波長，或 254nm+/_5nm 波長，或 254nm+/_6nm 波長,或 254nm+/_7nm 波長,或 254nm+/_8nm 波長，或 254nm+/_9nm 波長，或 254nm+/-10nm 波長，或 254nm+/_15nm 波長，或 254nm+/_20nm波長，或254nm+/-25nm波長的UVC光。
在本發(fā)明的方法中，UVC光用于通過破壞病毒DNA或RNA使無包膜病毒顆粒滅活。核酸的破壞滅活病毒并且防止隨后的復(fù)制。典型的裝置-或UVC反應(yīng)器-用于將溶液暴露于UVC光是利用液壓螺旋流和照射光源一起在液體水流中產(chǎn)生迪安(Dean)旋渦，使一定劑量的UVC照射均勻到達(dá)溶液各處。當(dāng)UVC光用于使未包膜的病毒顆粒滅活時，病毒滅活通常發(fā)生于暴露后約5分鐘。
正如本文所描述的，本領(lǐng)域已知的病毒清除方法幾乎專用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的下游。除花費和時間的考慮之外，這些方法幾乎專用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的下游是因為這些方法的目標(biāo)是，在從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化和分離治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)品之前，滅活和/或清除大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒顆粒。至于使用UVC光滅活大規(guī)模生物エ藝中的病毒顆粒，現(xiàn)有技術(shù)中缺少使用UVC光照射蛋白質(zhì)生產(chǎn)上游的處理的ー個原因是細(xì)胞培養(yǎng)基高度吸收254nm的UVC光，這種高度吸收影響這類培養(yǎng)基支持細(xì)胞有效生長的能力。本發(fā)明的方法通過提高UVC光的能量避免這個問題。
術(shù)語“能量”是指以焦耳/米2計暴露到處理的細(xì)胞培養(yǎng)基的紫外輻射量。在本發(fā)明的一個實施方案中，在將細(xì)胞培養(yǎng)基注入生物反應(yīng)器之前，將細(xì)胞培養(yǎng)基暴露于能量密度為120-320J/m2的UVC光。在本發(fā)明的另ー個實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基在注入生物反應(yīng)器之前暴露于能量密度為238J/m2的UVC光。在本發(fā)明的其它實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基暴露于能量密度為 238J/m2+/-lJ/m2，或 238J/m2+/_2J/m2，或 238J/m2+/_3J/m2，或 238J/m2+/_4J/m2，或 238J/m2+/-5J/m2，或 238J/m2+/_10J/m2，或 238J/m2+/_15J/m2，或 238J/m2+/_20J/m2，或 238J/m2+/-25J/m2，或 238J/m2+/_30J/m2，或 238J/m2+/_40J/m2，或 238J/m2+/_50J/m2，或238J/m2+/-60J/m2,或 238J/m2+/_70J/m2 的 UVC 光。[0023]本發(fā)明的方法可用于小規(guī)模(bench-scale)的滅活處理，但是更有意義地可用于在將細(xì)胞培養(yǎng)基注入生物反應(yīng)器之前，將細(xì)胞培養(yǎng)基大規(guī)模處理。本發(fā)明的一個實施方案中，在將細(xì)胞培養(yǎng)基注入生物反應(yīng)器之前，將細(xì)胞培養(yǎng)基以1-12升每小時的流速暴露于UVC光。在本發(fā)明的另ー個實施方案中，在將細(xì)胞培養(yǎng)基注入生物反應(yīng)器之前，將細(xì)胞培養(yǎng)基以6升每小時的流速暴露于UVC光。在本發(fā)明的其它實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基以6升每小時+/-I升每小時，或6升每小時+/-2升每小時,或6升每小時+/-3升每小時,或6升每小時+/-4升每小吋，或6升每小時+/-5升每小時的流速暴露于UVC光。
