專利名稱:產(chǎn)l-精氨酸的谷氨酸棒狀桿菌變種及其制備方法
產(chǎn)L-精氨酸的谷氨酸棒狀桿菌變種及其制備方法
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及ー種產(chǎn)L-精氨酸的突變菌株及其制備方法，這種菌株以高產(chǎn)率生產(chǎn)醫(yī)藥エ業(yè)中使用的L-精氨酸。特別是，本發(fā)明涉及包含argD2基因(Ncgl235。的多核苷酸，該基因是谷氨酸棒狀桿菌中精氨酸生物合成中涉及的乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的推定基因、由該多核苷酸編碼的多肽、包含該多核苷酸的重組載體，能夠以高產(chǎn)率生產(chǎn)L-精氨酸的轉(zhuǎn)化體，其通過將重組載體引入生產(chǎn)L-精氨酸的宿主微生物來過表達argD2基因來制備、以及通過培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體來生產(chǎn)L-精氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-精氨酸是在植物種子或大蒜中發(fā)現(xiàn)的游離形式的氨基酸。L-精氨酸廣泛用于醫(yī)藥、食品等等中作為有效的添加剤。L-精氨酸作為提高肝功能和腦功能、治療男性不育的藥物以及復(fù)合氨基酸補充劑的組分是十分有用的。此外，L-精氨酸已用作魚餅和保健飲料中的食品添加劑，且近來還作為高血壓病人的鹽替代品。
通過生物發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的常規(guī)方法是基于碳源和氮源直接生產(chǎn)L-精氨酸。例如，L-精氨酸可使用來源于屬于短桿菌屬或棒狀桿菌屬的生產(chǎn)谷氨酸的微生物的突變株(日本未經(jīng)審查的專利公開號Sho57-163487、Sho60-83593和Sho62j65988)，或使用通過細胞融合提高生長性質(zhì)的生產(chǎn)氨基酸的微生物(日本未經(jīng)審查的專利公開號 Sho59-158185)來生產(chǎn)。近來，有報道L-精氨酸可使用重組菌株來生產(chǎn)，該菌株中參與調(diào)節(jié)精氨酸生物合成的argR基因失活(美國專利申請?zhí)?002/0045223A1)，還可使用過表達精氨酸操縱子的argF基因的方法(韓國專利申請?zhí)?0-2004-10721 來生產(chǎn)。
在微生物中，L-精氨酸的生物合成要經(jīng)過八個酶步驟，起始于前體L-谷氨酸以及隨后的兩個不同途徑，線性途徑或循環(huán)途徑。
在屬于棒狀桿菌屬的微生物中，L-精氨酸通過從L-谷氨酸開始，經(jīng)N-乙酰谷氨酸、N-乙酰谷氨酰磷酸鹽、N-乙酰谷氨酸半醛、N-乙酰鳥氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸和精氨酸代琥珀酸的循環(huán)途徑來合成。這些中間體通過酶例如谷氨酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、 N-乙酰谷氨酸激酶、乙酰谷氨酸半醛脫氫酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、鳥氨酸羧基轉(zhuǎn)移酶 (cabomoyltransferase)、精氨酸琥珀酸酯合酶和精氨基琥珀酸裂解酶催化的連續(xù)反應(yīng)來合成。這些酶分別由argj、argB、argC、argD、argF、argG和argH基因編碼。
為了以高產(chǎn)率生產(chǎn)L-精氨酸，本發(fā)明者長期進行了 L-精氨酸生物合成中涉及的酶的研究。他們發(fā)現(xiàn)在精氨酸生物合成的中間步驟中，放大N-乙酰谷氨酸半醛至N-乙酰鳥氨酸的轉(zhuǎn)化中涉及的酶反應(yīng)可以增加L-精氨酸流量，從而提高L-精氨酸的產(chǎn)率。
在細胞中存在多種氨基轉(zhuǎn)移酶，根據(jù)它們的相互結(jié)構(gòu)親緣關(guān)系分為四個亞型。亞型I包含天冬氨酰鳥氨酸、丙氨酸、酪氨酸、histidiolphosphate和苯丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶， 亞型II包含乙酰鳥氨酸、鳥氨酸、ω-氨基酸、氨基丁酸鹽和苯丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，亞型III 包含D-丙氨酸和支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶，亞型IV包含絲氨酸和磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (Perdeep K. MEHTA 等人，Eur. J. Biochem.，214，549-561，1993)。
