亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

一種利用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)l-精氨酸的方法

文檔序號:595047閱讀:921來源:國知局

專利名稱::一種利用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)l-精氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及產(chǎn)L-精氨酸微生物和利用該微生物生產(chǎn)L-精氨酸的方法。特別是,本發(fā)明涉及棒桿菌屬的突變菌抹,即產(chǎn)L-精氨酸谷氨酸棒桿菌CJR0500(CorynebacteriumglutamicumCJR0500),以及利用該突變菌抹生產(chǎn)L-精氨酸的方法。其中該突變菌林具有ct-氨基丁酸抗性,且色氨酸可以刺激該菌生長。
背景技術(shù)
:L-精氨酸是一種半必需氨基酸,在體內(nèi)可以自然產(chǎn)生。L-精氨酸被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、動物祠料和其它產(chǎn)品中。L-精氨酸可用于改善肝臟功能和腦功能,以及治療男性不育的藥物,也可以作為復(fù)合氨基酸添加物的組份。同時,L-精氨酸作為食品添加劑已被用于魚餅和保健飲料。近來,L-精氨酸被用于作為高血壓患者的鹽類替代品。通過生物發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的傳統(tǒng)方法基于直接利用碳源和氮源生產(chǎn)L-精氨酸。例如,可以利用屬于短桿菌屬(Brevibacterium)或棒桿菌屬(Corynebacterium)的產(chǎn)谷氨酸微生物的突變菌抹來生產(chǎn)L-精氨酸(JapanesePat.Laid-OpenPublicationNos.Sho57-163487,Sho60-83593和Sho62-265988),或者通過細(xì)胞融合提高產(chǎn)氨基酸微生物的生長特性來生產(chǎn)L-精氨酸(JapanesePat.Laid-OpenPublicationNo.Sho59-158185)。還可以使用轉(zhuǎn)染了重組基因的菌抹生產(chǎn)L-精氨酸(JapanesePat.Laid-OpenPublicationNo.Sho63-79597和U.S.Pat.No.4,775,623)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人為得到一林比傳統(tǒng)菌株高產(chǎn)L-精氨酸的菌林,對產(chǎn)谷氨酸菌抹進行了廣泛深入的研究,期望通過加強谷氨酸生物合成途徑來提高精氨酸的產(chǎn)量。這種期望是基于代謝途徑的性質(zhì),通過該途徑需要一分子谷氨酸和一分子谷氨酰氨生物合成精氨酸,并且具有a-氨基丁酸抗性和異亮氨酸類似物抗性的菌抹可以提高谷氨酸產(chǎn)量(KoreanPat-Laid-OpenPublicationNo.2002-0038204)。因此,本發(fā)明人從父本菌抹谷氨酸棒桿菌KFCC-10680出發(fā),誘導(dǎo)產(chǎn)生對a-氨基丁酸、刀豆氨酸和精氨酸氧肟酸鹽具有抗性的突變菌林。谷氨酸棒桿菌KFCC-10680可以產(chǎn)生谷氨酸且具有磺胺類藥物耐性和0-diazoleacetyl-L—serine抗性(KoreanPat.PublicationNo.91—7818)。結(jié)果發(fā)J見突變菌抹比父本菌株具有更高的L-精氨酸產(chǎn)量,而父本菌林對cc-氨基丁酸沒有抗性,從而產(chǎn)生了本發(fā)明。技術(shù)方案因此本發(fā)明的一個目的是提供谷氨酸棒桿菌的突變菌抹CJR0500,該菌林可以產(chǎn)L-精氨酸,且具有a-氨基丁酸抗性、刀豆氨酸抗性和精氨酸氧肟酸鹽抗性。