專利名稱：產(chǎn)生l－谷氨酸、l－脯氨酸或l－精氨酸的細(xì)菌和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工業(yè)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及通過發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的方法，和該方法中使用的細(xì)菌。L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有重要用途。
背景技術(shù)：
L-精氨酸和L-脯氨酸通過大腸桿菌由共同前體L-谷氨酸合成。因此，L-精氨酸或L-脯氨酸的生產(chǎn)水平取決于其共同前體L-谷氨酸的利用度。
已知有L-谷氨酸合成水平增加的大腸桿菌菌株。具體而言，由大腸桿菌K12菌株衍生的2-酮戊二酸脫氫酶活性缺乏或降低菌株可以較高的產(chǎn)率生產(chǎn)L-谷氨酸(美國專利5,393,671和5,908,768)。
也已知某些大腸桿菌突變體可以產(chǎn)生L-精氨酸和L-脯氨酸。它們是作為對這些氨基酸有抗性的突變體通過克隆一些對它們的生物合成重要的基因獲得的(英國專利2080825A)。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供具有產(chǎn)生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸能力的新細(xì)菌和使用具有產(chǎn)生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸能力的細(xì)菌生產(chǎn)L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的方法。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)ilvA基因缺陷的大腸桿菌L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型產(chǎn)生L-谷氨酸。此外，ilvA基因缺陷的菌株可以用作培育L-脯氨酸和L-精氨酸的親本菌株。換而言之，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型可用來改進(jìn)L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的生產(chǎn)者。至此，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供(1)具有產(chǎn)生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸能力的L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型埃希氏菌屬細(xì)菌。
(2)根據(jù)(1)的埃希氏菌屬細(xì)菌，其任一種L-異亮氨酸生物合成酶活性缺陷。
(3)根據(jù)(2)的埃希氏菌屬細(xì)菌，其蘇氨酸脫氨酶活性缺陷。
(4)根據(jù)(1)到(3)任一項(xiàng)的埃希氏菌屬細(xì)菌，其為大腸桿菌。
(5)生產(chǎn)L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的方法，包括在含有L-異亮氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(1)到(4)中任一項(xiàng)限定的埃希氏菌屬細(xì)菌，以在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和積累L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸，并由培養(yǎng)物中收集L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸。
發(fā)明詳述(1)本發(fā)明的細(xì)菌本發(fā)明的細(xì)菌是屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌，它為L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型并具有產(chǎn)生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的能力。埃希氏菌屬細(xì)菌的一個(gè)實(shí)例是大腸桿菌。
“具有產(chǎn)生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸能力的細(xì)菌”是指該細(xì)菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)基中積累相當(dāng)量的L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸，或增加細(xì)菌中的L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸含量。“L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌”是指該細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長需要L-異亮氨酸(通常不低于10mg/l)。
本發(fā)明的細(xì)菌至少產(chǎn)生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸，也可能產(chǎn)生兩種或更多的L-氨基酸。
