專利名稱：一種l-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌，同時 涉及L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌的制備方法，還涉及L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌在 動物飼料中的用途。
背景技術(shù)：
L-精氨酸是精氨酸生物合成途徑的最終產(chǎn)物，是人和動物的半必需堿性氨基酸， 是幼小動物的必需氨基酸。L-精氨酸具有廣泛用途，在醫(yī)藥工業(yè)上，L-精氨酸是生物體尿 素循環(huán)中的一種重要中間代謝物，也是復(fù)方氨基酸輸液的主要成分之一，還是配制營養(yǎng)或 特殊治療用品的重要原料，被廣泛用于氨中毒性肝昏迷的解毒劑和肝功能的促進劑，對病 毒性肝炎療效顯著，對腸道潰瘍、血栓形成、神經(jīng)衰弱和男性無精等癥狀都有一定的治療效 果，還可使尿素循環(huán)活化，降低血氨，使肝昏迷癥狀緩解。在飼料工業(yè)上，由于母乳中的精氨 酸量與哺乳仔豬自身的腸道內(nèi)源合成并不能夠滿足其最佳的生長需要，因此目前養(yǎng)豬業(yè)中 精氨基酸不足是限制哺乳仔豬獲得最佳生長的一個主要因素，哺乳仔豬生產(chǎn)對于整個養(yǎng)豬 生產(chǎn)來說十分重要，哺乳仔豬對精氨酸的需要尤為重要。然而，目前國際上發(fā)酵法生產(chǎn)精氨 酸產(chǎn)酸水平75g/L，而國內(nèi)主要依靠水解蛋白來生產(chǎn)，操作環(huán)境差、收率低、成本高，不適合 大規(guī)模生產(chǎn)，并且水解產(chǎn)品品質(zhì)較差，不符合醫(yī)藥用的標準，是我國藥用氨基酸生產(chǎn)的“瓶 頸”。國家每年在進口 L-精氨酸一個產(chǎn)品上的費用需要40到50億元人民幣。現(xiàn)在國內(nèi)發(fā) 酵法生產(chǎn)L-精氨酸的研究僅限于實驗室水平，與國際技術(shù)差距較大，因此選育L-精氨酸的 高產(chǎn)菌株并優(yōu)化其發(fā)酵工藝有著重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌，該菌種所產(chǎn) L-精氨酸達44g/L，產(chǎn)酸穩(wěn)定，遺傳穩(wěn)定性好，傳代八代以后產(chǎn)酸量依然保持較高水平。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌的制備方 法，該方法把傳統(tǒng)的物理誘變和化學(xué)誘變法相結(jié)合，提高了誘變率。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌所生產(chǎn)的 L-精氨酸在斷奶仔豬飼料中應(yīng)用，L-精氨酸可以提高斷奶仔豬肌肉中有利于蛋白質(zhì)翻譯 的起始因子活性，從而促進斷奶仔豬肌肉蛋白質(zhì)合成，達到促進斷奶仔豬生長的營養(yǎng)效果。為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施所需材料為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) DSM1412 (購自德國生物材料資 源中心，艮Pthe German Resource Centre for Biological Material) ；1-甲基-3_ 硝 基-1-亞硝基胍(NTG)(購自Fluka公司產(chǎn)品)；N-硝基-L-精氨酸甲酯(AE)(購自Sigma 公司產(chǎn)品)；葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、NaCl、瓊脂、玉米漿、硫酸胺((NH4)2SO4)、磷酸 二氫鉀(KH2PO4)、七水硫酸鎂(MgSO4 ·7Η20)、尿素、碳酸鈣、三水磷酸氫二鉀(K2HPO4 ·3Η20)、七水硫酸鐵(FeSO4 ·7Η20)、一水硫酸錳(MnSO4 -H2O)、生物素、硫胺素鹽酸鹽、二乙胺、α -萘 酚、無水乙醇、脲、純溴、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉 NaH2PO4, L-Arg和正丙醇購自上海生物工程有限公司。用紫外線和1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍誘變Corynebacterium glutamicumDSM1412 akhurstii,獲得一種L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌，命名為 Corynebacterium glutamicum ZD2tltl9，谷氨酸棒桿菌已保藏，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保 藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編430072，保藏日期2009年11月11日，保藏編 號CCTCC NO :M209260，分類命名=Corynebacteriumglutamicum ZD2009。一種L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌的制備方法，其步驟是(1)紫外線誘變(錢和，郝剛.精氨酸產(chǎn)生菌誘變育種的研究.微生物學(xué)通 報.2005,32(3) 46-49)取谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)12h種子液5ml，用高速離心機5000rpm離 心5min，棄去上清液，用無菌生理鹽水洗滌，菌種用玻璃珠打散，得菌懸液，在20w紫外燈下 50cm處照射30 40S，將經(jīng)過誘變的菌液涂布在含濃度為4mg/mLAE的基本培養(yǎng)基平板上， 30°C培養(yǎng)7 8d，然后挑選長出的較大菌落為N-硝基-L-精氨酸甲酯(購自Sigma公司產(chǎn) 品)的變異菌株。