大腸桿菌輔酶代謝途徑改造和生物轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)表達(dá)大腸桿菌屬主中輔酶代謝途徑改造，以增加其內(nèi)源性輔酶和用改造過(guò)的屬主菌全細(xì)胞細(xì)菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]非對(duì)稱(chēng)生物還原法制備手性天然，非天然氨基酸，手性氨和手性醇是一項(xiàng)非常有效的制備高旋光活性的手性分子的方法。早期的方法是用生物提取的酶，輔酶和輔酶再生系統(tǒng)實(shí)施該反應(yīng)。因輔酶價(jià)格昂貴，改用膜技術(shù)進(jìn)行反應(yīng)，將輔酶和大分子的PEG偶聯(lián)(Separat1ns Using Aqueous Phase Systen, 1989, p345_347),使得輔酶和生物轉(zhuǎn)化的酶一樣，可以被半透明膜截留，底物小分子通過(guò)膜進(jìn)入反應(yīng)體系，生成的產(chǎn)物從膜內(nèi)的反應(yīng)體系中出來(lái)，達(dá)到輔酶被反復(fù)利用，同時(shí)輔酶與PEG偶聯(lián)后，自身的穩(wěn)定性顯著性增加，降低了輔酶使用的工業(yè)化成本。
[0003]生化提取的酶成本較高，近年來(lái)用全細(xì)胞細(xì)菌直接進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法得到青睞，可減少酶的工業(yè)化成本。用全細(xì)胞細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，酶的來(lái)源成本較低，但通常需要添加輔酶，且輔酶不能被回收反復(fù)利用。國(guó)外已有在高濃度底物和不添加輔酶就可實(shí)現(xiàn)高效率轉(zhuǎn)化的文獻(xiàn)報(bào)道(Eng.Life Sc1.2004, N0.6, p573-576, Organic Process &Development 2006，10，666-669),但文獻(xiàn)報(bào)道工作無(wú)法重復(fù)。為減少全細(xì)胞細(xì)菌在進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時(shí)輔酶的添加量或不添加輔酶，本專(zhuān)利采用的方法是對(duì)表達(dá)轉(zhuǎn)化酶屬主細(xì)菌的代謝途徑進(jìn)行改造，去掉細(xì)菌內(nèi)與輔酶降解酶的基因，實(shí)現(xiàn)輔酶在屬主細(xì)菌中富集，實(shí)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，可顯著性減少輔酶的添加量，或不用添加輔酶，即可實(shí)現(xiàn)高效率轉(zhuǎn)化。用改造過(guò)的屬主菌表達(dá)亮氨酸脫氫酶和甲酸酶，用于新戊基酮酸生物轉(zhuǎn)化制備L-新戊基甘氨酸過(guò)程中，避免了添加輔酶，并實(shí)現(xiàn)高效率轉(zhuǎn)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于改善野生型蛋白表達(dá)屬主菌表達(dá)轉(zhuǎn)化酶后，用于非對(duì)稱(chēng)還原法制生物轉(zhuǎn)化制備手性分子時(shí)，內(nèi)源性輔酶輔酶不足的缺陷。提供一種大腸桿菌輔酶代謝途徑改造方法，提高了轉(zhuǎn)化酶系表達(dá)屬主菌的內(nèi)源性輔酶，使得用改造過(guò)的細(xì)菌進(jìn)行酶表達(dá)后，用于生物轉(zhuǎn)化時(shí)，可以顯著性減少輔酶在轉(zhuǎn)化體系中的添加量或不添加輔酶。
[0005]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
通過(guò)同源重組的方法去除了蛋白質(zhì)表達(dá)屬主菌大腸桿菌JM109(DE3)中與輔酶降解有關(guān)的基因yjaD yrfE，使得屬主菌在繁殖時(shí)內(nèi)源性輔酶濃度得以增加，用這種菌表達(dá)轉(zhuǎn)化酶系，用于不對(duì)稱(chēng)還原法生物轉(zhuǎn)化時(shí)，不用添加輔酶，或極顯著減少輔酶的添加量，即可實(shí)現(xiàn)高效率轉(zhuǎn)化。這個(gè)方法同樣適合用于缺失其它蛋白質(zhì)表達(dá)屬主菌，如BL21(DE3)，DH5alpha等細(xì)菌內(nèi)的輔酶代謝途徑中的yjaD yrfE基因，這都在我們的保護(hù)范圍。
[0006]在上述改造過(guò)的蛋白表達(dá)屬主菌內(nèi)，在表達(dá)生物轉(zhuǎn)化的酶系后，用非對(duì)稱(chēng)還原氨法生物轉(zhuǎn)化制備L-新戊基甘氨酸，在不添加輔酶的情況下，實(shí)現(xiàn)高效率生物轉(zhuǎn)化，效率可達(dá)90%以上，EE值99%以上。在權(quán)利要求1中的菌種還可以用于表達(dá)其它酶系，用于非對(duì)稱(chēng)還原法生物轉(zhuǎn)化制備其它的手性產(chǎn)物，可極顯著性的減少輔酶添加量或不加輔酶，并實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)化效率，如手性天然氨基酸，手性非天然氨基酸和將分子中的酮基還原成手性氨和手性醇，這包含在我們的專(zhuān)利保護(hù)范圍內(nèi)。
[0007]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明，用同源重組的方法對(duì)表達(dá)蛋白質(zhì)的大腸桿菌屬主菌JM109(DE3)的輔酶代謝途徑進(jìn)行改造，使得與輔酶降解相關(guān)的二個(gè)酶缺失(yjaD和yrfE基因產(chǎn)物)，獲得的輔酶代謝缺陷型大腸桿菌內(nèi)的輔酶在繁殖時(shí)，因降解酶的缺失而得以富集，使得內(nèi)源性輔酶的濃度顯著增加。用這樣的屬主菌，還可以表達(dá)其它非對(duì)稱(chēng)還原法生物轉(zhuǎn)化的酶系，用于制備手性天然氨基酸，非天然氨基酸，酮基的非對(duì)稱(chēng)還原成手性氨和手性醇等分子，可以在顯著性減少輔酶在轉(zhuǎn)化體系中的添加量或不添加輔酶，實(shí)現(xiàn)高效率轉(zhuǎn)化，有利于降低生物轉(zhuǎn)化的工業(yè)化成本。
【具體實(shí)施方式】
[0008]實(shí)施例1:
我們用同源重組的方法將JM109 (DE3)中的yjaD和yrfE基因進(jìn)行缺失。缺失方法，選取yjaD基因的編碼區(qū)500bp的二邊，上下游各Ikb序列，從基因組DNA上，用PCR方法擴(kuò)增，得到片段，拼接，并亞克隆PCVD442載體上(在大腸桿菌DH5 a pir菌種中進(jìn)行分子操作)，構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109 (DE3)中，用氨芐抗性基因做正篩選，得到的克隆再用蔗糖進(jìn)行負(fù)篩選，得到y(tǒng)jaD基因敲出的JM109(DE3) Δ yjaD,基因敲出的菌種用PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。用上述同樣的方法，在JM109(DE3) AyjaD菌種中，，去掉yrfE基因，得到JM109 (DE3) AyjaD yrfE。用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)以上野生型和缺陷型的大腸桿菌，測(cè)定內(nèi)源性輔酶的含量，缺陷型JM109 (DE3) Δ yjaD yrfE菌體中的輔酶含量是野生型JM109 (DE3)的6.5倍。
[0009]實(shí)施例2:用表達(dá)亮氨酸脫氫酶和甲酸酶JM109(DE3) Δ yjaD yrfE用于制備L-新戊基甘氨酸
將亮氨酸脫氫酶和甲酸酶基因通過(guò)二種不同拷貝數(shù)和抗性的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入JM109 (DE3) AyjaD yrfE進(jìn)行共表達(dá)，用新戊基酮酸作為底物，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，在不添加輔酶的條件下，轉(zhuǎn)化效率在90%以上。而作為對(duì)照試驗(yàn)，使用野生型菌表達(dá)以上二個(gè)酶，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，效率只有15%，但添加輔酶后仍然可以實(shí)現(xiàn)100%的高效率轉(zhuǎn)化。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化獲得的L-新戊基甘氨酸，用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化，收率在85%，EE值達(dá)到99.6%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種大腸桿菌輔酶代謝途徑改造和生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:通過(guò)同源重組的方法對(duì)輔酶代謝途徑的改造，去掉了蛋白質(zhì)表達(dá)屬主菌大腸桿菌JM109(DE3)中和輔酶降解有關(guān)的基因yjaD yrfE，使得屬主菌在繁殖時(shí)內(nèi)源性輔酶的濃度增加。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌輔酶代謝途徑改造和生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，在上述改造過(guò)的蛋白表達(dá)屬主菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，可以在不用添加輔酶的情況下，用非對(duì)稱(chēng)還原氨法生物轉(zhuǎn)化制備L-新戊基甘氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌輔酶代謝途徑改造和生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，菌種還可以用于表達(dá)其它酶系，用于非對(duì)稱(chēng)還原法生物轉(zhuǎn)化制備其它的手性產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌輔酶代謝途徑改造和生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，其它手性產(chǎn)物為手性天然氨基酸，手性非天然氨基酸和將分子中的酮還原成手性氨和手性醇分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌輔酶代謝途徑改造和生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，用同源重組的方法將JM109 (DE3)中的yjaD和yrfE基因進(jìn)行缺失，得到JM109 (DE3) Δ yjaDyrfE，使得內(nèi)源性輔酶得以富集。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的大腸桿菌輔酶代謝途徑改造和生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，用輔酶代謝途徑被改造大腸桿菌屬主菌表達(dá)酶亮氨酸脫氫酶和甲酸酶系進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，是將基因通過(guò)二種不同拷貝數(shù)和抗性的表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)入JM109(DE3) AyjaD yrfE進(jìn)行表達(dá)，用新戊基酮酸作為底物，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，獲得的L-新戊基甘氨酸。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種大腸桿菌輔酶代謝途徑改造和生物轉(zhuǎn)化方法。通過(guò)同源重組的方法對(duì)輔酶代謝途徑的改造，去掉了蛋白質(zhì)表達(dá)屬主菌大腸桿菌JM109(DE3)中和輔酶降解有關(guān)的基因yjaDyrfE，使得屬主菌在繁殖時(shí)內(nèi)源性輔酶的濃度增加。此方法改造的屬主菌表達(dá)酶系用于非對(duì)稱(chēng)生物還原法進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化制備手性分子，可以顯著性減少輔酶在轉(zhuǎn)化體系中的添加量或不添加輔酶。
【IPC分類(lèi)】C12R1-19, C12N15-70, C12P13-04, C12N1-21
【公開(kāi)號(hào)】CN104561070
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310505596
【發(fā)明人】郁慶明
【申請(qǐng)人】郁慶明
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2013年10月24日