本發(fā)明的細(xì)菌可以通過向具有產(chǎn)生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸能力的埃希氏菌屬細(xì)菌賦予L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型或者向L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型埃希氏菌屬細(xì)菌賦予產(chǎn)生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的能力而獲得。
為了賦予L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型，可以使用包括以下步驟的方法誘變埃希氏菌屬細(xì)菌，讓埃希氏菌屬細(xì)菌在含有L-異亮氨酸的瓊脂培養(yǎng)基上形成菌落，影印該菌落至不含L-異亮氨酸的瓊脂培養(yǎng)基中，選擇在不含L-異亮氨酸的瓊脂培養(yǎng)基上不能生長的菌株。誘變包括UV輻射和使用常用于誘變處理的誘變劑如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸處理?；蛘?，可以選擇天然存在的突變體。
異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型優(yōu)選是由于任何L-異亮氨酸生物合成酶活性(催化L-異亮氨酸生物合成的酶活性)的缺陷引起。L-異亮氨酸生物合成酶包括蘇氨酸脫氨酶、乙酰羥酸合酶、乙酰羥酸同分異構(gòu)還原酶、二羥酸脫水酶。優(yōu)選蘇氨酸脫氨酶活性缺陷?！盎钚匀毕荨币话闶侵该傅募?xì)胞內(nèi)活性低于野生型菌株的酶活性，當(dāng)通過使用基因重組技術(shù)等修飾使得酶活性缺陷的菌株時(shí)，該酶的細(xì)胞內(nèi)活性低于修飾前該菌株的酶活性。
為了獲得上述酶活性缺陷，引起酶活性缺陷的突變可以通過常規(guī)誘變技術(shù)或基因過程技術(shù)導(dǎo)入至編碼該酶的基因。
誘變技術(shù)的實(shí)例包括例如使用X射線或紫外光輻射的方法、使用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍等誘變劑處理的方法。引入突變的基因位點(diǎn)可以是編碼酶蛋白的編碼區(qū)或啟動(dòng)子等表達(dá)調(diào)節(jié)序列。
基因工程技術(shù)的實(shí)例包括例如基因重組、遺傳傳導(dǎo)，細(xì)胞融合等。例如，將藥物抗性基因插入靶基因以產(chǎn)生功能滅活基因(缺陷基因)。然后，將該缺陷基因?qū)雽儆诎ＯＪ暇鷮俚奈⑸锛?xì)胞，通過同源重組染色體上的靶基因被缺陷基因取代(基因破壞)。
微生物的靶酶活性是否降低或缺陷以及活性降低的程度可以通過以下方法確定測定細(xì)菌細(xì)胞提取物或候選菌株的純化組分的酶活性，并將其與野生型或親本菌株比較。取決于靶酶，可以根據(jù)變體的表型選擇靶變體。
為了賦予產(chǎn)生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的能力，可以使用常用來培育埃希氏菌屬細(xì)菌的方法等，如獲得營養(yǎng)缺陷型突變菌株、抗L-氨基酸類似物的菌株或代謝控制突變菌株的方法和產(chǎn)生L-氨基酸生物合成酶活性增加的重組菌株的方法(見“氨基酸發(fā)酵”日本科學(xué)協(xié)會出版社[Gakkai Shuppan Certer]第1版，1986年5月30日出版，77-100頁)。在培育氨基酸生產(chǎn)菌時(shí)，營養(yǎng)缺陷型、L-氨基酸類似物抗性和代謝控制突變等特征可以單獨(dú)賦予或兩個(gè)或多個(gè)組合賦予。L-氨基酸生物合成酶活性可以單獨(dú)或兩種或多種組合被提高。此外，營養(yǎng)缺陷型、L-氨基酸類似物抗性和代謝控制突變等特征的賦予可以與L-氨基酸生物合成酶活性的提高結(jié)合。
例如，L-氨基酸產(chǎn)生菌可以作為油酸營養(yǎng)缺陷型等突變體被培育。
而且，L-氨基酸生產(chǎn)能力可以通過例如導(dǎo)入編碼以下任一種酶的DNA而被賦予谷氨酸脫氫酶(日本待審專利申請(Kokai)61-268185/1986)、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、異檸檬酸脫氫酶(日本待審專利申請(Kokai)62-166890/1987和63-214189/1988)、順烏頭酸水合酶(日本待審專利申請(Kokai)62-294086/1987)、檸檬酸合酶(日本待審專利申請(Kokai)62-201585/1987和63-119688/1988)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(日本待審專利申請(Kokai)60-87788/1985和62-55089/1987)、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油變位酶、磷酸丙糖激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、果糖二磷酸醛縮酶、磷酸果糖激酶(日本待審專利申請(Kokai)63-102692/1988)、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、葡糖胺-氧戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶(WO99/07853)等。
此外，本發(fā)明的細(xì)菌可以被修飾成催化由L-谷氨酸生物合成途徑分支而產(chǎn)生非L-谷氨酸的化合物的反應(yīng)的酶活性缺陷。催化由L-谷氨酸生物合成途徑分支而產(chǎn)生非L-谷氨酸的化合物的反應(yīng)的酶包括α-酮戊二酸脫氫酶、異檸檬酸裂合酶、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酸激酶、乙酰羥酸合酶、乙酰乙酸合酶、甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶，谷氨酸脫羧酶、1-吡咯啉脫氫酶等。