篩選出的菌落再經(jīng)斜面培養(yǎng)、種子液培養(yǎng)、發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)，最后用坂口改 良法(Rosenberg H. ,Ennor AH. ,Morrison JF. The estimation of arginine. Journal of Chemistry, 1956,63(1) : 153-159)測定發(fā)酵液中的L-精氨酸含量，判定菌株的產(chǎn)酸水平。(2)1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍誘變(錢和，郝剛.精氨酸產(chǎn)生菌誘變育種的研 究.微生物學(xué)通報.2005，32 (3) 46-49):取谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)12h種子液5ml，用高速離 心機5000rpm離心5min，棄去上清液，用無菌生理鹽水洗滌，菌種用玻璃珠打散，生理鹽水 洗滌后，用0. lmol/L磷酸緩沖液(pH 6. 0)洗滌2次，加入0. lmol/L磷酸緩沖液(pH 6. 0) 至6. 5ml，然后加入濃度為0. 4mg/mLl-甲基_3_硝基-1-亞硝基胍，30°C誘變15min，用 0. lmol/L磷酸緩沖液(pH 6. 0)洗滌3次，除去1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍終止誘變。 將經(jīng)過誘變的菌液涂布在含濃度為4mg/mL N-硝基-L-精氨酸甲酯的基本培養(yǎng)基平板上， 30°C培養(yǎng)7 8d，然后挑菌落，篩選出的菌落再經(jīng)斜面培養(yǎng)、種子液培養(yǎng)、發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)，最 后用坂口改良法測定發(fā)酵液中的L-精氨酸含量，判定菌株的產(chǎn)酸水平。(3)搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化種子培養(yǎng)基(各成分質(zhì)量分數(shù)(％ ):葡萄糖3.0，玉米漿2.0，硫酸胺 ((NH4)2SO4) 2. 0，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0. 1，七水硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 0. 05，尿素 0. 15，pH 7.0-7.2)的優(yōu)化采用三因素三水平L9 (33)實驗設(shè)計(三因素三水平，共九個實驗組，記 為L9(33))因素1為葡萄糖，設(shè)2%，3%，4%三水平；因素2為玉米漿，設(shè)1%，2%，3% 三水平；因素3為硫酸銨((NH4)2SO4)，設(shè)1%，2%，3%三水平。其他因素(磷酸二氫鉀 (KH2PO4)0.1%,七水硫酸鎂(MgSO4 · 7H20)0. 05%,尿素 0. 15%, pH 7. 0-7. 2)不變。發(fā)酵培養(yǎng)基及接種量的優(yōu)化采用七因素三水平L18(37)實驗設(shè)計(七因素三水 平，共十八個實驗組，記為L18(37))因素1為葡萄糖，設(shè)9%，12%，15%三水平；因素2為 玉米漿，設(shè)2%，2. 5%，3%三水平；因素3為硫酸銨((NH4)2SO4),設(shè)3%，4. 5%，6%三水 平；因素4為磷酸二氫鉀(KH2PO4)，設(shè)0.05%，0. 1%,0. 15%三水平，因素5為七水硫酸鎂 (MgSO4 ·7H20)，設(shè) 0. 03 %，0. 05 %，0. 07 %三水平，因素 6 為碳酸鈣(CaCO3)，設(shè) 2 %，3 %，4% 三水平；因素7為接種量設(shè)6%，8%，10%三水平。
最佳pH值確定通過設(shè)置5個發(fā)酵培養(yǎng)基pH值梯度6.0，6. 5，7.0，7. 5，8.0，測定 不同PH對細菌產(chǎn)酸的影響。如圖3所示，發(fā)酵培養(yǎng)基pH值7. 0時，產(chǎn)精氨酸量最高。最佳裝液量確定通過設(shè)置4個梯度的發(fā)酵裝液量(IOOmL錐形瓶)5ml，10ml， 15ml，20ml，測定不同裝液量對細菌產(chǎn)酸的影響。如圖4所示，15%裝液量(15mL/100mL)產(chǎn)
酸量最高。最優(yōu)條件驗證采用優(yōu)化的種子培養(yǎng)基(各成分質(zhì)量分數(shù)(％)葡萄糖3.0，玉米 漿 2. 0，硫酸胺((NH4)2SO4) 2. 0,磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 1，七水硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 0. 05， 尿素0.15，pH 7.0)、優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基(各成分質(zhì)量分數(shù)(％)葡萄糖12，玉米漿2. 5， 硫酸胺((NH4)2SO4) 6. 0，磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 05，七水硫酸鎂(MgSO4 · 7H20)0. 