本發(fā)明的另一個目的是提供一個生產(chǎn)L-精氨酸的方法,包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中活化該突變菌抹,然后振蕩培養(yǎng)該突變菌林。本發(fā)明還有一個目的是提供突變菌林CJR0500,該菌抹在L-色氨酸存在下可以縮短精氨酸發(fā)酵的時間。優(yōu)選實施方案一方面,本發(fā)明涉及谷氨酸棒桿菌突變菌抹CJR0500,該菌抹可以產(chǎn)L-精氨酸,且具有cc-氨基丁酸抗性、刀豆氨酸抗性和精氨酸氧肟酸鹽抗性。該突變菌抹通過如下方式誘導(dǎo)具有磺胺類藥物耐性和O-diazoleacetyl-L-serine抗性的父本菌抹谷氨酸棒桿菌KFCC-10680,用誘變常用方法N-甲基-N-硝基-N亞硝基胍(NTG)進行處理,然后涂布于添加了a-氨基丁酸、刀豆氨酸和精氨酸氧肟酸鹽的低限培養(yǎng)基上(見注意事項l)。然后,篩選能夠分別在500mg/L,500mg/L,10mg/L對以上三種物質(zhì)均具有抗性的突變菌林。下文將更詳細(xì)敘述突變菌株的誘導(dǎo)。父本菌抹在活化培養(yǎng)基(見注意事項2)中進行活化培養(yǎng)16小時?;罨木衷诜N子培養(yǎng)基(見注意事項3)中培養(yǎng)"小時,種子培養(yǎng)基121。C滅菌5分鐘。取5mL種子培養(yǎng)液用lOOmM檸檬酸緩沖液進行洗滌,然后用200mg/L的NTG處理20分鐘,再用lOOmM磷酸緩沖液洗滌。NTG處理過的菌抹涂布于低限培養(yǎng)基(見注意事項1)上,由此評估其生存能力。發(fā)現(xiàn)該菌林具有85%死亡率。為了獲得對a-氨基丁酸、刀豆氨酸和精氨酸氧肟酸鹽都具有抗性的突變菌株,將NTG處理的菌抹涂布于添加了刀豆氨酸、精氨酸氧肟酸鹽和a-氨基丁酸濃度分別為500mg/L,500mg/L和10mg/L的低限培養(yǎng)基上,30'C培養(yǎng)5天。出現(xiàn)的菌落接種于含有產(chǎn)精氨酸的培養(yǎng)基(見注意事項4)的錐形瓶中,培養(yǎng)72小時。篩選產(chǎn)精氨酸且對刀豆氨酸、精氨酸氧肟酸鹽和a-氨基丁酸都具有抗性的突變菌抹,并命名為谷氨酸棒桿菌CJR0500(Corynebacteri咖glutamicumCJR0500)。本案申請人將該突變菌株谷氨酸棒桿菌CJR0500(CorynebacteriumglutamicumCJR0500)于20006年3月15日保存于韓國微生物培養(yǎng)中心(KCCM),使其可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員得到,保藏編號為KCCM-10741P。另一方面,本發(fā)明涉及生產(chǎn)精氨酸的方法,包括通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中30°C16小時活化培養(yǎng)該突變菌抹,然后振蕩培養(yǎng)被活化的菌林72個小時。采用此方法,L-精氨酸的產(chǎn)量可以進一步提高(實施例1)。另一方面,本發(fā)明涉及突變菌林CJR0500,該菌抹在L-色氨酸存在下,具有更短的發(fā)酵時間。發(fā)酵培養(yǎng)基中L-色氨酸的添加可以進一步縮短精氨酸的發(fā)酵時間。因此與不添加L-色氨酸的培養(yǎng)基相比在相同的發(fā)酵時間內(nèi)具有更高水平的L-精氨酸產(chǎn)量(實施例3)。本發(fā)明的微生物具有如下的性質(zhì)注意事項1.低限培養(yǎng)基1.0%葡萄糖,0.4%硫酸銨,0.04%硫酸鎂,0.1%磷酸二氫鉀,0.1%尿素,0.0001%硫胺素,200pg/L生物素,2%瓊脂,pH7.0。注意事項2.活化培養(yǎng)基1%肉提取物,1%多聚蛋白胨,0.5%NaCl,0.5%酵母提取物,2%瓊脂,pH7.2。注意事項3.種子培養(yǎng)基50/。