專利名稱：：編碼代謝途徑蛋白的谷氨酸棒桿菌基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及編碼代謝途徑蛋白的谷氨酸棒桿菌基因。描述了分離的編碼新的谷氨酸棒桿菌MP蛋白的核酸分子，該分子被稱為MP核酸分子。本發(fā)明也提供了反義核酸分子，含有MP核酸分子的重組表達載體，以及已導(dǎo)入表達載體的宿主細胞。本發(fā)明也進一步提供了分離的MP蛋白，MP突變蛋白，融合蛋白質(zhì)，抗原肽，以及基于谷氨酸棒桿菌MP基因遺傳工程提高由該生物體進行的所需化合物生產(chǎn)的方法。
背景技術(shù)：
：細胞中天然存在的代謝過程中的特定產(chǎn)物和副產(chǎn)物，在很多行業(yè)中具有用途，包括食品、飼料、化妝品和制藥產(chǎn)業(yè)。這些分子總稱為“精細化學(xué)物質(zhì)”，包括有機酸、蛋白源的和非蛋白源的氨基酸、核苷酸和核苷、脂質(zhì)和脂肪酸、二醇、糖類、芳香族化合物、維生素和輔因子以及酶?？梢酝ㄟ^大規(guī)模培養(yǎng)產(chǎn)生并分泌大量特定所需分子的細菌，最方便的制備這些產(chǎn)品。用于這一目的的一種特別有用的生物體就是谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)，一種革蘭氏陽性非病原菌。通過菌株篩選，出現(xiàn)了許多產(chǎn)生大批所需化合物的突變株。然而，為改進特殊分子生產(chǎn)而進行的菌株篩選，是一個耗時并且困難的過程。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了新的細菌核酸分子，這些分子具有多種用途。這些用途包括鑒定可以產(chǎn)生精細化學(xué)物質(zhì)的微生物、調(diào)節(jié)谷氨酸棒桿菌或者親緣細菌中的精細化學(xué)物質(zhì)的產(chǎn)生、谷氨酸棒桿菌或者親緣細菌的分型和鑒定、作為繪制谷氨酸棒桿菌基因組圖譜的參照點。這些新的核酸分子編碼蛋白質(zhì)，此處稱為代謝途徑(MP)蛋白質(zhì)。谷氨酸棒桿菌是一種革蘭氏陽性需氧細菌，通常在工業(yè)中被用于大規(guī)模生產(chǎn)各種精細化學(xué)物質(zhì)，也用于降解烴類(例如在石油泄漏中)和氧化萜品醇。因此，本發(fā)明的MP核酸分子，可用來鑒定能用于生產(chǎn)精細化學(xué)物質(zhì)的微生物，例如通過發(fā)酵方法。調(diào)節(jié)本發(fā)明MP核酸分子的表達，或者修飾本發(fā)明MP核酸分子的序列，可以用于調(diào)節(jié)微生物中一種或者多種精細化學(xué)物質(zhì)的生產(chǎn)(例如，提高棒桿菌或者短桿菌中一種或者多種精細化學(xué)物質(zhì)的產(chǎn)生)。本發(fā)明MP核酸分子可用于鑒定一種微生物是否是谷氨酸棒桿菌或者其親緣菌株，或者鑒定微生物混合群體中谷氨酸棒桿菌或者其親緣菌株的存在。本發(fā)明提供了許多谷氨酸棒桿菌基因的核酸序列；在嚴(yán)格條件下，用探針探查從單一微生物或者混合微生物群體培養(yǎng)物中提取的基因組DNA，該探針覆蓋了谷氨酸棒桿菌基因特有的一段區(qū)域，可以確定是否有該微生物存在。盡管谷氨酸棒桿菌本身是非病原性的，但是它與人體中的病原菌種有關(guān)，例如白喉棒狀菌(Corynebacteriumdiphtheriae)(白喉致病原)；探測這種微生物具有重大的臨床實用性。本發(fā)明MP核酸分子也可以用作繪制谷氨酸棒桿菌基因組圖譜的參照點，或者繪制其親緣菌株基因組圖譜的參照點。相似的，這些分子，或者其變體或其部分，可以用作遺傳工程棒桿菌或者短桿菌的遺傳標(biāo)記。例如，本發(fā)明新核酸分子編碼的MP蛋白可以進行某些精細化學(xué)物質(zhì)代謝中的酶促步驟，所述精細化學(xué)物質(zhì)包括氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子(nutraceutical)、核苷酸、核苷和海藻糖?？紤]到可在谷氨酸棒桿菌中使用的克隆載體的實用性，例如在Sinskeyetal.，美國專利號No.4,649,119中公開的，并且考慮到谷氨酸棒桿菌和親緣短桿菌菌種(例如乳發(fā)酵短桿菌)的遺傳操作技術(shù)(Yashihamaetal，J.Bacteriol.162591-597(1985)；Katsumataetal.，J.Bacteriol.159306-311(1984)；以及Santamariaetal.，J.Gen.Microbiol.1302237-2246(1984))，本發(fā)明的核酸分子可用于該生物體的遺傳工程，使之成為一種或者多種精細化學(xué)物質(zhì)更好的或者更有效的生產(chǎn)者。精細化學(xué)物質(zhì)的提高或有效生產(chǎn)可以是本發(fā)明基因操作的直接作用或這種基因操作的間接作用。具體而言，谷氨酸棒桿菌氨基酸、維生素、輔因子、核苷酸和海藻糖代謝途徑的改變對這種生物生產(chǎn)一種或多種這些所需化合物具有直接的效應(yīng)。例如，優(yōu)化賴氨酸生物合成途徑蛋白活性或降低賴氨酸分解途徑蛋白活性可以導(dǎo)致由這種工程改造的生物生產(chǎn)賴氨酸的產(chǎn)量或效率提高。這些代謝途徑蛋白的改變也會對所需精細化學(xué)物質(zhì)生產(chǎn)或效率有間接影響。例如，與生產(chǎn)所需分子必須的中間體競爭的反應(yīng)可以被消除，或者生產(chǎn)所需化合物特定中間體必須的途徑可以被優(yōu)化。此外，氨基酸、維生素或核苷酸生物合成或降解的調(diào)控可以增加生產(chǎn)和分裂的能力，從而增加培養(yǎng)物中微生物的數(shù)量和/或生產(chǎn)能力，并增加所需精細化學(xué)物質(zhì)的可能產(chǎn)量。本發(fā)明的核酸和蛋白分子可以用來直接提高谷氨酸棒桿菌中一種或多種所需精細化學(xué)物質(zhì)的生產(chǎn)或生產(chǎn)效率。使用本領(lǐng)域已知的重組技術(shù)，一種或多種本發(fā)明的氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖的生物合成或降解酶可以被改變，從而調(diào)節(jié)其功能。例如，可以提高生物合成酶的效率，或破壞其別構(gòu)控制區(qū)從而防止化合物生產(chǎn)的反饋抑制。