3[0008]已知在谷氨酸棒狀桿菌中，精氨酸生物合成中涉及的argCJBDF基因作為操縱子存在，且由于精氨酸的反饋抑制被調(diào)控(Vehary Sakanyan等人，Microbiology，142 9-108，1996)。因此，這限制了 L-精氨酸的高產(chǎn)率生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
相應(yīng)地，本發(fā)明者努力開發(fā)能夠以較高產(chǎn)率生產(chǎn)L-精氨酸的菌株。他們發(fā)現(xiàn) argD2基因轉(zhuǎn)化的微生物過表達argD2基因并且以比親緣菌株高的產(chǎn)率生產(chǎn)L-精氨酸，從而完成本發(fā)明，其中argD2基因是具有與編碼乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的argD基因相同的功能的ー個推定基因。
技術(shù)方案
本發(fā)明的目的是提供argD2基因(Ncgl2355)編碼的多肽，argD2基因是谷氨酸棒狀桿菌的精氨酸生物合成中涉及的乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的推定基因。
本發(fā)明的另ー個目的是提供包含編碼該多肽的堿基序列的重組載體。
本發(fā)明的另ー個目的是提供能夠以高產(chǎn)率生產(chǎn)L-精氨酸的轉(zhuǎn)化體，其通過引入該重組載體來制備。
本發(fā)明的另ー個目的是提供通過培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體來生產(chǎn)L-精氨酸的方法。


圖1表明了重組質(zhì)粒pHC131T-argD2的構(gòu)建過程，其中所述質(zhì)粒包含argD2基因、 CJl啟動子和ITnB1B2終止子。
實施本發(fā)明的最佳方式
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了 argD2基因(Ncgl2355)編碼的多肽，argD2基因是谷氨酸棒狀桿菌的精氨酸生物合成中涉及的乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的推定基因。優(yōu)選地，該多肽的氨基酸序列表示為SEQ ID NO. 1。
根據(jù)基于基因組的分析，作為谷氨酸棒狀桿菌的精氨酸生物合成中涉及的乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的推定基因的argD2基因(Ncgl235。是歸類為亞型II的氨基轉(zhuǎn)移酶 (AliceC. McHardy 等人，J. Biotechnology, 104，229-240, 2003)，但是，argD2 編碼的蛋白質(zhì)的功能還沒有清楚地鑒定。在argD和argD2基因間有少許序列同源性，然而，這兩種基因均具有相同基序，氨基轉(zhuǎn)移酶亞型II。因此推斷argD2基因編碼的蛋白質(zhì)與argD基因編碼的且是精氨酸生物合成所需要的乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(www. Renome. jp/keRR/)具有相似的功能。
在本發(fā)明的ー個具體實施方案中，可以看到用包含argD2基因的重組載體轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)L-精氨酸的菌株以比親緣菌株高的產(chǎn)率生產(chǎn)L-精氨酸。
在本發(fā)明的另ー個實施方案中，本發(fā)明提供了編碼SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的多核苷酸。優(yōu)選地，該多核苷酸的堿基序列可表示為SEQ ID N0. 2。此外，本發(fā)明提供了與 SEQ ID N0. 2的堿基序列具有70%或更高同源性的多核苷酸，優(yōu)選與SEQ ID N0. 2的堿基序列具有90%或更高同源性。
在本發(fā)明的另ー個實施方案中，本發(fā)明提供了包含該多核苷酸的重組載體。優(yōu)選地，該重組載體可包含SEQ ID NO. 2表示的多核苷酸，并且可以是根據(jù)本發(fā)明的ー個具體實施方案制備的重組載體pHC131T-argD2。
該重組載體可根據(jù)使用DNA重組技術(shù)的任何已知方法由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地制備。例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，基因組DNA分離自L-精氨酸生產(chǎn)菌株，使用分離的基因組DNA作為模板進行PCR以擴增argD2基因的ORF區(qū)域。為了制備過表達的重組載體，CJl啟動子(韓國專利號10-0620092)和rrnB^終止子區(qū)域分別用pECCG117_CJl和大腸桿菌K-12作為模板來擴增。已知為產(chǎn)氨短桿菌Hsp60上游區(qū)域且在谷氨酸棒狀桿菌中強烈表達的CJl啟動子和可商業(yè)獲得的rrnBlB2終止子分別用作啟動子和終止子。在這個關(guān)系中，argD2基因的堿基序列通過常規(guī)測序方法分析。啟動子區(qū)域、終止子區(qū)域和argD2 基因克隆至適合的質(zhì)粒或其它克隆載體上，然后轉(zhuǎn)化至適合的感受態(tài)細胞中以制備重組載體(圖1)。