葡萄糖,1%細(xì)菌蛋白胨,0.25%NaCl,1%酵母提取物,3yg/L生物素,0.4%尿素,pH7.0。注意事項4.L-精氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基4.0%葡萄糖,3%硫酸銨,0.3%尿素,0.1%磷酸二氫鐘,0.1%磷酸氬二鉀,0.025%七水硫酸鎂,2.0%CSL(玉米浸提液),200ug/L生物素,pH7.2。通過NTG誘變,突變菌林谷氨酸棒桿菌CJR0500的精氨酸產(chǎn)量被提高,且能夠抗刀豆氨酸、精氨酸氧肟酸鹽和a-氨基丁酸,該突變菌抹的抗刀豆氨酸、精氨酸氧肟酸鹽和cc-氨基丁酸性質(zhì)如表1所示。表1.刀豆氨酸、精氨酸氧肟酸鹽和a-氨基丁酸抗性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>在低限培養(yǎng)基上L-色氨酸濃度與突變菌林生長率的關(guān)系如下表2所示。如表2所示,突變菌株谷氨酸棒桿菌CJR0500的生長需要L-色氨酸。表2.生長率與色氨酸濃度的關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例通過下列實施例可以更好的理解本發(fā)明。這些例子用于說明本發(fā)明,但不能理解為限制本發(fā)明。實施例1所用菌抹KFCC-10680和CJR0500發(fā)酵培養(yǎng)基(與注意事項4中的培養(yǎng)基成份相同)4.0%葡萄糖,3%硫酉臾銨,0.3%尿素,0.1%磷酸二氫鉀,Q.1%磷酸氫二鉀,0.025%七水硫酸鎂,2.0。/。CSL(玉米浸提液),20Qpg/L生物素,pH7.2。發(fā)酵與結(jié)果24mL發(fā)酵培養(yǎng)基分裝于250mL錐形搖瓶中,121。C滅菌15分鐘。每個菌抹都在種子培養(yǎng)基(注意事項3)中3(TC培養(yǎng)16小時。lmL活化的菌林接種于滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30。C振蕩培養(yǎng)72小時。檢測發(fā)酵液中精氨酸產(chǎn)量,結(jié)果如下表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2所用菌抹KFCC-10680和CJR0500發(fā)酵培養(yǎng)基10.0%葡萄糖,4。/。硫gfe銨,0.3%尿素,0.1%磷酸二氫鉀,0.1%磷酸氬二鉀,0.025%七水硫酸鎂,2.0%CSL(玉米浸提液),200ng/L生物素,pH7.2。發(fā)酵與結(jié)果24mL發(fā)酵培養(yǎng)基分裝于250mL錐形搖瓶中,121。C滅菌15分鐘。每個菌林都在種子培養(yǎng)基(注意事項3)中30'C培養(yǎng)16小時?;罨木?lmL)接種于滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中,3(TC振蕩培養(yǎng)72小時。檢測發(fā)酵液中精氨酸產(chǎn)量,結(jié)果如下表4所示。具有cc-氨基丁酸抗性的突變菌抹比其沒有抗性的父本菌林具有更高的精氨酸產(chǎn)量。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>發(fā)酵培養(yǎng)基10.0%葡萄糖,4%硫酸銨,0.3%尿素,0.1%磷酸二氬鉀,0.1%磷酸氫二鉀,0.025%七水硫酸鎂,2.0%CSL(玉米浸提液),200iug/L生物素,50mg/L色氨酸,pH7.2。發(fā)酵與結(jié)果MmL發(fā)酵培養(yǎng)基分裝于25(kL錐形搖瓶中,121。C滅菌15分鐘。每個菌林都在種子培養(yǎng)基(注意事項3)中3(TC培養(yǎng)16小時?;罨木?lmL)接種于滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30。C振蕩培養(yǎng)64小時。