類似地，降解酶可以通過置換、缺失或增加被缺失或修飾，從而其對所需化合物的降解活性降低，而不影響細胞的活力。在各種情況下，所需精細化學(xué)物質(zhì)的總產(chǎn)量或產(chǎn)率均被提高。本發(fā)明的蛋白質(zhì)和核苷酸分子的改變也可能通過間接機制提高除氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖以外的其它精細化學(xué)物質(zhì)的生產(chǎn)。任一種化合物的代謝必然與細胞內(nèi)其它生物合成和降解途徑關(guān)聯(lián)，一種途徑中的必需輔因子、中間體或底物可能由其它同類途徑供給或受其限制。因此，通過調(diào)整一種或多種本發(fā)明蛋白的活性，另一種精細化學(xué)物質(zhì)生物合成或降解途徑活性的生產(chǎn)或效率可能會受到影響。例如，氨基酸可以作為所有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，但其在細胞內(nèi)的存在的水平可能會限制蛋白合成；因此，通過增加細胞內(nèi)一種或多種氨基酸的生產(chǎn)效率或產(chǎn)率，諸如生物合成或降解蛋白的蛋白可以更容易合成。同樣，代謝途徑酶的改變使得特定副反應(yīng)更有利或不利時，會導(dǎo)致一種或多種用作生產(chǎn)所需精細化學(xué)物質(zhì)的中間體或底物的化合物過量生產(chǎn)或生產(chǎn)不足。本發(fā)明提供了新的編碼蛋白質(zhì)的核酸分子，這種蛋白質(zhì)在此處稱作代謝途徑(MP)蛋白質(zhì)，它們能夠完成對細胞正常功能重要的分子例如氨基酸、維生素、輔因子、核苷酸和核苷酸或海藻糖代謝過程中的酶促步驟。編碼MP蛋白的核酸分子此處稱為MP核酸分子。在優(yōu)選實施方案中，MP蛋白執(zhí)行與以下一種或多種物質(zhì)的代謝相關(guān)的酶促步驟氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷和海藻糖。這些蛋白質(zhì)的實例，包括那些在表1中列出的基因所編碼的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的一個方面涉及，分離含有一段編碼一種MP蛋白或者其生物活性部分的核酸序列的核酸分子(例如，cDNA，DNA，或者RNA)，以及分離適合作為探測或擴增MP編碼核酸(例如DNA或者RNA)的引物或者雜交探針的核酸片段。在特別優(yōu)選的實施方案中，分離的核酸分子包含一段列在序列表中的序列號為奇數(shù)的核酸序列(例如，SEQIDNO1，SEQIDNO3，SEQIDNO5，SEQIDNO7...)或者一條這種核苷酸序列的編碼區(qū)域或者其互補序列。在其他特別優(yōu)選的實施方案中，分離的本發(fā)明核酸分子包含與序列表中的序列號為奇數(shù)的核苷酸序列(例如，SEQIDNO1，SEQIDNO3，SEQIDNO5，SEQIDNO7...)或者其部分有至少大約50％同源性，優(yōu)選的有至少大約60％的同源性，更優(yōu)選的有至少大約70％，80％，或90％的同源性，甚至更優(yōu)選的有至少大約95％，96％，97％，98％，99％或者更高的同源性。在其他優(yōu)選的實施方案中，已分離的核酸分子編碼列在序列表中的偶數(shù)序列號氨基酸序列(例如，SEQIDNO2，SEQIDNO4，SEQIDNO6，SEQIDNO8...)。本發(fā)明優(yōu)選的MP蛋白也優(yōu)選具有至少一種此處描述的MP活性。在另一個實施方案中，已分離的核酸分子編碼一種蛋白質(zhì)或者其部分，其中的蛋白質(zhì)或者其部分包含一段氨基酸序列，該序列與本發(fā)明的氨基酸序列(例如，在序列表中偶數(shù)序列號的序列)有充分的同源性，例如，與本發(fā)明的氨基酸序列有充分的同源性而使得該蛋白質(zhì)或者其部分具有MP活性。優(yōu)選，核酸分子編碼的蛋白質(zhì)或者其部分，保持進行氨基酸、維生素、輔因子、核苷酸和核苷酸或海藻糖代謝途徑中的酶促反應(yīng)的能力。在一個實施方案中，核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與本發(fā)明的氨基酸序列(例如，從序列表中的偶數(shù)序列號序列中選出的完整氨基酸序列)有至少大約50％同源性，優(yōu)選的有至少大約60％的同源性，更優(yōu)選的有至少大約70％，80％，90％的同源性，最優(yōu)選的有至少大約95％，96％，97％，98％，99％或者更高的同源性。在另一個優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)是全長的谷氨酸棒桿菌蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與本發(fā)明的全長氨基酸序列(由顯示在相應(yīng)序列表中的奇數(shù)序列號核酸序列(例如，SEQIDNO1，SEQIDNO3，SEQIDNO5，SEQIDNO7...)開放閱讀框架編碼的)充分同源。在另一個優(yōu)選的實施方案中，分離的核酸分子來自谷氨酸棒桿菌，并編碼一種蛋白質(zhì)(例如一種MP融合蛋白)，該蛋白質(zhì)包含一段生物活性區(qū)域，該區(qū)域與本發(fā)明的一種氨基酸序列(例如，序列表偶數(shù)序列號序列中的一個序列)有至少大約50％或者更高的同源性，并且該蛋白質(zhì)能夠催化氨基酸、維生素、輔因子、核苷酸和核苷酸或海藻糖代謝途徑中的反應(yīng)，或者擁有一種或者多種列在表1中的活性，并且該蛋白質(zhì)還包含有一段編碼異源多肽或者調(diào)節(jié)區(qū)域的異源核酸序列。在另一個實施方案中，分離的核酸分子至少有15個核苷酸的長度，并且在嚴(yán)格條件下與含有本發(fā)明核苷酸序列(例如，在序列表中奇數(shù)序列號序列)的核酸分子雜交。優(yōu)選，分離的核酸分子與天然存在的核酸分子一致。更加優(yōu)選，分離的核酸分子編碼天然存在的谷氨酸棒桿菌MP蛋白，或者其生物活性部分。本發(fā)明的另一個方面涉及載體的，例如含有本發(fā)明核酸分子的重組表達載體，和被引入這種載體的宿主細胞的。在一個實施方案中，通過在合適的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，這種宿主細胞被用于生產(chǎn)MP蛋白。