在重組載體的制備中，任何原核或真核細胞中表達的載體都可用作克隆載體，在本發(fā)明的ー個具體的實施方案中，使用了質(zhì)粒pECCG117(Han J. K.等人， Biotechnologyletters, 13 (10) :721_726，1991 或韓國專利公開號 92-7401)。此外，L-精氨酸生產(chǎn)菌株包含所有能夠生產(chǎn)L-精氨酸的微生物，包括原核或真核細胞，優(yōu)選能夠生產(chǎn) L-精氨酸的大腸桿菌、棒狀桿菌和桿菌屬，更優(yōu)選能夠生產(chǎn)L-精氨酸的谷氨酸棒狀桿菌。
在另ー個實施方案中，本發(fā)明提供了能夠以高產(chǎn)率生產(chǎn)L-精氨酸的轉(zhuǎn)化體，其通過將重組載體引入至L-精氨酸生產(chǎn)宿主微生物以過表達argD2基因來制備。
特別地，該宿主微生物具有高DNA引入效率和表達效率，并且可以是任何能夠生產(chǎn)L-精氨酸的微生物，包括原核或真核細胞。其優(yōu)選的實例包括選自由大腸桿菌屬、產(chǎn)氣桿菌屬、裂殖酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、念珠菌屬、漢森酵母屬、德巴利酵母屬、 接合酵母屬、毛霉菌屬、球擬酵母屬、甲基桿菌屬、沙門氏菌屬、桿菌屬、鏈霉菌屬、假單胞桿菌屬、短桿菌屬、趨磁螺菌屬和棒狀桿菌屬組成的組的任何一個，更優(yōu)選的微生物屬于棒狀桿菌屬，其具有對L-精氨酸類似物的抗性且生產(chǎn)L-精氨酸，最優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌 ATCC21493或ATCC21831。L-精氨酸類似物的實例包括洋刀豆中發(fā)現(xiàn)的α -氨基酸刀豆氨酸和精氨酸異羥肟酸鹽/酷。
在本發(fā)明的ー個具體的實施方案中，將重組載體pHC131T-argD2引入至具有 L-精氨酸類似物抗性且生產(chǎn)L-精氨酸的谷氨酸棒狀桿菌ATCC21493和谷氨酸棒狀桿菌 ATCC21831中以制備轉(zhuǎn)化的微生物CA06-0012和CA06-0013。轉(zhuǎn)化的微生物CA06-0012和 CA06-0013于2006年12月13日保存于韓國微生物培養(yǎng)中心(在下文中縮寫為“KCCM”)， 其保藏編號分別為KCCM10820P和KCCM10821P。
轉(zhuǎn)化的微生物可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過任何已知方法很容易地制備。如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”意為將DNA引入至宿主細胞中以便復(fù)制DNA，即可作為染色體外元件也可整合至染色體，即通過引入外源DNA至宿主細胞的人工基因改造。其實例包括CaCl2 沉淀、通過使用DMSO(ニ甲亞砜)作為還原物質(zhì)的改良CaCl2方法的Hanahan方法、電穿孔法、磷酸鈣沉淀、原生質(zhì)融合、使用碳化硅纖維的攪拌、土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、PEG、硫酸葡聚糖和脂質(zhì)體(lipofectamine)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明的一個實施方案中，重組載體 pHC131T-argD2通過電穿孔法引入至宿主細胞中以制備轉(zhuǎn)化體，然后使用其抗生素耐藥性篩選出含有該重組載體的菌株。[0029]為了增加根據(jù)本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)化體的L-精氨酸產(chǎn)率，該轉(zhuǎn)化體的染色體中存在的argD2基因可通過常規(guī)的重組技術(shù)另外表達或刪除。在本領(lǐng)域中已知其堿基序列可通過使用熒光的測序方法來分析。