“對數(shù)下降值”(LRV)是過濾法保有效率的衡量方式，等于初始濃度(challengeconcentration)除以濾出液濃度的比的對數(shù)(LRV = Log1。(初始濃度/濾過濃度))。在本發(fā)明中，初始濃度是指細(xì)胞培養(yǎng)基中病毒材料的濃度。為達(dá)到本發(fā)明的目的，濾液(即，細(xì)胞培養(yǎng)基)如果具有至少4. 85的LVR則被認(rèn)為是無菌的，并且優(yōu)選具有6-7LVR的濾液。在本發(fā)明的一個實施方案中，對細(xì)胞培養(yǎng)基處理后，可獲得大于或等于4. 85的對數(shù)下降值。在另ー個實施方案中，對細(xì)胞培養(yǎng)基處理后，可獲得6-7之間的對數(shù)下降值。
在本發(fā)明的方法中，細(xì)胞培養(yǎng)基暴露于UVC光后再接受過濾步驟。術(shù)語“無菌過濾法”或“無菌過濾器”是指通過使用標(biāo)準(zhǔn)的生物學(xué)無菌過濾器從細(xì)胞培養(yǎng)基中清除微等離子體(micro plasma)和其它潛在的污染物。在本發(fā)明的一個實施方案中，在將細(xì)胞培養(yǎng)基注入生物反應(yīng)器之前，將細(xì)胞培養(yǎng)基通過無菌過濾器，該無菌過濾器具有最大尺寸為200nm的孔。
在本發(fā)明的另ー個實施方案中，將細(xì)胞培養(yǎng)基通過厚度過濾器。術(shù)語“厚度過濾器”是指具有多重過濾層的過濾器，每層負(fù)責(zé)不同大小和密度的微粒物質(zhì)的過濾。這種類型過濾過程與大小排阻相似。輕材料在濾床的上部被分離。在較低的層中培養(yǎng)基逐漸變純并變濃。大懸浮顆粒物在較上層被清除，而小顆粒在較下層被清除。
厚度過濾器清除某些類型病毒顆粒的能力依賴于被過濾溶液的pH。例如，當(dāng)具有較低PH的細(xì)胞培養(yǎng)基通過厚度過濾器時，培養(yǎng)基中的無包膜病毒顆?？筛行У乇粡呐囵B(yǎng)基清除。細(xì)胞培養(yǎng)基通常具有約15到20mS/cm的高導(dǎo)電率和7. 4的pH，這有利于包膜病毒顆粒的清除。因此，在中性PH條件下進(jìn)行過濾可確保對包膜病毒較高的LRV，其pi為6. 0-7. 8。在本發(fā)明的一個實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基以酸性pH通過厚度過濾器。在本發(fā)明的另ー個實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基以PH 5. O通過厚度過濾器。本發(fā)明的其它實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基以4. 0-5. O之間，或5. 0-6. O之間，或6. 0-7. O之間的pH通過厚度過濾器。
本發(fā)明的方法可用于在將細(xì)胞培養(yǎng)基注入生物反應(yīng)器之前滅活其中可能存在的病毒顆粒。本發(fā)明的其它方法也可用于清除病毒顆粒(包括暴露于UVC光的可能未被滅活的病毒顆粒)。在本發(fā)明的ー個方法中，將細(xì)胞培養(yǎng)基暴露于具有這樣的波長或能量的UVC，或者以這樣的流速，所述的波長或能量或流速足夠破壞細(xì)胞培養(yǎng)基中所有無包膜病毒的核酸。在本發(fā)明的另ー個方法中，將細(xì)胞培養(yǎng)基通過具有這樣的孔徑的厚度過濾器，或以這樣的流速，所述的孔徑或流速足夠清除細(xì)胞培養(yǎng)基中的所有包膜病毒。
在本發(fā)明的方法中，在將細(xì)胞培養(yǎng)基注入生物反應(yīng)器之前處理細(xì)胞培養(yǎng)基。術(shù)語“生物反應(yīng)器”是指用于大規(guī)模培養(yǎng)用于制備生物藥物的細(xì)胞系或組織的裝置或系統(tǒng)。例如，典型的生物反應(yīng)器可用于生產(chǎn)200到20，000L細(xì)胞培養(yǎng)上清液(包括生物過程中預(yù)期的副產(chǎn)品，生物藥物蛋白質(zhì))。在本發(fā)明的方法中，生物反應(yīng)器可用于支持用于例如抗體的大規(guī)模生產(chǎn)的細(xì)胞的生長。
本發(fā)明提供了在將細(xì)胞培養(yǎng)基注入生物反應(yīng)器的上游滅活和/或清除細(xì)胞培養(yǎng)基中的病毒顆粒的方法。本發(fā)明的益處之ー是通過在將細(xì)胞培養(yǎng)基注入生物反應(yīng)器的上游處理細(xì)胞培養(yǎng)基，使接種時的污染風(fēng)險降低，從而為最高量的細(xì)胞生長和最大量的蛋白質(zhì)生產(chǎn)(例如，抗體滴度)提供更好的環(huán)境。而且，本發(fā)明可用于降低生產(chǎn)成本損失的風(fēng)險(例如，與病毒污染后生物藥物制造過程的維護(hù)停エ相關(guān))。