然后可以從培養(yǎng)基或者宿主細胞中分離該MP蛋白。另外，本發(fā)明的另一個方面涉及一種經(jīng)過遺傳改變的微生物，MP基因已經(jīng)被引入其中或者已經(jīng)被改變。在一個實施方案中，通過引入作為轉(zhuǎn)基因的編碼野生型或者突變型MP序列的本發(fā)明核酸分子，改變了該微生物的基因組。在另一個實施方案中，改變了該微生物基因組中的內(nèi)源MP基因，例如，通過使用已改變的MP基因進行同源重組而進行功能性破壞。在另一個實施方案中，該微生物中內(nèi)源的或者引入的MP基因通過一個或者多個點突變、缺失或者倒位而被改變，但是仍然能編碼功能MP蛋白。在另一個實施方案中，改變微生物MP基因的一個或者多個調(diào)節(jié)區(qū)域(例如，啟動子、阻抑物或者誘導(dǎo)物)，從而調(diào)節(jié)MP基因的表達。在優(yōu)選的實施方案中，微生物屬于棒桿菌種或者短桿菌種，特別優(yōu)選是谷氨酸棒桿菌。在優(yōu)選的實施方案中，也使用微生物生產(chǎn)所需的化合物，例如氨基酸，特別優(yōu)選是賴氨酸。另一方面，本發(fā)明提供了一種鑒定受試者中白喉棒桿菌存在或者活性的方法。該方法包括對受試者中本發(fā)明的一種或者多種核酸或者氨基酸序列(例如，列在序列表中SEQIDNO1至1156的序列)的檢測，從而可以檢測受試者中谷氨酸棒桿菌的存在或者活性。另外，本發(fā)明的另一個方面涉及已分離出MP蛋白或者其部分，例如其生物活性部分。在一個優(yōu)選的實施方案中，分離的MP蛋白或者其部分可以催化氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝的一種或多種途徑中的酶促反應(yīng)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，已分離的MP蛋白或者其部分與本發(fā)明的一種氨基酸序列(例如，序列表偶數(shù)序列號序列中的一個序列)有足夠高的同源性，使得該蛋白質(zhì)或者其部分保持催化氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝的一種或多種途徑中的酶促反應(yīng)的能力。本發(fā)明也提供了MP蛋白的分離制品。在優(yōu)選的實施方案中，MP蛋白包含本發(fā)明的氨基酸序列(例如，序列表偶數(shù)序列號序列中的一個序列)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明與分離的全長蛋白質(zhì)有關(guān)，該蛋白質(zhì)與本發(fā)明的完全氨基酸序列(序列表偶數(shù)序列號序列中的一個序列)(由顯示在相應(yīng)序列表中的序列號為奇數(shù)的開放閱讀框架編碼)有相當(dāng)高的同源性。此外，在另一個實施方案中，蛋白質(zhì)與本發(fā)明的完全氨基酸序列(例如，序列表中偶數(shù)序列號序列)有至少大約50％同源性，優(yōu)選的有至少大約60％的同源性，更優(yōu)選的有至少大約70％，80％，或90％的同源性，最優(yōu)選的有至少大約95％，96％，97％，98％，或99％或者更高的同源性。在另一個實施方案中，分離的MP蛋白包含的氨基酸序列與本發(fā)明的一條氨基酸序列(例如，序列表中的一條偶數(shù)序列號序列)有至少大約50％或者更高的同源性，并且能夠催化氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝途徑中的酶促反應(yīng)，或者具有表1中列出的一種或者多種活性。另外，分離的MP蛋白可以含有由核酸序列編碼的氨基酸序列，該核酸序列與列在序列表中的偶數(shù)序列號的一個核酸序列雜交，例如在嚴(yán)格條件下雜交，或者與該核酸序列有至少大約50％的同源性，優(yōu)選的有至少大約60％的同源性，更優(yōu)選的有至少大約70％，80％，或90％的同源性，甚至更優(yōu)選的有至少大約95％，96％，97％，98％，或99％或者更高的同源性。MP蛋白的優(yōu)選形式同樣具有一種或者多種此處描述的生物活性，也是優(yōu)選的。MP多肽或者其生物活性部分，可以有效的連接到非MP多肽上而形成融合蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，該融合蛋白質(zhì)具有不同于單獨MP蛋白本身的活性。在另外優(yōu)選的實施方案中，該融合蛋白質(zhì)被引入谷氨酸棒桿菌氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子代謝途徑時，引起谷氨酸棒桿菌中所需精細化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)量、生產(chǎn)和/或生產(chǎn)效率的增加。在特別優(yōu)選的實施方案中，把該融合蛋白整合進宿主細胞的氨基酸、微生物、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝途徑，可以調(diào)節(jié)細胞中所需化合物的生產(chǎn)。另一方面，本發(fā)明提供了篩選可調(diào)節(jié)MP蛋白活性的分子的方法。該分子通過與蛋白質(zhì)分子本身或者底物相互作用，或者與MP蛋白的配偶體結(jié)合，或者通過調(diào)節(jié)本發(fā)明MP核酸分子的轉(zhuǎn)錄或者翻譯來調(diào)節(jié)MP蛋白活性。本發(fā)明的另一個方面涉及生產(chǎn)精細化學(xué)物質(zhì)的方法。該方法涉及培養(yǎng)含有一種載體的細胞，該載體指導(dǎo)本發(fā)明MP核酸分子的表達，從而產(chǎn)生精細化學(xué)物質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法還包含獲得含有該載體細胞的步驟，在該步驟中，使用可以指導(dǎo)MP核酸分子表達的載體轉(zhuǎn)染細胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該方法還包含從培養(yǎng)基中回收精細化學(xué)物質(zhì)的步驟。