05，碳酸鈣 (CaCO3) 2.0, pH 7.0)及優(yōu)化的接種量(10 % )，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基pH值(7.0)和最佳發(fā)酵裝 液量(15% )進行驗證試驗。如表7所示，平均產(chǎn)酸為44g/L。谷氨酸棒桿菌 Corynebacterium glutamicum ZD2009 相關(guān)特性形態(tài)學(xué)特性革蘭氏陽性菌，桿狀。培養(yǎng)特性培養(yǎng)基各成分質(zhì)量分數(shù)(％ )葡萄糖2. 0，牛肉膏1. 0，蛋白胨1. 0，酵 母膏 0.5，NaCl 0. 5，瓊脂 2. 0，ρΗ 7. 0，30°C培養(yǎng)。生理特性具有精氨酸類似物(N-硝基-L-精氨酸甲酯)抗性，傳代后產(chǎn)L-精氨 酸酸穩(wěn)定，在上述培養(yǎng)基和溫度條件下即可生長，對生長環(huán)境無其他特殊要求。功能特性L_精氨酸產(chǎn)生菌，發(fā)酵產(chǎn)L-精氨酸，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后產(chǎn)L-精氨酸達 44g/L。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果將物理和化學(xué)誘變相結(jié)合，通過交 叉誘變提高誘變效率，得到一株遺傳穩(wěn)定、L-精氨酸產(chǎn)量高的菌株，將此菌株通過發(fā)酵條件 的優(yōu)化，使其產(chǎn)酸量達44g/L，且產(chǎn)酸穩(wěn)定，遺傳穩(wěn)定性高。獲得誘變菌株的最佳發(fā)酵條件 為采用種子培養(yǎng)基各成分質(zhì)量分數(shù)％ 葡萄糖3. 0，玉米漿2. 0，硫酸胺((NH4)2SO4) 2. 0，磷 酸二氫鉀(KH2PO4)O. 1，七水硫酸鎂(MgSO4 ·7Η20)0· 05，尿素0. 15，pH 7. 0 ；發(fā)酵培養(yǎng)基各成 分質(zhì)量分數(shù)葡萄糖12，玉米漿2. 5，硫酸胺((NH4)2SO4) 6. 0，磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 05，七 水硫酸鎂(MgSO4 ·7Η20)0. 05，碳酸鈣(CaCO3) 2. 0，發(fā)酵培養(yǎng)基pH值7. 0和發(fā)酵裝液量15%， 30°C發(fā)酵培養(yǎng)96h。降低了生產(chǎn)成本，提高了效率。通過試驗得出，日糧中添加0.8% L-精 氨酸可以通過提高斷奶仔豬肌肉中有利于蛋白質(zhì)翻譯的起始因子活性，從而促進斷奶仔豬 肌肉蛋白質(zhì)合成，達到促進斷奶仔豬生長的營養(yǎng)效果。


圖1為一種L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum DSM1412生長曲線示意2為一種L-精氨酸標準曲線圖3為一種不同梯度pH對細菌產(chǎn)酸的影響圖4為一種不同裝液量對細菌產(chǎn)酸的影響圖5為一種發(fā)酵液中L-精氨酸的分離提取工藝流程6為一種斷奶仔豬日糧中添加L-精氨酸對4E-BP1 · eIF4E復(fù)合物濃度的影響 為
具體實施例方式1、材料1. 1 菌株谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum DSM1412)1. 2 培養(yǎng)基1. 2. 1瓊脂完全培養(yǎng)基各成分質(zhì)量分數(shù)(％ )葡萄糖2. 0，牛肉膏1. 0，蛋白胨 1.0，酵母膏 0.5，氯化鈉(NaCl)O. 5，瓊脂 2. 0，pH 7. 0-7. 2，115°C滅菌 20min。1. 2. 2搖瓶種子培養(yǎng)基各成分質(zhì)量分數(shù)(％ ):葡萄糖3. 0,玉米漿2. 0,硫酸胺 ((NH4)2SO4) 2. 0，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0. 1，七水硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 0. 05，尿素 0. 15，pH 7. 0，115°C滅菌 20min。1. 2. 3搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基各成分質(zhì)量分數(shù)(％ ):葡萄糖12. 0,玉米漿2. 5，硫酸 胺((NH4) 2S04) 4. 5，磷酸 二氫鉀(KH2PO4) 0. 1，七水硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 0. 05，碳酸鈣 (CaCO3) 3. 0, pH 7. 0，115°C滅菌 20min。1. 2. 4瓊脂基本培養(yǎng)基各成分質(zhì)量分數(shù)(％ ):葡萄糖1. 0，硫酸胺 ((NH4) 2S04)0. 3，磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 1，三水磷酸氫二鉀(K2HPO4 · 3H20) 0. 2，七水硫酸鎂 (MgSO4 · 7H20) 0. 05，七水硫酸鐵(FeSO4 · 7H20) 0. 002，一水硫酸猛(MnSO4 · H2O) 0. 002，生物 素 50 μ g/L，硫胺素鹽酸鹽 200 μ g/L，瓊脂 2. Ο,ρΗ 7.0,115°C滅菌 20min。1. 2. 5選擇性培養(yǎng)基在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上補加各種不同質(zhì)量分數(shù)的精氨酸結(jié) 構(gòu)類似物磺胺胍。1. 3溶液的配制生理鹽水0. 9g氯化鈉+IOOml蒸餾水，121滅菌20min。0. lmol/L 的磷酸緩沖液(pH6. 