在L-精氨酸的生物合成途徑中，鳥氨酸是精氨酸的代謝途徑中的ー個中間體并且是氮代謝和尿素循環(huán)中的重要物質(zhì)。通過本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的CA06-0012和CA06-0013 菌株是過表達argD2基因的轉(zhuǎn)化體，通過以下方法制備。編碼具有乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的功能的推定蛋白質(zhì)的argD2基因是通過對L-精氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒狀桿菌ATCC21831 的染色體進行PCR獲得的，將它插入至ー個載體中，然后引入L-精氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒狀桿菌ATCC21493和ATCC21831中。發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的CA06-0012和CA06-0013菌株過表達argD2基因以增加N-乙酰鳥氨酸的合成，從而活化精氨酸生物合成途徑以高產(chǎn)率生產(chǎn)L-精氨酸。
相應(yīng)地，在另ー個實施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)L-精氨酸的方法，包含培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的步驟，優(yōu)選由保藏編號KCCM10820P和KCCM10821P代表的轉(zhuǎn)化體。
根據(jù)本發(fā)明的L-精氨酸生產(chǎn)方法，轉(zhuǎn)化的L-精氨酸過表達微生物的培養(yǎng)可在適合的培養(yǎng)基和本領(lǐng)域已知的培養(yǎng)條件下進行。培養(yǎng)方法可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所選菌株容易地調(diào)整。培養(yǎng)方法的實例包括但是不限于分批型、連續(xù)型和補料型方法。在文獻中公開了多種培養(yǎng)方法，例如“Biochemical Engineering”(James Μ. Lee, Prentice—HalIInternationa丄 Editions，pp 138—176，1991)。
在培養(yǎng)中，可適當添加氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸和硫酸以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH。可適當添加消泡劑例如脂肪酸聚乙ニ醇酯以降低培養(yǎng)物中泡沫的形成。此外，為了在需氧狀態(tài)下維持培養(yǎng)，氧氣或含氧氣體(例如空氣)可注入培養(yǎng)物中。培養(yǎng)物維持在20-45°C，優(yōu)選25-40°C?？沙掷m(xù)培養(yǎng)直到獲得預(yù)計量的L-精氨酸，優(yōu)選持續(xù)10-160小吋。從肉湯培養(yǎng)物中分離L-精氨酸可通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法來進行。其實例可包括離心、過濾、離子交換色譜和結(jié)晶。例如，培養(yǎng)物可低速離心以除去生物質(zhì)，然后上清液可通過離子交換色譜分離。
實施例
在下文中，將參考實施例更詳細地描述本發(fā)明。但是，這些實施例僅作說明目的， 而本發(fā)明不受這些實施例的限制。
實施例1. argD2基因、CJl啟動子和IrnB1B2終止子的制備
為了構(gòu)建包含argD2基因、CJl啟動子和rrnB^終止子的重組載體pHC131T，其中 argD2基因是谷氨酸棒狀桿菌的精氨酸生物合成中涉及的乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的推定基因、CJl啟動子在谷氨酸棒狀桿菌中被強烈表達，ー個包括argD2基因的開放閱讀框(在下文中縮寫為“0RF” )的DNA片段(1. 371Kb)獲得自L-精氨酸生產(chǎn)菌株ATCC21831的基因組DNA(gDNA)，然后分別使用pECCG117-CJl (韓國專利申請?zhí)?0-2004-10721 和大腸桿菌 K-12W3110作為模板進行PCR以獲得CJl啟動子(0. 3Kb)和IrnB1B2終止子(0. 4Kb)。
實施例1-1.包括arri)2基因的ORF的DNA片段的擴增
基因組DNA(gDNA)使用Genomic-tip系統(tǒng)OlIAGEN，在下文中相同)提取自L-精氨酸生產(chǎn)菌株ATCC21831。為了擴增包括argD2基因的ORF的DNA片段(1. 371Kb)，聚合酶鏈反應(yīng)(在下文中縮寫為“PCR”)使用gDNA作為模板和PTC-200 Piltier ThermalCycler (MJ ReSearch，USA，在下文中相同)進行。同吋，擴增argD2基因的ORF區(qū)域所使用的引物如下 SEQ ID NO. /5' -tcccccgggggattggcatgaagggttac-j'禾ロ SEQ iD NO. 8 5' -gctctagagct tagaacaacgccccagc-3，。PCR條件包括25個循環(huán)的94°C變性30秒、55°C退火30秒和72°C 延伸1分鐘。PCR產(chǎn)物進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，然后從膠上洗脫1. 3kb的條帶。