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，細胞是棒桿菌種或者短桿菌種，或者選自列在表3中的那些菌株。本發(fā)明的另一方面涉及調(diào)節(jié)微生物中一種分子產(chǎn)生的方法。這種方法包括使用調(diào)節(jié)MP蛋白活性或者MP核酸表達的藥劑接觸細胞，使得細胞的相關(guān)活性相對于缺少這種藥劑時的活性發(fā)生了改變。在一個優(yōu)選的實施方案中，調(diào)節(jié)谷氨酸棒桿菌細胞的一種或多種氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝途徑，使得這種微生物所需精細化學(xué)物質(zhì)的產(chǎn)量或者產(chǎn)生效率得到提高。調(diào)節(jié)MP蛋白活性的藥劑，可以是刺激MP蛋白活性或者MP核酸表達的藥劑。刺激MP蛋白活性或者MP核酸表達的藥劑的實例，包括小分子、活性MP蛋白、以及編碼已導(dǎo)入細胞的MP蛋白的核酸。抑制MP蛋白活性或者表達的藥劑的實例包括小分子和反義MP核酸分子。本發(fā)明的另一個方面，涉及調(diào)節(jié)細胞中所需化合物產(chǎn)量的方法，包括把野生型或者突變型MP基因?qū)爰毎摶蚧蛘弑Ａ粼趩为毜馁|(zhì)粒上，或者整合到宿主細胞基因組中。如果整合到宿主細胞基因組中，這種整合可以是任意的，或者是通過同源重組發(fā)生的，從而使得引入的拷貝取代天然基因，導(dǎo)致細胞中所需化合物的產(chǎn)生得到調(diào)節(jié)。在一個優(yōu)選的實施方案中，該產(chǎn)量得到增加。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所說的精細化學(xué)物質(zhì)是氨基酸。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所說的氨基酸是L-賴氨酸。具體實施例方式本發(fā)明提供了MP核酸和蛋白質(zhì)分子，它們參與谷氨酸棒桿菌中某些精細化學(xué)物質(zhì)包括氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷和海藻糖的代謝。本發(fā)明的分子可用于調(diào)節(jié)微生物如谷氨酸棒桿菌中精細化學(xué)物質(zhì)的生產(chǎn)，這種調(diào)節(jié)，可以是直接的(例如在賴氨酸生物合成蛋白的調(diào)節(jié)對該生物體的賴氨酸生產(chǎn)或生產(chǎn)效率具有直接影響時)，或者具有間接影響，但會導(dǎo)致所需化合物產(chǎn)量或生產(chǎn)效率的增加(例如當(dāng)核苷酸生物合成蛋白活性的調(diào)節(jié)對細菌的有機酸或脂肪酸生產(chǎn)有影響，可能是由于生長改進或必需的輔因子、能量化合物或前體分子的供應(yīng)增加)。本發(fā)明的各個方面進一步詳細說明如下。I.精細化學(xué)物質(zhì)“精細化學(xué)物質(zhì)”這個詞是本領(lǐng)域熟知的，包括生物體產(chǎn)生的在各種產(chǎn)業(yè)中使用的分子，例如但不僅僅局限于，制藥、農(nóng)業(yè)和化妝品產(chǎn)業(yè)。這種化合物包括有機酸，例如酒石酸、衣康酸和二氨基庚二酸，蛋白質(zhì)源和非蛋白質(zhì)源氨基酸，嘌呤堿基和嘧啶堿基，核苷，以及核苷酸(例如像是描述在Kuninaka，A.(1996)Nucleotidesandrelatedcompounds，p.561-612，inBiotechnologyvol.6，Rehmetal.，eds.VCHWeinheim及其所含參考文獻中的)，脂質(zhì)，飽和和不飽和脂肪酸(例如花生四烯酸)，二醇(例如，丙烷二醇和丁烷二醇)，芳香族化合物(例如，芳香胺、香草醛和靛)，維生素和輔因子(參見Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry，vol.A27，“Vitamins”，p.443-613(1996)VCHWeinheimandreferencestherein；andOng，A.S.，Niki，E.&Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health，andDisease”ProceedingsoftheUNESCO/ConfederationofScientificandTechnologicalAssociationsinMalaysia，andtheSocietyforFreeRadicalResearch-Asia，heldSept.1-3，1994atPenang，Malaysia，AOCSPress，(1995))，酶，聚酮化合物(ployketides)(Caneetal.，(1998)Science28263-68)，以及所有在Gutcho(1983)ChemicalsbyFermentation，NoyesDataCorporation，ISBN0818805086及其參考文獻中描述的化學(xué)物質(zhì)。某些這些精細化學(xué)物質(zhì)的代謝和用途進一步詳細說明如下。A.氨基酸的代謝和用途氨基酸包括所有蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元，同樣也是所有生物體正常細胞生物功能所必需的?！鞍被帷边@個詞是本領(lǐng)域熟知的。蛋白質(zhì)源的氨基酸有20種，是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，相互之間由肽鍵相連接，而非蛋白質(zhì)源氨基酸(已知的有幾百種)通常情況下不會出現(xiàn)在蛋白質(zhì)中(參見Ulmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry，vol.A2，p.57-97VCHWeinheim(1985))。雖然L-氨基酸通常是天然存在蛋白質(zhì)中的唯一類型，但是氨基酸可以是D-或者L-光學(xué)構(gòu)型。20種蛋白質(zhì)源氨基酸中每一種的生物合成或者降解途徑，都在原核細胞或者真核細胞中有各自的特點(例如參見Stryer，L.Biochemistry，3rdedition，pages578-590(1988))?！氨匦琛卑被?