檢測發(fā)酵液中精氨酸產(chǎn)量,結(jié)果如下表5所示。色氨酸的加入能夠刺激突變菌抹CJR0500的生長,從而使L-精氨酸的產(chǎn)量在短時間內(nèi)達(dá)到較高水平。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>如上所述,突變菌抹谷氨酸棒桿菌CJR0500具有更高的L-精氨酸產(chǎn)量,且具有oc-氨基丁酸抗性。而且,由于添加色氨酸可以縮短精氨酸的發(fā)酵時間,因此在相同的發(fā)酵時間內(nèi),可以使精氨酸產(chǎn)量達(dá)到較高的水平,該突變菌抹十分有用。工業(yè)應(yīng)用如上所述,突變菌林谷氨酸棒桿菌CJR0500具有更高的L-精氨酸產(chǎn)量,且具有a-氨基丁酸抗性。而且,由于添加色氨酸可以縮短精氨酸的發(fā)酵時間,因此在相同的發(fā)酵時間內(nèi),可以使精氨酸產(chǎn)量達(dá)到較高的水平,該突變菌抹十分有用。關(guān)于國際承認(rèn)的用于專利目的的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約國際表格致CJ抹式會社由下頁簽章的國際保存管理機構(gòu)根韓國,首爾,中區(qū),據(jù)條約7.1的規(guī)定頒發(fā)的保藏證明南大門路5街500號I.微生物鑒定交存人給與的鑒定符號國際保藏單位給與的保藏號谷氨酸棒桿菌CJR0500KCCM-10741PII.科學(xué)說明和/或所建議的分類學(xué)命名上述I所鑒定的微生物附有<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>in.接收和受理該國際保藏單位于2006年3月15日(原始保藏日期)M妄受并受理上述I中所命名的微生物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1.根據(jù)第6.4條的要求,該日期是該國際保藏機構(gòu)得到的狀態(tài)的日期;當(dāng)保藏是在布達(dá)佩斯條約之外所作的,在國際保藏機構(gòu)獲得該狀態(tài)后,被轉(zhuǎn)成布達(dá)佩斯條約的保藏,該日期是國際保藏機構(gòu)收到該微生物日期。權(quán)利要求1.谷氨酸棒桿菌突變株CJR0500(保藏編號KCCM-10741P),其中該突變菌株產(chǎn)生L-精氨酸,且對α-氨基丁酸、刀豆氨酸和精氨酸氧肟酸鹽具有抗性。2.—種生產(chǎn)L-精氨酸的方法,其中包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中30°C16小時活化權(quán)利要求1所述的谷氨酸棒桿菌突變抹CJR0500(保藏編號KCCM-10741P),然后振蕩培養(yǎng)該突變菌林72小時。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酸棒桿菌突變抹CJR0500(保藏編號KCCM-10741P),其中通過添加L-色氨酸進一步刺激所述突變林的生長。全文摘要本發(fā)明公開了一種產(chǎn)L-精氨酸微生物和利用該微生物生產(chǎn)L-精氨酸的方法。該微生物為棒桿菌屬的突變菌株,即谷氨酸棒桿菌CJR0500。該L-精氨酸生產(chǎn)方法包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃16小時活化該突變菌株谷氨酸棒桿菌CJR0500,然后搖瓶培養(yǎng)被活化的突變菌株72小時。文檔編號C12N1/20GK101517066SQ200780026188公開日2009年8月26日申請日期2007年7月12日優(yōu)先權(quán)日2006年7月13日發(fā)明者樸英薰,李智惠,金惠圓,黃水淵申請人:Cj第一制糖株式會社
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1