L-脯氨酸生產(chǎn)能力可以通過例如使細(xì)菌具有L-脯氨酸反饋抑制脫敏的γ-谷氨酰激酶和/或破壞L-脯氨酸降解系統(tǒng)而賦予。制備具有L-脯氨酸反饋抑制脫敏的γ-谷氨酰激酶的細(xì)菌的方法例如包括通過導(dǎo)入編碼L-脯氨酸反饋抑制脫敏的γ-谷氨酰激酶的DNA至細(xì)胞的方法(細(xì)菌學(xué)雜志170，5943(1988))。破壞L-脯氨酸降解系統(tǒng)的方法的實(shí)例如包括向脯氨酸脫氫酶基因?qū)胪蛔兪沟脽o活性脯氨酸脫氫酶被表達(dá)的方法。L-脯氨酸降解系統(tǒng)被破壞的細(xì)菌也可以通過以下方法獲得獲得L-脯氨酸同化能力缺陷的菌株，使用L-脯氨酸營養(yǎng)缺陷型作為指標(biāo)由獲得的菌株中選擇細(xì)胞外產(chǎn)生L-脯氨酸的菌株。
L-精氨酸生產(chǎn)能力可以通過以下方法賦予例如賦予α-甲基甲硫氨酸、對氟苯丙氨酸、D-精氨酸、精氨酸異羥肟酸、S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸、α-甲基絲氨酸、β-2-噻吩丙氨酸或磺胺胍的抗性(日本待審專利申請56-106598)，或?qū)刖幋aN-乙酰谷氨酸合酶的argA基因(日本待審專利申請57-5692)。
(2)本發(fā)明的方法本發(fā)明的方法包括在含有L-異亮氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，以在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和積累L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸，并由培養(yǎng)物中收集L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸。
培養(yǎng)基可以是含有碳源、氮源、無機(jī)離子和其它任選存在的有機(jī)成分的普通培養(yǎng)基，只要其含有L-異亮氨酸即可。L-異亮氨酸的量足以使本發(fā)明的細(xì)菌產(chǎn)生和積累L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸，通常是25到250mg/l。
碳源可以使用糖如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解物；醇如甘油和山梨糖醇，或有機(jī)酸如富馬酸、檸檬酸和琥珀酸。
氮源可以使用無機(jī)銨鹽如硫酸銨、氯化銨和磷酸銨；有機(jī)氮如大豆水解物；氨氣或氨水。
優(yōu)選含有作為痕量有機(jī)營養(yǎng)的所需物質(zhì)如維生素B1或酵母提取物。除此以外，需要時(shí)可以少量加入磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。
培養(yǎng)優(yōu)選在好氣條件下進(jìn)行16到72小時(shí)。培養(yǎng)溫度控制在25到45℃，pH控制在5到8。無機(jī)或有機(jī)、酸性或堿性物質(zhì)以及氨氣等可以用于調(diào)節(jié)pH。
培養(yǎng)物包括培養(yǎng)基和細(xì)胞，優(yōu)選是培養(yǎng)基。
由培養(yǎng)物中收集L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸通常通過組合離子交換樹脂法、沉淀法和其它已知方法來進(jìn)行。
實(shí)施例以下參照下列實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明。
實(shí)施例1通過ilvA缺陷菌株生產(chǎn)L-谷氨酸A)利用轉(zhuǎn)座子Tn5插入至ilvA基因大腸桿菌K12野生型(VKPM B-7)細(xì)胞用噬菌體P1處理，P1在具有轉(zhuǎn)座子Tn5插入至ilvA基因的L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株大腸桿菌C600ilvA::Tn5細(xì)胞中生長，將K12細(xì)胞置于含有卡那霉素(20μg/ml)的LB瓊脂平板上，以選擇卡那霉素抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)子。結(jié)果，獲得了轉(zhuǎn)座子Tn5插入至ilvA基因的野生型大腸桿菌K12的衍生株。該菌株命名為B7ILE，自2000年7月18日保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，并于2001年5月18日根據(jù)布達(dá)佩斯條約轉(zhuǎn)為國際保藏，保藏號為VKPMB8013。
B)由野生型大腸桿菌K12構(gòu)建具有ilvA基因突變的ilvA缺陷衍生株菌株VL334(VKPM B-1641)是具有thrC和ilvA基因的L-異亮氨酸和L-蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(美國專利4,278,765)。thrC的野生型等位基因使用在野生型大腸桿菌K12(VKPM B-7)細(xì)胞中生長的噬菌體P1通過常規(guī)轉(zhuǎn)導(dǎo)方法轉(zhuǎn)移。結(jié)果，獲得了L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株VL334thrC+。