經(jīng)處理的細(xì)胞培養(yǎng)基可用于支持許多不同種類型細(xì)胞的生長。在本發(fā)明的ー個實施方案中，經(jīng)處理的細(xì)胞培養(yǎng)基用于支持哺乳動物細(xì)胞的生長。在本發(fā)明的另ー個實施方案中，哺乳動物細(xì)胞能產(chǎn)生抗體。在本發(fā)明的另ー個實施方案中，處理的細(xì)胞培養(yǎng)基用干支持昆蟲細(xì)胞的生長。
以下的實施例是用作說明本發(fā)明，和其各種用途的特定實施方案。它們僅作為解釋說明的目的，而不作為對本發(fā)明的限制。
實施例I
細(xì)胞培養(yǎng)基的特征
本發(fā)明的方法可用于處理用于生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)基。對三種類型細(xì)胞培養(yǎng)基的滲透壓，25°C時的導(dǎo)電率，和254nm處的吸光度進(jìn)行了分析(見表I)。
表I
權(quán)利要求
1.處理用于生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，其包括 (a)將所述細(xì)胞培養(yǎng)基暴露于紫外線C(UVC)光； (b)將所述細(xì)胞培養(yǎng)基通過無菌過濾器；和 (c)將所述細(xì)胞培養(yǎng)基注入生物反應(yīng)器。
2.權(quán)利要求
I所述的方法，其進(jìn)一步在步驟(b)之前包括步驟 (a2)將所述細(xì)胞培養(yǎng)基通過厚度過濾器。
3.權(quán)利要求
I或2所述的方法，其中所述UVC光具有254nm的波長。
4.權(quán)利要求
I或2所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基以1-12升每小時的流速暴露于UVC 光。
5.權(quán)利要求
I或2所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基以6升每小時的流速暴露于UVC光。
6.權(quán)利要求
I或2所述的方法，其中所述方法提供大于或等于4.85的病毒對數(shù)下降值。
7.權(quán)利要求
6所述的方法，其中所述對數(shù)下降值是6-7。
8.權(quán)利要求
I或2所述的方法，其中將所述細(xì)胞培養(yǎng)基暴露于能量密度為120-320J/m2的UVC光。
9.權(quán)利要求
I或2所述的方法，其中將所述細(xì)胞培養(yǎng)基暴露于能量密度為238J/m2的UVC 光。
10.權(quán)利要求
I或2所述的方法，其中所述無菌過濾器具有最大尺寸為200nm的孔。
11.權(quán)利要求
I或2所述的方法，其中將所述細(xì)胞培養(yǎng)基暴露于UVC光的步驟足以破壞所述細(xì)胞培養(yǎng)基中所有無包膜病毒的核酸。
12.權(quán)利要求
I或2所述的方法，其中經(jīng)處理的細(xì)胞培養(yǎng)基用于支持哺乳動物細(xì)胞的生長。
13.權(quán)利要求
12所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗體。
14.權(quán)利要求
I或2所述的方法，其中經(jīng)處理的細(xì)胞培養(yǎng)基用于支持昆蟲細(xì)胞的生長。
15.權(quán)利要求
2所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基以酸性的pH通過厚度過濾器。
16.權(quán)利要求
2所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基以pH5.0通過厚度過濾器。
17.權(quán)利要求
2所述的方法，其中將所述細(xì)胞培養(yǎng)基通過厚度過濾器的步驟足以清除細(xì)胞培養(yǎng)基中的所有包膜病毒。
專利摘要
本發(fā)明提供了利用紫外線C(UVC)光和過濾法處理用于生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法。
文檔編號C12N5/07GKCN101821381 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200880020264
公開日2012年9月5日 申請日期2008年6月12日
發(fā)明者F·M·索拉莫, J·周 申請人:安姆根有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (1),