0) :1L 緩沖液為 123mL 0. lmol/L 的 Na2HP04+877mL 0. lmol/L 的 NaH2P04。1. 4精氨酸標準曲線的繪制精確稱取L-精氨酸標準品0.3333g，加少量蒸餾水溶解后定容至100ml，為 3. 3333 μ g/μ L的精氨酸標準母液。分別吸1、2、3、4、5、6、7、5、9、10μ 1定容至1ml， 所得溶液即為不同濃度的L-精氨酸標準溶液，分別為10、20、30、40、50、60、70、50、90、 100 μ g/3mL,用以繪制標準曲線。所標準曲線見附圖2。1. 5發(fā)酵液L-精氨酸含量的測定與計算將發(fā)酵液5000rpm離心，沉淀菌體等固形物。上清液用蒸餾水適度稀釋，使稀釋液 每3ml的L-精氨酸含量控制在可測線性范圍10 100 μ g內(nèi)，最好在測定誤差較小的20 90μ g之間。取稀釋液3ml，對照管為蒸餾水3ml，依次加入0. 5mll4% NaOHU. 5ml 4%標準 顯色液、1. Oml正丙醇，混合均勻后，40°C水浴lOmin，使顯色反應(yīng)進行完全。用自來水冷卻 后于室溫25min測OD53tl值。計算公式為X= AXn/(rX3X1000)X，發(fā)酵液L-精氨酸濃度(mg/ml) ；Α,吸光度(OD53tl) ；η,發(fā)酵液稀釋倍數(shù)；r，回歸 系數(shù)。2. 一種L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum ZD2tltl9的制 備方法，其步驟是
A、菌種種子生長曲線及最佳細胞懸液濃度的確定從完全平板培養(yǎng)基上接種菌種于裝有40ml種子液的500ml三角瓶中，在培養(yǎng)0、2、 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、2處時，取0. Iml種子培養(yǎng)液，加入IOmL的試管，用蒸餾水定 溶，搖勻，用ND-1000分光光度計，光程562nm測OD值。如圖1所示，培養(yǎng)4_14h為谷氨酸 棒桿菌對數(shù)生長期。取培養(yǎng)至對數(shù)后期培養(yǎng)12h的菌液10ml，離心棄去上清液，加入等體積的無菌生 理鹽水，充分震蕩，然后對菌懸液進行梯度稀釋，分別為10° 10_9，將不同稀釋度的菌懸液 涂布在瓊脂基本培養(yǎng)基平板(O. Iml/個皿)，每個稀釋度3個，30°C培養(yǎng)48 72h觀察菌落 生長情況。選擇菌液濃度為IO8 IO9個/mL培養(yǎng)菌液進行誘變。試驗結(jié)果表明，最佳菌懸 液濃度為10—。B、1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍誘變劑量確定用0. 1、0. 2、0.4、0.6、0.8mg/mL不同劑量的1-甲基_3_硝基-1-亞硝基胍處理 谷氨酸高產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌。取6支1.5ml離心管。分別取經(jīng)種子培養(yǎng)Ilh的種子培養(yǎng) 液0. 5mL至離心管中離心，棄去上清液，菌體用滅菌的磷酸緩沖液離心洗滌3次，然后各 試管依次加入滅菌的磷酸緩沖液1、0. 95,0. 9,0. 8,0. 7,0. 6mL,再依次加入1_甲基_3_硝 基-1-亞硝基胍溶液0、0. 05、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4mL，震蕩搖勻，30°C保溫10分鐘。無菌水離 心洗滌三次以終止誘變劑的作用。最后加入無菌水至0. 5mL，震蕩搖勻。每支離心管的菌懸 液都作梯度稀釋，到10_6，選擇10_5、10_6涂布基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板，0. 2mL/個皿，每個濃度3個。 30°C培養(yǎng)72h，觀察菌落，選擇致死率{致死率=(誘變前菌落數(shù)-誘變后菌落數(shù))/誘變前 菌落數(shù))X 100% }達到80%的1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍濃度為實驗誘變劑量。表1 所示，1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍誘變最佳劑量為0. 4mg/mL。表1不同誘變劑量1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍對谷氨酸棒桿菌的致死率 C、紫外誘變時間的確定取種子培養(yǎng)Ilh的菌液涂布于基礎(chǔ)培養(yǎng)基(各成分質(zhì)量分數(shù)(％ )葡萄糖1. 0，硫 酸胺((NH4) 2S04)0. 3，磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 1，三水磷酸氫二鉀(K2HPO4 · 3H20)0. 2，七水硫 酸鎂(MgSO4 ·7Η20)0. 05，七水硫酸鐵(FeSO4 ·7Η20)0. 002，一水硫酸錳(MnSO4 ·Η20)0. 002， 生物素50 μ g/L，硫胺素鹽酸鹽200 μ g/L，瓊脂2.0，pH 7.0)上(0. Iml/個皿)，編號為1、 2、3、4、5、6，分別在 20W 紫外燈下 30cm 處照射 0s、5s、10s、20s、30s、40s、50s，于 30°C 培養(yǎng) 2 3d，觀察菌落生長情況，選擇致死率為80%的時間為誘變時間。如表2所示，紫外誘變 最佳時間為30 40S。表2不同紫外誘變時間對對谷氨酸棒桿菌的致死率 D、谷氨酸棒桿菌對N-硝基-L-精氨酸甲酯的最低耐受濃度配制瓊脂基本培養(yǎng)基(各成分質(zhì)量分數(shù)(％ )葡萄糖1. 0，硫酸胺((NH4) 2S04)0. 3，磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 1，三水磷酸氫二鉀(K2HPO4 · 3H20) 0. 