組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸)之所以這樣命名，是因為這些氨基酸生物合成復(fù)雜通常是必需的營養(yǎng)條件，它們可以通過簡單的生物合成途徑轉(zhuǎn)化為其余的11種“非必需”氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸)。雖然高等生物確實具有合成一些這種氨基酸的能力，但是為了正常的蛋白質(zhì)合成必須從飲食中補充必需氨基酸。它們除了在蛋白質(zhì)合成中的功能，這些氨基酸就其自身來說是有趣的化學(xué)物質(zhì)，并且它們中的很多在食品、飼料、化學(xué)、化妝品、農(nóng)業(yè)和制藥產(chǎn)業(yè)中具有各種應(yīng)用。賴氨酸在營養(yǎng)方面不僅對于人類是一種重要的氨基酸，而且對于像是家禽和豬這樣單胃動物也是重要的。谷氨酸是最常用的風(fēng)味添加劑(谷氨酸單鈉，MSG)，并且廣泛應(yīng)用于整個食品產(chǎn)業(yè)，如同天冬氨酸、甘氨酸、半胱氨酸一樣。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸全部用于制藥產(chǎn)業(yè)。谷氨酰胺、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、絲氨酸和丙氨酸都應(yīng)用在制藥產(chǎn)業(yè)和化妝品產(chǎn)業(yè)中。蘇氨酸、色氨酸和D/L-甲硫氨酸是常用的飼料添加劑(Leuchtenberger，W.(1996)Aminoaids-technicalproductionanduse，p.466-502inRehmetal.(eds.)BiocemistryVol.6，chapter14a，VCHWeinheim)。另外，這些氨基酸作為合成氨基酸和蛋白質(zhì)合成的前體也是很有用的，例如N-乙酰半胱氨酸，S-羧甲基-L-半胱氨酸，(S)-5-羥色氨酸，以及其他在Ulmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry，vol.A2，p.57-97VCHWeinheim，1985中描述的分子。在能夠產(chǎn)生天然氨基酸的生物體中，例如細菌，這些天然氨基酸的生物合成已經(jīng)了解得很充分(細菌氨基酸的生物合成及其調(diào)節(jié)，參見Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47533-606)。天冬氨酸由α-酮戊二酸還原型氨化合成，后者是檸檬酸循環(huán)的中間體。谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸都是由谷氨酸依次產(chǎn)生的。絲氨酸的生物合成是一個三步的過程，開始于3-磷酸甘油酸(糖酵解的中間體)，經(jīng)過氧化作用、轉(zhuǎn)氨作用、水解作用各步驟之后，終止于該氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸都由絲氨酸產(chǎn)生；前者由高半胱氨酸與絲氨酸縮合而成，后者是把側(cè)鏈β-碳原子轉(zhuǎn)移到四氫葉酸得到的，該反應(yīng)是由絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化的。苯丙氨酸和酪氨酸，由4-磷酸赤蘚糖和磷酸烯醇丙酮酸在一條9步的生物合成途徑中合成，它們是糖酵解途徑和戊糖磷酸途徑的前體，這兩條途徑只是在合成預(yù)苯酸之后不同。色氨酸也可以由這兩種初始分子產(chǎn)生，但是其合成是一個11步的途徑。酪氨酸也可以由苯丙氨酸合成，其反應(yīng)是由苯丙氨酸羥化酶催化的。丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸都是糖酵解終產(chǎn)物丙酮酸的生物合成產(chǎn)物。天冬氨酸由草酰乙酸合成，后者是檸檬酸循環(huán)的中間體。天冬酰胺、甲硫氨酸、蘇氨酸和賴氨酸都由天冬氨酸轉(zhuǎn)化而成。異亮氨酸由蘇氨酸形成。通過一條復(fù)雜的9步的途徑，可以從一種活性糖，5-磷酸核糖-1-焦磷酸，產(chǎn)生組氨酸。超出細胞蛋白質(zhì)合成所需的氨基酸是不能儲存的，而是被降解后為細胞主要代謝途徑提供中間體(評論參見Stryer，L.Biochemistry3rded.Ch.21“AminoAcidDegradationandtheUreaCycle”p.495-516(1988))。盡管細胞能轉(zhuǎn)化多余的氨基酸為有用的代謝中間體，但是產(chǎn)生氨基酸要消耗很多的能量、前體分子和合成所需的酶。因此用反饋抑制來調(diào)節(jié)氨基酸的生物合成是不令人吃驚的，特殊氨基酸的存在可以減慢或者完全停止其自身的產(chǎn)生(對于氨基酸生物合成途徑反饋機制的評論，參見Stryer，L.Biochemistry3rded.Ch.24“BiosynthesisofAminoAcidandHeme”p.575-600(1988))。因此，任何特定氨基酸的產(chǎn)量都被細胞內(nèi)存在的氨基酸數(shù)量所限制。B.維生素、輔因子和營養(yǎng)因子的代謝和用途維生素、輔因子和營養(yǎng)因子包括另一組分子，雖然其他生物，例如細菌，可以合成這些分子，但是高等動物失去了合成它們的能力而只能攝取。這些分子或者其本身是生物活性物質(zhì)，或者是生物活性物質(zhì)的前體，該生物活性物質(zhì)可以是電子載體或者各種代謝途徑的中間體。除了其營養(yǎng)價值，這些化合物作為色素、抗氧化劑和催化劑或者其他加工助劑也有重大的工業(yè)價值。(對于這些化合物結(jié)構(gòu)、活性和工業(yè)應(yīng)用的評述，參見例如，Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry，“Vitamins”vol.A27，p.443-613VCHWeinheim1996.)“維生素”這個詞是本領(lǐng)域熟知的，包含了生物體正常功能所需但是又不能自身合成的營養(yǎng)素。維生素可以包括輔因子和營養(yǎng)因子化合物。術(shù)語“輔因子”包含了進行正常酶活性所需的非蛋白質(zhì)化合物。這些化合物可以是無機的或者有機的；本發(fā)明的輔因子分子優(yōu)選是有機的?！