C)通過L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株的試管發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基含有60g/l葡萄糖、25g/l硫酸銨、2g/l磷酸二氫鉀、1g/l硫酸鎂、0.1mg/l硫胺素、50mg/l L-異亮氨酸和25g/l白堊(pH7.2)。葡萄糖和白堊分別滅菌。將2毫升培養(yǎng)基置于試管中，接種一環(huán)測試微生物，37℃下振蕩培養(yǎng)2天。結(jié)果顯示在表1中。
表1

實(shí)施例2通過ilvA缺陷L-脯氨酸生產(chǎn)者生產(chǎn)L-脯氨酸野生型大腸桿菌K12(VKPM B-7)細(xì)胞用誘變劑N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(0.1mg/l)37℃處理分鐘，洗滌后在添加由1.25mg/ml胰胨、10mg/ml L-脯氨酸和0.05mg/ml 2，3，5-氯化三苯基四氮唑M9基本瓊脂培養(yǎng)基上鋪板。37℃溫育3天后出現(xiàn)的多數(shù)菌落是紅色的。少數(shù)菌落不能氧化L-脯氨酸，是白色的。將一個(gè)這種菌落用作親本，以獲得對加入至M9瓊脂培養(yǎng)基濃度均為2mg/ml的脯氨酸類似物(3，4-脫氫脯氨酸和鈴蘭氨酸)具有抗性的突變體。
出現(xiàn)的某些突變體可以生產(chǎn)L-脯氨酸。最佳L-脯氨酸生產(chǎn)者702用菌株TG1細(xì)胞中生長的P1噬菌體處理，菌株TG1中ilvA基因由于氯霉素抗性基因(Cmr)的插入被破壞。獲得的一個(gè)Cm抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)子702ilvA是L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型，其生產(chǎn)L-脯氨酸的效率較L-異亮氨酸原養(yǎng)型親本菌株702高得多(表2)。發(fā)酵如實(shí)施例1所述進(jìn)行。
表2

菌株702和702ilvA自2000年7月18日已保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，并于2001年5月18日轉(zhuǎn)為布達(dá)佩斯條約承認(rèn)的保藏，保藏號分別為VKPM B-8011和VKPM B-8012。
實(shí)施例3通過ilvA缺陷L-精氨酸生產(chǎn)者生產(chǎn)L-精氨酸L-精氨酸生產(chǎn)菌株237被選用作抗嘧啶類似物6-氮尿嘧啶，其中轉(zhuǎn)座子Tn5被插入到ilvA基因中，因此，它是L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型。菌株237已于2000年4月10日保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，并于2001年5月18日轉(zhuǎn)為布達(dá)佩斯條約承認(rèn)的保藏，保藏號為VKPM B-7925。
菌株237細(xì)胞用在野生型大腸桿菌K12菌株(VKPM B-7)細(xì)胞中生長的P1噬菌體處理，選擇L-異亮氨酸原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化體。所有L-異亮氨酸原養(yǎng)型轉(zhuǎn)導(dǎo)子的L-異亮氨酸生產(chǎn)均大幅度降低(表3)。發(fā)酵如實(shí)施例1所述進(jìn)行。
表3

權(quán)利要求
1.生產(chǎn)L-谷氨酸或L-精氨酸的方法，包括在含有L-異亮氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有產(chǎn)生L-谷氨酸或L-精氨酸能力的L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型埃希氏菌屬細(xì)菌，以在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和積累L-谷氨酸或L-精氨酸，并由培養(yǎng)物中收集L-谷氨酸或L-精氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的埃希氏菌屬細(xì)菌中任一種L-異亮氨酸生物合成酶活性缺陷。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的埃希氏菌屬細(xì)菌中蘇氨酸脫氨酶活性缺陷。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的埃希氏菌屬細(xì)菌為大腸桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的埃希氏菌屬細(xì)菌為菌株702ilvA，保藏號為VKPM B-8012。
全文摘要
L－谷氨酸、L－脯氨酸或L－精氨酸通過以下方法生產(chǎn)在含有L－異亮氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有產(chǎn)生L－谷氨酸、L－脯氨酸或L－精氨酸能力的L－異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型埃希氏菌屬細(xì)菌，以在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和積累L－谷氨酸、L－脯氨酸或L－精氨酸，并由培養(yǎng)物中收集L－谷氨酸、L－脯氨酸或L－精氨酸。
文檔編號C12P13/10GK1944660SQ20061008188
公開日2007年4月11日 申請日期2001年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月26日
發(fā)明者M·G·倫特斯, S·A·福米納, T·V·勒奧諾瓦, M·M·古斯雅蒂納 申請人:味之素株式會社