2，七水硫酸鎂 (MgSO4 · 7H20) 0. 05，七水硫酸鐵(FeSO4 · 7H20) 0. 002，一水硫酸猛(MnSO4 · H2O) 0. 002，生物 素 50 μ g/L，硫胺素鹽酸鹽 200 μ g/L，瓊脂 2.0, pH 7.0,115°C滅菌 20min) 500ml，分裝于 6 個IOOmL的小三角瓶中，每個三角瓶裝50mL，編號為1、2、3、4、5、6，在1、2、3、4、5、6中依次 加入0g、0. lg、0. 2g、0. 3g、0.4g N-硝基-L-精氨酸甲酯，混合均勻后倒板，制成含0. 2%, 0.4%,0.6%,0.8% N-硝基-L-精氨酸甲酯的梯度平板。將稀釋至合適濃度的菌懸液涂布 平板(0. Iml/個培養(yǎng)皿)，30°C培養(yǎng)72h后觀察菌落的生長，剛好沒長菌的AE濃度為結(jié)構(gòu)類 似物最低濃度。表3所示，谷氨酸棒桿菌對N-硝基-L-精氨酸甲酯的耐受力為0. 4%。表3谷氨酸棒桿菌對N-硝基-L-精氨酸甲酯的耐受力
AE(mg/mL)02468DSM1412+++-------E、紫外線和1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍誘變(1)紫外線誘變(錢和，郝剛.精氨酸產(chǎn)生菌誘變育種的研究.微生物學(xué)通 M . 2005,32(3) 46-49)取谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)DSM1412 培養(yǎng) 12h種子液5ml，用高速離心機5000rpm離心5min，棄去上清液，用無菌生理鹽水洗滌，菌種 用玻璃珠打散，獲得細胞懸液，在20w紫外燈下50cm處照射30 40S，將經(jīng)過誘變的菌液涂 布在含濃度為4mg/mLAE的基本培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)7 8d，然后挑選長出的較大菌落 為N-硝基-L-精氨酸甲酯(購自Sigma公司產(chǎn)品)的變異菌株。篩選出的菌落再經(jīng)斜面 培養(yǎng)、種子液培養(yǎng)、發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)，最后用坂口改良法(Rosenberg H，Ennor AH, Morrison JF. The estimation ofarginine. Journal of Chemistry, 1956,63 (1) : 153-159)測定發(fā)酵 液中的L-精氨酸含量，判定菌株的產(chǎn)酸水平。(2)1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍誘變(錢和，郝剛.精氨酸產(chǎn)生菌誘變育 種的研究.微生物學(xué)通報.2005, 32 (3) 46-49)取谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicumDSM1412培養(yǎng)12h種子液5ml，用高速離心機5000rpm離心5min，棄去上清液， 用無菌生理鹽水洗滌，菌種用玻璃珠打散，生理鹽水洗滌后，用0. lmol/L磷酸緩沖液(pH 6.0)洗滌2次，加入pH6.0的0. lmol/L磷酸緩沖液至6. 5ml，然后加入濃度為0. 4mg/ mLl-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍，30°C誘變15min，用0. lmol/L磷酸緩沖液(pH 6. 0)洗 滌3次，除去1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍終止誘變。將經(jīng)過誘變的菌液涂布在含濃度為 4mg/mL N-硝基-L-精氨酸甲酯的基本培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)7 8d，然后挑選長出的較 大菌落為AE的變異菌株。篩選出的菌落再經(jīng)斜面培養(yǎng)、種子液培養(yǎng)、發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)，最后用 坂口改良法測定發(fā)酵液中的L-精氨酸含量，判定菌株的產(chǎn)酸水平。以 Corynebacterium glutamicum DSM1412 為出發(fā)菌株，經(jīng)過 8 次紫外和 甲 基-3-硝基-1-亞硝基胍誘變，最后獲得L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum ZD20090其產(chǎn)酸量為31g/L。谷氨酸棒桿菌已保藏，保藏單位中國典型培養(yǎng)物 保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編430072，保藏日期2009年11月11日，保藏 編號CCTCC NO :M209260，分類命名=Corynebacterium glutamicum ZD2009。F、遺傳穩(wěn)定性試驗將L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum ZD2009連續(xù)接種