盃I養(yǎng)因子”這個詞包含了對植物和動物，特別是人體有益的飲食增補劑。這些分子的實例是維生素、抗氧化劑和某些脂質(zhì)(例如多飽和脂肪酸)。在能夠產(chǎn)生這些分子的生物體，例如細菌中這些分子的生物合成，大部分已經(jīng)被鑒定(Ullman’sEncyclopediaofIndustrialChemistry，“Vitamins”vol.A27，p.443-613，VCHWeinheim，1996；Michal，G.(1999)BiochemicalPathwaysAnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology，JohnWiley&Sons；Ong，A.S.，Niki，E.&Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health，andDisease”ProceedingsoftheUNESCO/ConfederationofScientificandTechnologicalAssociationsinMalaysia，andtheSocietyforFreeRadicalResearch-Asia，heldSept.1-3，1994atPenang，Malaysia，AOCSPressChampaign，ILX，374S)硫胺素(維生素B1)是由嘧啶和噻唑經(jīng)化學(xué)連接產(chǎn)生的。核黃素(維生素B2)由5’-三磷酸鳥嘌呤核苷和5’-磷酸核糖合成。核黃素依次用于合成黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。合稱為“維生素B6”的一組化合物(例如，吡哆醇、吡哆胺，5’-磷酸吡哆醛，以及商品化的鹽酸吡哆醛)都是共同結(jié)構(gòu)單元5-羥基-6-甲基吡啶的衍生物。泛酸鹽(泛酸，(R)-(+)-N-(2，4-二羥基-3，3-二甲基-1-氧代丁基)-β-丙氨酸)可由化學(xué)合成或者發(fā)酵得到。泛酸鹽生物合成的最后一步包括ATP驅(qū)動的β-丙氨酸和泛解酸的縮合。負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化成泛解酸和β-丙氨酸酶，以及縮合成泛酸鹽的酶都是已知的。泛酸鹽的代謝活性形式是輔酶A，其生物合成過程是5個酶促步驟。泛酸鹽、5’-磷酸吡哆醛、半胱氨酸和ATP是輔酶A的前體。這些酶不僅催化泛酸鹽的形成，也催化(R)-泛解酸、(R)-pantolacton，(R)-泛醇(維生素原B5)泛酰巰基乙胺(及其衍生物)的產(chǎn)生。在微生物中由前體分子庚二酰輔酶A到生物素的生物合成研究得很詳細，并且所涉及的幾個基因已被鑒定。很多相應(yīng)的蛋白質(zhì)也被發(fā)現(xiàn)參與了鐵簇(Fe-cluster)的合成，并且是nifS家族蛋白質(zhì)成員。硫辛酸來自辛酸，在能量代謝中用作輔酶，可以成為丙酮酸脫氫酶復(fù)合物和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的一部分。葉酸鹽是一組葉酸的衍生物，依次來自L-谷氨酸、對氨基苯甲酸和6-甲基蝶呤。起始于代謝中間體5’-三磷酸鳥嘌呤(GTP)、L-谷氨酸和對氨基苯甲酸的葉酸及其衍生物的生物合成，在某些微生物中有詳細的研究。類咕啉(例如鈷胺素，以及特別是維生素B12)和卟啉都屬于以四吡咯環(huán)體系為特征的化學(xué)物質(zhì)。維生素B12的生物合成是這樣的復(fù)雜，以至于還沒有徹底了解其特征，但是許多涉及的酶和底物現(xiàn)在已知。煙酸(煙酸鹽)和煙堿是吡啶底衍生物，也被稱作“尼亞新”。尼亞新是重要輔酶NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)及其還原形式的前體。盡管有些這樣的化合物也可以用大規(guī)模微生物培養(yǎng)生產(chǎn)，例如核黃素、維生素B6、泛酸和生物素，但是大規(guī)模生產(chǎn)這些化合物很大程度還依賴于非細胞化學(xué)體系。只有維生素B12，由于其合成的復(fù)雜性，只能用發(fā)酵生產(chǎn)。體外方法需要相當(dāng)多的物質(zhì)和時間投入，經(jīng)?；ㄙM很大。C.嘌呤、嘧啶、核苷和核苷酸的代謝和用途嘌呤和嘧啶代謝基因及其相應(yīng)的蛋白質(zhì)，是腫瘤疾病治療和病毒感染治療重要的目標(biāo)物。術(shù)語“嘌呤”和“嘧啶”，包含了作為核酸、輔酶和核苷酸組成的含氮堿基。術(shù)語“核苷酸”包含核酸分子基本結(jié)構(gòu)單元，核酸分子由含氮堿基、戊糖(對于RNA，該戊糖是核糖；對于DNA，該戊糖是脫氧核糖)和磷酸組成。術(shù)語“核苷”包含了作為核苷酸前體的分子，但是缺少核苷酸所具有的磷酸部分。通過抑制這些分子的生物合成，或者抑制為合成核酸分子而進行的移動，可能會抑制RNA和DNA的合成；通過定向腫瘤細胞的方式來抑制該活性，腫瘤細胞分裂和復(fù)制的能量可能會得到抑制。另外，有的核苷酸不用于形成核酸，而是用作能量儲存(例如AMP)或者輔酶(例如FAD和NAD)。有些出版物描述了通過影響嘌呤和/或嘧啶的代謝，這些化學(xué)物質(zhì)作為這些醫(yī)學(xué)指征的使用(例如，Christopherson，R.I.andLyons，S.D.(1990)“Potentinhibitorsofdenovopyrimidineandpurinebiosynthesisaschemotherapeuticagents.”Med.Res.Reviews10505-548)。涉及嘌呤和嘧啶代謝酶類的研究，集中在可以使用的新藥開發(fā)上面，例如，作為免疫抑制劑或者抗增生劑(Smith，J.L.，(1995)“Enzymeinnucleotidesynthesis.”Curr.Opin.Struct.Biol.5752-757；(1995)BiochemSoc.Transact.23877-902)。然而，嘌呤和嘧啶堿基，核苷和核苷酸還具有另外的作用作為許多精細化學(xué)物質(zhì)生物合成的中間體(例如，硫胺素、S-腺苷甲硫氨酸、葉酸、或者核黃素)，作為細胞能量載體(例如ATP或者GTP)，而作為化學(xué)物質(zhì)本身，通常用作風(fēng)味增強劑(例如IMP或者GMP)或者幾種醫(yī)學(xué)應(yīng)用(參見，例如，Kuninaka，A.