重組工程介導(dǎo)的谷氨酸棒桿菌atcc 13032的基因敲除方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一種重組工程介導(dǎo)的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因敲除方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基酸是人體生長、營養(yǎng)的必需物質(zhì)，氨基酸在工業(yè)和醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域均有著廣 泛的應(yīng)用。每年氨基酸的產(chǎn)量數(shù)以千噸計，而大規(guī)模生產(chǎn)的氨基酸都是通過微生物發(fā)酵而 來。谷氨酸棒桿菌是主要的氨基酸產(chǎn)生菌，目前用于工業(yè)生產(chǎn)的氨基酸產(chǎn)生菌多數(shù)來源于 谷氨酸棒桿菌的原始菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 13032經(jīng)過物理誘變、化學(xué)誘變或基因工程 手段而獲得。
[0003] 目前氨基酸的產(chǎn)量呈不斷上升趨勢，但仍不能滿足要求，而且能夠生產(chǎn)的氨基酸 仍然局限于谷氨酸和精氨酸等少數(shù)幾種氨基酸。因此提高現(xiàn)有氨基酸的產(chǎn)量并對谷氨酸棒 桿菌進行改造以使之能夠生產(chǎn)更多種類的氨基酸具有重要意義。
[0004] 谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因組序列已在2003年被測序和分析，但仍有許多 未確切的基因組信息未被解釋，仍需要大量的實驗數(shù)據(jù)對其中基因功能進行闡明。闡明基 因功能的一個必要的方法就是基因敲除，通過比較原株和基因敲除變株的生理、生化和遺 傳等生物學(xué)功能即可闡明所研宄的基因在生物體中具有什么功能。
[0005] 經(jīng)典的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因敲除方法是通過結(jié)合轉(zhuǎn)移將突變片段轉(zhuǎn)化 至菌株再通過負篩選而實現(xiàn)。實驗步驟為通過PCR擴增待敲除基因左右兩側(cè)的同源片段 (大小一般在Ikb以上），克隆測序后，再克隆至含有sacB基因的自殺載體上。將含有此自 殺質(zhì)粒的大腸桿菌和含有負責(zé)基因轉(zhuǎn)移的tra基因（行使基因轉(zhuǎn)移功能）但不同抗性的大 腸桿菌與谷氨酸棒桿菌ATCC 13032三個菌株混合，在含重組質(zhì)?？剐缘钠桨迳线M行篩選。 由于自殺質(zhì)粒不能在谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的細胞中自主復(fù)制，抗性篩選的壓力使得 菌株利用自身的重組功能將自殺質(zhì)粒上的左側(cè)或右側(cè)的同源片段和基因組上的同源片段 之間進行同源重組而整合至谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因組上。隨后將菌株在含有蔗 糖的培養(yǎng)基中進行負篩選。由于整合至基因組上的自殺質(zhì)粒中含sacB基因，sacB基因編 碼的蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶催化蔗糖而生成對菌株有毒性的聚蔗糖，因此在蔗糖的負篩選 之下，谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的自身重組系統(tǒng)催化第二輪的同源重組而去除含sacB基 因的質(zhì)粒部分。第二輪的同源重組可發(fā)生在與首次同源重組相同的一側(cè)，也可發(fā)生在與首 次同源重組不同的一側(cè)，如為前者則得到谷氨酸棒桿菌ATCC 13032原株，如為后者則得到 目的基因敲除變株。由此可見，這種經(jīng)典的基因敲除方法耗時費力（需要多個基因克隆和 測序步驟）、繁瑣（需要多個菌株的參與和多重實驗操作步驟），因為最終的篩選可同時得 到原株和變株，對某些基因而言，基因敲除效率常常較低，需篩選大量的克隆才能得到目的 的基因敲除變株，由此加大了實驗的難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為簡捷快速和高通量地實現(xiàn)對谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因進行敲除，從而 為研宄基因功能及至獲得高產(chǎn)的氨基酸產(chǎn)生菌或生產(chǎn)多種其他種類的氨基酸奠定基礎(chǔ)，本 發(fā)明提供了一種利用重組工程手段對谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因進行敲除的方法。
[0007] 本發(fā)明所涉及的一種重組工程介導(dǎo)的對谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的進行基因敲 除的方法，包括如下步驟：
[0008] (1)通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增獲得兩側(cè)為針對待敲除的目的基因500bp同源序 列、中間為卡那霉素抗性基因的線性底物DNA片段；
[0009] ⑵線性底物DNA片段電轉(zhuǎn)化至由異丙基-β -D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)的、克隆在質(zhì) 粒PLS3023中的重組酶基因 red α和red β表達的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032細胞中。在 卡那霉素篩選之下，卡那霉素抗性基因取代目的基因而獲得基因敲除變株；
[0010] (3)將基因敲除變株在含10%蔗糖的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)以消除含重組酶基因的 質(zhì)粒 PLS2023。