9八代，搖瓶發(fā)酵考察產(chǎn)酸穩(wěn)定性。如表4所示，遺傳穩(wěn)定性較好。表 4Corynebacterium glutamicum ZD2009 遺傳It、定t生 G、搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化1、種子培養(yǎng)基優(yōu)化及結(jié)果種子培養(yǎng)基各成分質(zhì)量分數(shù)(％ ):葡萄糖3. 0，玉米漿2. 0，硫酸胺 ((NH4)2SO4) 2. 0，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0. 1，七水硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 0. 05，尿素 0. 15，pH 7. 0。采用三因素三水平L9 (33)實驗設(shè)計(三因素三水平，共九個實驗組，記為L9 (33)) 因素A為葡萄糖，設(shè)2%，3%，4%三水平；因素B為玉米漿，設(shè)1%，2%，3%三水平；因素C 為硫酸胺((NH4)2SO4),設(shè)1%，2%，3%三水平。其他因素(磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 1%，七 水硫酸鎂(MgSO4 · 7H20)0. 05%，尿素0. 15%，pH 7. 0)保持不變。如表5所示，種子優(yōu)化 培養(yǎng)基各成分質(zhì)量分數(shù)(％ )葡萄糖4. 0，玉米漿2. 0，硫酸胺((NH4)2SO4) 3. 0，磷酸二氫鉀 (KH2PO4) 0. 1，七水硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 0. 05，尿素 0. 15，pH 7. 0。表5種子培養(yǎng)基優(yōu)化實驗結(jié)果 2、發(fā)酵培養(yǎng)基及接種量的優(yōu)化搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基各成分質(zhì)量分數(shù)(％):葡萄糖12.0，玉米漿2.5，硫酸 胺((NH4) 2S04) 4. 5，磷酸 二氫鉀(KH2PO4) 0. 1，七水硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 0. 05，碳酸鈣 (CaCO3) 3. 0，pH 7. 0。采用七因素三水平L18 (37)實驗設(shè)計(七因素三水平，共十八個實驗組，記為 L18 (37))因素A為葡萄糖，設(shè)9%，12%，15%三水平；因素B為玉米漿，設(shè)2%，2. 5 %，3% 三水平；因素C為硫酸胺((NH4)2SO4)，設(shè)3%，4.5%，6%三水平；因素D為磷酸二氫鉀 (KH2PO4)，設(shè) 0. 05%，0. 1 %，0. 15%三水平，因素 E 為七水硫酸鎂(MgSO4 · 7H20)，設(shè) 0. 03%， 0. 05%,0. 07%三水平，因素F為碳酸鈣(CaCO3)，設(shè)2%，3%，4%三水平；因素G為接種量設(shè) 6%，8%，10%三水平。如表6所示，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基各成分質(zhì)量分數(shù)(％):葡萄糖12，玉米漿 2. 5，硫酸胺((NH4)2SO4) 6. 0，磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 05，七水硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 0. 05， 碳酸鈣(CaCO3) 2. 0，ρΗ 7.0。優(yōu)化的接種量為10%。表6發(fā)酵培養(yǎng)基及接種量的優(yōu)化實驗結(jié)果
實驗號ABCDEFGL-Arg(g/L)1111111126. 72122222213. 33133333330. 74211223316. 05222331120. 06233112228. 37312132314. 38323213123. 39331321224. 010113322122. 011121133225. 012132211325. 013212313219. 014223121331. 715231232123. 016313231215. 317321312313. 718332123119. 3Kl24. 018. 921. 424. 222. 723. 822. 4
K223. 021. 218. 519. 321. 119. 120. 8K318. 325. 225. 421. 721. 622. 422. 1R5. 76. 36. 94. 91. 64. 71. 63、最佳pH值確定通過設(shè)置5個發(fā)酵培養(yǎng)基pH值梯度6. 0，6. 5，7. 0，7. 5，8. 0，測定不同pH對細菌 產(chǎn)酸的影響。如圖3所示，發(fā)酵培養(yǎng)基pH值7. 0時，產(chǎn)精氨酸量最高。4、最佳裝液量確定通過設(shè)置4個梯度的發(fā)酵裝液量(IOOmL錐形瓶)5ml，10ml，15ml，20ml，測定不 同裝液量對細菌產(chǎn)酸的影響。如圖4所示，15%裝液量(15mL/100mL)產(chǎn)酸量最高。5、最優(yōu)條件驗證采用優(yōu)化的種子培養(yǎng)基(各成分質(zhì)量分數(shù)(％)葡萄糖3.0，玉米漿2.0，硫 酸胺((NH4) 2S04) 2. 0，磷酸 二氫鉀(KH2PO4) 0. 1，七水硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 0. 05，尿素 0. 15，pH 7. 0)、優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基(各成分質(zhì)量分數(shù)(％ )葡萄糖12，玉米漿2. 5，硫 酸胺((NH4)2SO4)6. 0，磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 05，七水硫酸鎂(MgSO4 · 7Η20)0· 05，碳酸鈣 (CaCO3) 2.0, pH 7.0)及優(yōu)化的接種量(10 % )，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基pH值(7.0)和最佳發(fā)酵裝 液量(15% )進行驗證試驗。