(1996)NucleotidesandRelatedCompoundsinBiotechnologyvol.6，Rehmetal.，eds.VCHWeinheim，，p.561-612)。同樣，涉及嘌呤、嘧啶、核苷或者核苷酸代謝的酶，日漸成為開發(fā)出的用作保護農(nóng)作物的化學(xué)物質(zhì)的作用目標(biāo)，這些化學(xué)物質(zhì)包括殺真菌劑、除草劑和殺蟲劑。細菌中這些化合物的代謝具有特征(評論參見，例如Zalkin，H.andDixon，J.E.(1992)“denovopurinenucleotidebiosynthesis”，inProgressinNucleicAcidResearchandMolecularBiology，vol.42，AcademicPress，p.259-287；andMichal，G.(1999)“NucleotidesandNucleosides”，Chapter8inBiochemicalPathwaysAnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology，WileyNewYork)。嘌呤代謝一直是重點研究課題，而且它是細胞正常功能所必需的。高等動物中受損的嘌呤代謝能夠造成嚴(yán)重的疾病，例如痛風(fēng)。嘌呤核苷酸由5’-磷酸核糖合成，通過一系列步驟，經(jīng)過中間體5’-磷酸次黃嘌呤核苷(IMP)，最終產(chǎn)生5’-單磷酸鳥嘌呤(GMP)和5’-單磷酸腺嘌呤(AMP)，并由它們形成用作核苷酸的三磷酸形式。這些化合物也用作能量儲存，其降解為細胞中各種不同的生化過程提供能量。嘧啶的生物合成，是通過由5’-磷酸核糖形成5’-磷酸尿嘧啶核苷(UMP)。UMP接下來轉(zhuǎn)變成5’-三磷酸胞嘧啶(CTP)。所有這些核苷酸的脫氧形式都是經(jīng)過一步還原反應(yīng)產(chǎn)生的，由核苷酸的二磷酸核糖形式到核苷酸的二磷酸脫氧核糖形式。一經(jīng)磷酸化，這些分子就可以參與DNA的合成了。D.海藻糖的代謝和用途海藻糖包括兩個葡萄糖分子，通過α，α-1，1連接。通常在食品產(chǎn)業(yè)中用作增甜劑、干燥食品或者冷凍食品添加劑，以及飲料當(dāng)中。而且，它也應(yīng)用在制藥、化妝品和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)(參見，例如Nishimotoetal.，(1998)U.S.PatentNo.5,759,610；Singer，M.A.andLindquist，S.(1998)TrendsBiotech.16460-467；Paiva，C.L.A.andPanek，A.D.(1996)Biotech.Ann.Rev.2293-314；andShiosaka，M.(1997)J.Japan17297-102)。很多微生物中的酶可以產(chǎn)生海藻糖，并將其天然釋放到周圍培養(yǎng)基中，可以使用技術(shù)上熟知的方法從中進行收集。II.本發(fā)明的元件和方法本發(fā)明至少部分是建立在發(fā)現(xiàn)新分子的基礎(chǔ)上的，此處將其稱作MP核酸和蛋白質(zhì)分子，它們在一種或多種細胞代謝途徑中起作用或發(fā)揮功能。在一個實施方案中，MP分子催化一種或多種氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝途徑中的酶促反應(yīng)。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的一種或多種谷氨酸棒桿菌氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝途徑中的MP分子活性對用該微生物生產(chǎn)所需精細化學(xué)物質(zhì)有影響。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明MP分子的活性被調(diào)節(jié)，使得本發(fā)明的MP蛋白參與的代謝途徑效率或產(chǎn)量被調(diào)節(jié)，這會直接或間接影響谷氨酸棒桿菌中一種或者多種精細化學(xué)物質(zhì)的生產(chǎn)和生產(chǎn)效率。術(shù)語“MP蛋白”或者“MP多肽”包含了在一種或多種氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝途徑中起作用如催化其中的酶促反應(yīng)的蛋白質(zhì)。MP蛋白的實例包括那些由列在序列表中序列號為奇數(shù)的MP基因編碼的蛋白質(zhì)。術(shù)語“MP基因”或者“MP核酸序列”包含了編碼MP蛋白的核酸序列，后者包含編碼區(qū)域以及相應(yīng)的非翻譯的5’和3’序列區(qū)域。MP基因的實例包括那些列在表1中的基因。術(shù)語“生產(chǎn)”或者“生產(chǎn)力”是本領(lǐng)域熟知的，包含了在給定時間和給定發(fā)酵體積內(nèi)，發(fā)酵產(chǎn)物(例如，所需精細化學(xué)物質(zhì))的濃度(例如，每小時每升千克產(chǎn)物)。術(shù)語“生產(chǎn)效率”包含了，要達到特定的生產(chǎn)水平所需的時間(例如，需要多長時間才能使細胞達到特定的精細化學(xué)物質(zhì))。術(shù)語“收益”“產(chǎn)物/碳收益”是本領(lǐng)域熟知的，包含了把碳源轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物(例如精細化學(xué)物質(zhì))的效率。例如，經(jīng)常寫作千克產(chǎn)物每千克碳源。通過提高化合物的收益或者生產(chǎn)，可增加回收分子的數(shù)量，或者增加在給定時間內(nèi)給定數(shù)量的培養(yǎng)物中該化合物有用回收分子的數(shù)量。術(shù)語“生物合成”或者“生物合成途徑”是本領(lǐng)域熟知的，包含了在細胞中，從中間化合物經(jīng)過可能是多步并且是高度調(diào)控的過程，合成化合物，特別是有機化合物。術(shù)語“降解”或者一條“降解途徑”是本領(lǐng)域熟知的，包含了在細胞中，經(jīng)過可能是多步并且是高度調(diào)控的過程，把化合物，優(yōu)選是有機化合物，分解為降解產(chǎn)物(一般而言，是更小或者復(fù)雜性更小的分子)。