[0011] 本發(fā)明使用重組工程方法來實現(xiàn)所轉(zhuǎn)化的線性片段和基因組上同源片段之間的 同源重組。重組工程是利用重組酶催化同源片段之間的重組而進行基因克隆和基因修飾的 一種生物技術(shù)手段。重組工程避免了繁瑣的基因克隆以及其他一些操作步驟。最常用的重 組酶基因是來源自λ B莖菌體的、位于一個操縱元上的red a，red β和red γ基因。red α基 因編碼5' 一 3' DNA外切酶，其作用于轉(zhuǎn)化的雙鏈線性DNA分子而得到DNA單鏈分子；red β 基因編碼重組酶，負責(zé)催化同源重組；redY基因編碼Gam蛋白，Gam蛋白可抑制內(nèi)源性核酸 酶對外源DNA片段的降解。
[0012] 本發(fā)明使用的是reda和redf3這兩個基因，因為實驗發(fā)現(xiàn)在本谷氨酸棒桿菌 ATCC 13032基因敲除實驗中，不能加入redy基因，否則不能構(gòu)建目的質(zhì)粒。本發(fā)明所使用 的、表達重組酶基因 reda和redf3的質(zhì)粒pLS3023是由如下方法獲得：以pSNIOl為模板， SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2為引物PCR擴增得到含核糖體結(jié)合位點的1.5kb的DNA片段， 以PstI和BamHI酶切后，克隆至以同樣酶切的載體pBluescript II KS(-)得到重組克隆 PLS2333。PstI和BamHI酶切分離pLS2333中的插入片段克隆至以同樣酶切的pEKEx3獲得 PLS3005。以λ噬菌體DNA為模板，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 3為引物PCR擴增得到1.5kb 的red α和red β DNA片段，以SacI和XbaI酶切后，克隆至以相同酶切的pBluescript Π KS(-)獲得pLS3014。SacI和XbaI酶切分離pLS3014的插入片段、XbaI和BamHI酶切 分離PKsacB的插入片段，二者和SacI和BamHI酶切的pBluescript II KS (-)連接后獲得 PLS3016。NcoI和BamHI酶切分離pLS3016的插入片段克隆至以相同酶切的pLS3005獲得 PLS3023。
[0013] 將重組酶基因 red α和red0自λ噬菌體擴增后置于在pTac啟動子之下，pTac 啟動子受調(diào)節(jié)基因 IacIq所嚴謹調(diào)控。在環(huán)境中不含有誘導(dǎo)劑IPTG時，IacIq基因編碼抑 制蛋白而抑制PTac啟動子的表達；當(dāng)環(huán)境中含有IPTG時，IPTG和LacIq結(jié)合而解除后者 其對pTac的抑制，pTac因此驅(qū)動red α和red β的表達而行使同源重組的功能。
[0014] 在獲得基因敲除變株后，表達重組酶基因的質(zhì)粒常常去除以簡化背景和減少代謝 負擔(dān)。為實現(xiàn)這一目的，PLS3023同時克隆有sacB基因，這樣含pLS3023的菌株在10%蔗 糖的培養(yǎng)基上生長時，sacB基因發(fā)揮負篩選作用，擴增的子代細胞中如含有sacB基因則不 能生存，因而通過培養(yǎng)即可獲得質(zhì)粒LS3023消除的基因敲除菌株。
[0015] 谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因上的crtI2基因和upp基因敲除證明了本重組工 程方法的可行性。crtI2基因在谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因組上的基因編號為cg0721， 為八氫番茄紅素合成酶基因，參與谷氨酸棒桿菌ATCC 13032黃色色素的形成。黃色色素是 細胞分化和發(fā)酵中的關(guān)鍵產(chǎn)物，具重要生理意義。upp基因在谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基 因組上的基因編號為cg〇786,為尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因，是磷酸核糖的生物合成中 的關(guān)鍵基因，對氨基酸的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)非常重要。
[0016] 本發(fā)明的重組工程介導(dǎo)的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因敲除方法，采用簡便的 PCR和電轉(zhuǎn)化輔以卡那霉素抗性篩選，無需基因克隆等分子生物學(xué)及其他一些操作步驟。方 法簡便快捷，將在研宄基因功能及至氨基酸的生產(chǎn)方面有著重要的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0017] 圖1重組工程法介導(dǎo)的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因敲除示意圖。
[0018] GOI表示待敲除的目的基因，Hl和H2表示目的基因的上游和下游的500bp片段， neo表示卡那霉素抗性基因，pLS3023中的重組酶red α和red0在IPTG誘導(dǎo)下表達，催化 線性片段和基因組上同源片段之間的同源重組。在卡那霉素的抗性篩選之下獲得卡那霉素 抗性基因取代目的基因的基因敲除變株。基因敲除變株的基因型由上游整合位點一端的Pl 引物和卡那霉素抗性基因中間的P2、卡那霉素基因中間的P3和下游整合位點一端的P4引 物這兩對引物的PCR反應(yīng)所驗證。所得菌株在含10%蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，負篩選作用使 PLS3023 失去。
[0019] 圖2是crt2基因敲除變株基因型分析的凝膠電泳結(jié)果
[0020] [1] λ/HindIII DNA 分子量標準（自上而下）：23· 1,9. 4, 6. 6, 4. 4, 2. 3, 2. Okb
[0021] [2]以13032原株基因組DNA為模板，R1417-R1418PCR擴增得到2360bp ;
[0022] [3]以crtI2基因敲除變株基因組DNA為模板，R1417-R1419PCR擴增得到1038bp ;
[0023] [4]以crtI2基因敲除變株基因組DNA為模板，R1420-R1418PCR擴增得到1324bp ;
[0024] [5]以crtI2基因敲除變株基因組DNA為模板，R1417-R1418PCR擴增得到2342bp ;
[0025] [6]DL2000DNA 分子量標準（自上而下）：2. 0, 1. 0, 0· 75, 0· 5, 0· 25, 0· lkb。
[0026] 圖3是upp基因敲除變株基因型分析的凝膠電泳結(jié)果
[0027] [1] λ/HindIII DNA 分子量標準（