如表7所示，平均產(chǎn)酸為44g/L。表7最優(yōu)條件驗證試驗結(jié)果 一種L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum ZD2009具體應(yīng) 用過程是1、發(fā)酵液中L-精氨酸的分離根據(jù)附圖5所示分離流程對發(fā)酵液中L-精氨酸進行分離。具體過程如下a.絮凝法發(fā)酵液預(yù)處理在發(fā)酵液中加入過量草酸以沉淀Ca2+，在60°C下加熱IOmin沉淀蛋白質(zhì)，靜置。取 調(diào)好PH值的發(fā)酵液50mL，在快速攪拌下緩慢加入絮凝劑，使其完全混合均勻，然后慢速攪 拌，絮凝反應(yīng)結(jié)束后移至50mL量筒中，靜置并觀察菌體沉降過程，Ih后取上清液，用分光光 度計以蒸餾水作空白于650nm處測定吸光度值，算出絮凝率RF值(f locculation ratio)。 RF值定義如下RF = (0D絮凝前-OD麵后)/OD絮凝前X 100% (RF值越大，說明絮凝效果越好)。732#離子交換樹脂樹脂預(yù)處理樹脂一去離子水浸泡攪拌洗滌2到3次(洗去大 量泡沫)一乙醇浸泡以除去吸附的少量有機物質(zhì)一2mol/L氫氧化鈉(NaOH)浸泡一水洗至 中性一2mol/L鹽酸(HCl)浸泡一水洗至中性一2mol/L氫氧化鈉(NaOH)浸泡一水洗至中 性一2mol/L鹽酸(HCl)浸泡一水洗至中性一lmol/L氨水浸泡一水洗至中性，最后浸泡于 去離子水中備用。b.固定床離子交換先將一定的去離子水裝于玻璃柱中(與柱頂齊平)，將管底夾子打開，排除氣泡 后，樹脂懸浮液由柱頂部慢慢加入。裝柱時要防止“節(jié)”和氣泡的產(chǎn)生?！肮?jié)”是指柱內(nèi)產(chǎn)生 明顯的分界線，這是由于裝柱不均勻造成樹脂時松時緊。要做到均勻裝柱，柱內(nèi)要有一定高 度的水面，樹脂要與水混合傾入，借助水的浮力使樹脂自然沉降，操作盡可能均勻連續(xù)。將已經(jīng)過預(yù)處理的發(fā)酵液，調(diào)PH值至2. 0，用恒流泵控制一定的流速用正上柱的 方式輸送到柱子中，同時用分部收集器對流出液分部收集測定其中的L-精氨酸含量。上柱完畢后，以1 2倍上柱液體積的水洗柱，以除去不吸附的大量雜質(zhì)。配制一 定濃度的洗脫劑，以一定的流速輸送到柱子中，使吸附在樹脂上的氨基酸按一定的順序洗 脫下來，對洗脫液進行分部收集。c活性炭脫色往調(diào)好pH值的待脫色液中加入10g/L的活性炭，在80°C下，攪拌脫色60min，過 濾，測定濾液的吸光度值，計算出脫色率。采用分光光度計，以蒸餾水為空白液，在400nm下 測定脫色前后溶液的吸光度值。脫色率(％) = (0D-OD)/ODX 100% (脫色 率越大，脫色效果越好)。2、L-精氨酸在斷奶仔豬上的應(yīng)用購買60頭21日齡的健康二元雜交(長白X大約克)斷奶去勢仔豬 (5. 42士0. 59kg)，按處理隨機分為4組，每個處理15頭，單欄飼養(yǎng)(一欄一頭，南北兩列均 勻分布)。試驗采用單因素完全隨機分組試驗設(shè)計，分為4個處理0%精氨酸，0. 4%精氨酸，0. 6%精氨酸，0. 8%精氨酸，試期為21天。如表8表明，日糧中添加0. 8% L-精氨酸能提 高斷奶仔豬平均日增重和平均日采食量，降低料肉比。如圖5表明，日糧中添加0. 8 % L-精 氨酸可以通過提高斷奶仔豬肌肉中有利于蛋白質(zhì)翻譯的起始因子活性，從而促進斷奶仔豬 肌肉蛋白質(zhì)合成，達到促進斷奶仔豬生長的營養(yǎng)效果。表8精氨酸對21日斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響
權(quán)利要求
一種L 精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌，其特征在于L 精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ZD2009，CCTCC NOM209260。
2.權(quán)利要求1所述的一種L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌的制備方法，其步驟是(1)紫外線誘變?nèi)」劝彼岚魲U菌培養(yǎng)12h種子液5ml，用高速離心機5000rpm離心 5min,棄去上清液，用無菌生理鹽水洗滌，菌種用玻璃珠打散，得菌懸液，在20w紫外燈下 50cm處照射30 40s，將經(jīng)過誘變的菌液涂布在含濃度為4mg/mLAE的基本培養(yǎng)基平板上， 30°C培養(yǎng)7 8d，挑選長出的菌落為N-硝基-L-精氨酸甲酯的變異菌株，篩選出的菌落再 經(jīng)斜面培養(yǎng)、種子液培養(yǎng)、發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)，最后用坂口改良法測定發(fā)酵液中的L-精氨酸含 量；(2)1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍誘變?nèi)」劝彼岚魲U菌培養(yǎng)12h種子液5ml，用高速 離心機5000rpm離心5min，棄去上清液，用無菌生理鹽水洗滌，菌種用玻璃珠打散，生理鹽 水洗滌后，用0. lmol/L磷酸緩沖液pH 6. 0洗滌2次，加入0. lmol/L磷酸緩沖液pH 6. 0至6.5ml，加入濃度為0. 4mg/mLl-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍，30°C誘變15min，用0. lmol/L 磷酸緩沖液PH 6. 