實施例1-2. CTl啟動子的擴增
為了擴增CJl啟動子，使用pECCG117-CJl (韓國專利申請?zhí)?0-2004-107215)作為模板和PTC-200 Piltier Thermal Cycler進行PCR。同時，擴增CJl啟動子所用的引物如下:SEQ ID NO. 3 5' -cgggtaccaccgcgggcttattccattacat-3'禾ロ SEQ ID NO. 4 5' -acgc gatatcttaatctcctagattgggtttc-3，。PCR 條件包括 25 個循環(huán)的 94°C變性 30 秒、55°C退火 30秒和68°C延伸30秒。PCR產(chǎn)物進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，然后從膠上洗脫0. 3kb的條
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實施例1-3. IrnB1B2終Ih子的擴增
基因組DNA (gDNA)使用Genomic-tip系統(tǒng)提取自大腸桿菌K-12 W3110。為了擴增止子，使用 gDNA 作為模板和 PTC-200 Piltier Thermal Cycler 進行 PCR。同時，
擴增止子所用的引物如下SEQ ID NO. 5 :5，-gctctagagctgttttggcggatgaga_3，
禾ロ SEQ ID NO. D 5' -ataagaatgcggccgccgcaaaaaggccatccgtcag-j 。 PCR 1^41CJl
啟動子相同。PCR產(chǎn)物進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，然后從膠上洗脫411bp的條帶。
實施例2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建
實施例2-1.重組質(zhì)粒PHC131T的構(gòu)建
質(zhì)粒pECCG_117(Han J. K.等人，Biotechnology letters, 13(10) :721-726,1991 或韓國專利公開號92-7401)，是大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體，用限制性內(nèi)切酶 EcoRV和KpnI處理，然后進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳以洗脫大約5. 9Kb的條帶。此外，實施例1-2中制備的CJl啟動子用限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRV處理，然后使用Quiaquick PCR 純化試劑盒Oliagen，在下文中相同)分離。
兩個DNA片段使用Quick ligation試劑盒(NEB，在下文中相同)連接以制備重組質(zhì)粒PECCG117-CJ1。重組質(zhì)粒PECCG117-CJ1用限制性內(nèi)切酶XbaI和NotI處理， 然后進行0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳以洗脫大約6. 2Kb的條帶。制備的pECCGl 17-CJ1和實施例1-3中制備的IrnB1B2終止子使用Quick ligation試劑盒連接以獲得重組質(zhì)粒 pECCG117-CJl-rrnB32 (大約 6. 6Kb)，在本發(fā)明中命名為“pHC131T”。
制備的pHC131T質(zhì)粒用EcoRV和)(baI處理，然后進行1 %瓊脂糖凝膠電泳以從膠上洗脫大約6. 6Kb的條帶。
實施例2-2.質(zhì)粒pHC131T_arri)2的構(gòu)建
實施例1-1中制備的argD2基因的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶smal和)(baI處理，然后進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳以從膠上洗脫大約1.3Kb的條帶。得到的產(chǎn)物使用 Quickligation試劑盒與實施例2-1中制備的pHC131T連接，從而構(gòu)建大約7. 4Kb的重組質(zhì)粒(圖1)，在本發(fā)明中命名為“pHC131T-argD2”。
實施例3. argD2基因的序列分析
為了分析實施例2-2中制備的pHC131T-argD2的堿基序列，使用