0洗滌3次，除去1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍終止誘變，將經(jīng)過誘變的 菌液涂布在含濃度為4mg/mL AE的基本培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)7 8d，挑菌落，篩選出的 菌落再經(jīng)斜面培養(yǎng)、種子液培養(yǎng)、發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)，用坂口改良法測定發(fā)酵液中的L-精氨酸 含量；(3)搖瓶發(fā)酵條件種子培養(yǎng)基各成分質(zhì)量分數(shù)％葡萄糖3. 0,玉米漿2. 0,硫酸 胺((NH4)2SO4) 2. 0，磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 1，七水硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 0. 05，尿素 0. 15， PH 7.0，采用三因素三水平L9 (33)實驗設(shè)計，三因素三水平，共九個實驗組，記為L9 (33) 因素1為葡萄糖，設(shè)2%，3%，4%三水平；因素2為玉米漿，設(shè)1%，2%，3%三水平；因素 3為硫酸胺((NH4)2S04)，設(shè)1 %，2 %，3 %三水平，磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.1%,七水硫酸鎂 (MgSO4 · 7H20)0. 05%，尿素 0. 15%, pH 7. 0-7. 2 不變；(4)發(fā)酵培養(yǎng)基及接種量采用七因素三水平L18(37)實驗設(shè)計，七因素三水平，共十八 個實驗組，記為L18(37)因素1為葡萄糖，設(shè)9%，12%，15%三水平；因素2為玉米漿，設(shè) 2%，2. 5%，3%三水平；因素3為硫酸銨((NH4)2SO4)，設(shè)3%，4· 5%，6%三水平；因素4為磷 酸二氫鉀(KH2PO4)，設(shè)0. 05%，0. 1 %，0. 15%三水平，因素5為七水硫酸鎂(MgSO4. 7H20)，設(shè) 0. 03%,0. 05%,0. 07%三水平，因素6為碳酸鈣(CaCO3)，設(shè)2%，3%，4%三水平；因素7為 接種量設(shè)6%，8%，10%三水平；(5)pH值確定通過設(shè)置5個發(fā)酵培養(yǎng)基pH值梯度6. 0，6. 5，7. 0，7. 5，8. 0，測定不同 PH對細菌產(chǎn)酸的影響；(6)裝液量確定通過設(shè)置4個梯度的發(fā)酵裝液量，IOOmL錐形瓶5ml，10ml，15ml， 20ml，測定不同裝液量對細菌產(chǎn)酸的影響；(7)條件驗證采用種子培養(yǎng)基各成分質(zhì)量分數(shù)％葡萄糖3.0，玉米漿2.0，硫酸胺 ((NH4)2SO4) 2. 0，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0. 1，七水硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 0. 05，尿素 0. 15，pH7.0 ；發(fā)酵培養(yǎng)基各成分質(zhì)量分數(shù)％ 葡萄糖12，玉米漿2. 5，硫酸胺((NH4)2S04)6. 0，磷酸二 氫鉀(KH2PO4) 0. 05，七水硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 0. 05，碳酸鈣(CaCO3) 2. 0，發(fā)酵培養(yǎng)基pH值 7. 0和發(fā)酵裝液量15%進行驗證試驗。
3.權(quán)利要求1所述的一種L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌產(chǎn)生的L-精氨酸在斷奶仔豬飼料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌及制備方法和應(yīng)用，L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ZD2009，CCTCC NOM209260。包括以下步驟A、紫外線誘變?nèi)」劝彼岚魲U菌培養(yǎng)，離心，棄去上清液，洗滌，菌種用玻璃珠打散，獲得細胞懸液；B、1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍誘變?nèi)」劝彼岚魲U菌培養(yǎng)，離心，棄去上清液，洗滌，菌種用玻璃珠打散，洗滌后，用磷酸緩沖液洗滌，加入1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍，誘變，用磷酸緩沖液洗滌，除去1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍終止誘變；C、搖瓶發(fā)酵條件；D、發(fā)酵培養(yǎng)基及接種量；E、pH值確定；F裝液量確定。得到一種L-精氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌，該菌株產(chǎn)酸量達44g/L，且產(chǎn)酸穩(wěn)定，遺傳穩(wěn)定性高，降低了生產(chǎn)成本，提高了效率。
文檔編號A23K1/18GK101928682SQ20091027308
公開日2010年12月29日 申請日期2009年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月4日
發(fā)明者印遇龍, 周棟, 唐志如 申請人:中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所