70. lugpHC131T-argD2 的 DNA 作為模板禾ロ 2mM SEQ ID NOs. 3 禾ロ 6 的弓| 物對禾ロ 1 μ 1 BigDyeTMTerminator Cycle Sequencing v2. O Ready Reaction (ΡΕ Biosystems)進行PCR0 PCR條件包括25個循環(huán)的95°C變性30秒、55°C退火30秒和72°C延伸2分鐘，隨后4°C猝滅以終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，然后從膠上洗脫21Λ的DNA片段。
此DNA 片段使用引物 SEQ ID NO. 3 在 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (AppliedBiosystems)上進行序列分析。本發(fā)明的argD2基因編碼的氨基酸序列和其堿基序列分別顯示于SEQ ID NOs. 1和2。
實施例4.轉(zhuǎn)化體的制備
實施例2-2中制備的重組質(zhì)粒pHC131T-argD2通過電穿孔法引入至L-精氨酸生產(chǎn)菌株ATCC21493和ATCC21831中以制備過表達argD2基因的轉(zhuǎn)化體，分別命名為 CA06-0012 和 CA06-0013。轉(zhuǎn)化的微生物 CA06-0012 和 CA06-0013 于 2006 年 12 月 13 日保存于韓國菌種保藏中心(在下文中縮寫為“KCCM”)編號分別為KCCM10820P和KCCM10821P。
菌株和轉(zhuǎn)化體涂至含有25mg/L卡那霉素的固體培養(yǎng)基(組分3. Og/L牛肉膏、5. 0 g/L蛋白胨，在下文中相同)上，30°C培養(yǎng)16小吋。選擇的菌落如以下實施例5進行搖瓶滴度試驗(flask titer test)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的argD2過表達的轉(zhuǎn)化體以高產(chǎn)率生產(chǎn) L-精氨酸。
^MM 5.ヰ農(nóng)帛ぽ·
實施例4中制備的轉(zhuǎn)化細胞和親緣菌株ATCC21831和ATCC21493涂于含有25mg/ L卡那霉素的固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)16小時以從每個菌株中選擇10個單菌落。選擇的菌落在表1中給出的L-精氨酸接種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后使用表1中給出的濃度培養(yǎng)基來評價錐形瓶中的L-精氨酸產(chǎn)率。計算和比較L-精氨酸產(chǎn)率的平均值。
表1
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)L-精氨酸的方法，所述方法包括培養(yǎng)用重組載體轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒狀桿菌的步驟，其中所述重組載體含有編碼SEQ ID NO. 1表示的argD2多肽的多核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的生產(chǎn)L-精氨酸的方法，其中所述的多核苷酸由SEQID NO. 2^t/jN ο
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的生產(chǎn)L-精氨酸的方法，其中所述的谷氨酸棒狀桿菌的保藏編號為 KCCM10820P 或 KCCM10821P。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)L-精氨酸的突變菌株及其制備方法。特別是，本發(fā)明涉及包含谷氨酸棒狀桿菌的精氨酸生物合成中涉及的乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的推定基因argD2基因(Ncg12355)的多核苷酸、該多核苷酸編碼的多肽、包含該多核苷酸的重組載體、通過引入該重組載體至產(chǎn)L-精氨酸的宿主微生物以過表達argD2基因來制備的能夠以高產(chǎn)率生產(chǎn)L-精氨酸的轉(zhuǎn)化體和通過培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)L-精氨酸的方法。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體過表達argD2基因以高產(chǎn)率生產(chǎn)L-精氨酸，從而應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)。
文檔編號C12N15/74GKCN101688212 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200880002490
公開日2012年7月4日 申請日期2008年1月11日
發(fā)明者崔惠真, 李智惠, 金蕙圓, 黃水淵 申請人:Cj第一制糖株式會社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (4),