術(shù)語“代謝”是本領(lǐng)域熟知的，包含了生物體中所發(fā)生的生化反應(yīng)的全部。因而，特殊化合物的代謝(例如，像是甘氨酸這樣的氨基酸代謝)包括細胞中與該化合物相關(guān)的全部生物合成、修飾和降解途徑。在另一個實施方案中，本發(fā)明的MP分子能夠調(diào)節(jié)微生物中，例如谷氨酸棒桿菌中，所需化合物例如精細化學(xué)物質(zhì)的產(chǎn)生。使用重組遺傳技術(shù)可以操作本發(fā)明的一種或者多種氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖生物合成或降解酶，從而調(diào)節(jié)其活性。例如，可以提高生物合成酶的效率，或破壞其別構(gòu)控制區(qū)從而防止化合物生產(chǎn)的反饋抑制。類似地，降解酶可以通過置換、缺失或增加被缺失或修飾，從而其對所需化合物的降解活性降低，而不影響細胞的活力。在各種情況下，所需精細化學(xué)物質(zhì)的總產(chǎn)量或產(chǎn)率均被提高。本發(fā)明的蛋白質(zhì)和核苷酸分子的改變也可能提高除氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖以外的其它精細化學(xué)物質(zhì)的生產(chǎn)。任一種化合物的代謝必然與細胞內(nèi)其它生物合成和降解途徑關(guān)聯(lián)，一種途徑中的必需輔因子、中間體或底物可能由其它同類途徑供給或受其限制。因此，通過調(diào)整一種或多種本發(fā)明蛋白的活性，另一種精細化學(xué)物質(zhì)生物合成或降解途徑活性的生產(chǎn)或效率可能會受到影響。例如，氨基酸可以作為所有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，但其在細胞內(nèi)的存在的水平可能會限制蛋白合成；因此，通過增加細胞內(nèi)一種或多種氨基酸的生產(chǎn)效率或產(chǎn)率，諸如生物合成或降解蛋白的蛋白可以更容易合成。同樣，代謝途徑酶的改變使得特定副反應(yīng)更有利或不利時，會導(dǎo)致一種或多種用作生產(chǎn)所需精細化學(xué)物質(zhì)的中間體或底物的化合物過量生產(chǎn)或生產(chǎn)不足。本發(fā)明的分離核酸序列，包含在谷氨酸棒桿菌菌株的基因組中，該菌株可由美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，保藏號ATCC13032。分離的谷氨酸棒桿菌MPDNA核酸序列，以及預(yù)測的谷氨酸棒桿菌MP蛋白氨基酸序列，在序列表中分別以奇數(shù)序列號和偶數(shù)序列號列出。進行了計算機分析，并將這些核酸序列分類和/或鑒定為編碼代謝途徑蛋白質(zhì)的序列。本發(fā)明也與這樣的蛋白質(zhì)有關(guān)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列與本發(fā)明的氨基酸序列有充分的同源性(例如，序列表中偶數(shù)序列號的序列)。如此處所用的那樣，具有與挑選出的氨基酸序列有充分同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，與挑選出的氨基酸序列，例如挑選出的氨基酸全序列，有至少大約50％同源性。具有與挑選出的氨基酸序列有很大同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，也可以與挑選出的氨基酸序列有至少大約50-60％，優(yōu)選的有至少大約60％的同源性，更優(yōu)選的有至少大約70％，80％，90％的同源性，最優(yōu)選的有至少大約95％，96％，97％，98％，99％或者更高的同源性。本發(fā)明的MP蛋白或者其生物活性部分或其片段，能夠催化一種或多種氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝途徑中的酶促反應(yīng)，或者具有表1中列出的一種或者多種活性。以下各部分更加詳細地描述了本發(fā)明的各個方面A.分離的核酸分子本發(fā)明的一個方面涉及分離的編碼MP多肽或者其生物活性部分的核酸分子，以及足夠用作雜交探針或者引物的核酸分子片段，這些片段用于鑒定或者擴增編碼MP的核酸(例如MPDNA)。如此處所用的那樣，術(shù)語“核酸分子”的意思是包含DNA分子(例如，cDNA或者基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)，以及由核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或者RNA類似物。該術(shù)語也包括位于基因編碼區(qū)域3’和5’末端的非翻譯序列編碼區(qū)域5’末端上游序列的至少100個核苷酸，和基因編碼區(qū)域3’末端下游序列的至少20個核苷酸。核酸分子可以是單鏈的或者雙鏈的，但是優(yōu)選是雙鏈DNA?！胺蛛x的”核酸分子，是指那些與存在于核酸天然來源中的其他核酸分子相互分離的核酸分子。優(yōu)選，“分離的”核酸不含有天然位于生物體基因組DNA中核酸兩側(cè)的序列(例如，位于核酸5’和3’末端的序列)，核酸就是從該生物體中獲得的。例如，在各種實施方案中，分離的MP核酸分子可以含有少于大約5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb或者0.1kb的核苷酸序列，該序列天然位于細胞基因組DNA核酸分子的兩側(cè)，核酸就是從這些細胞(例如，谷氨酸棒桿菌細胞)中獲得的。另外，“分離的”核酸分子，例如DNA分子，當(dāng)用重組技術(shù)生產(chǎn)時可以基本上不含有其他細胞物質(zhì)或者培養(yǎng)基，當(dāng)化學(xué)合成時可以不含化學(xué)前體或者其他化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明核酸分子，例如序列表中奇數(shù)序列號的核苷酸序列，或者其部分，可以通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和此處提供的序列信息分離得到。例如，谷氨酸棒桿菌MPDNA可以從谷氨酸棒桿菌文庫中，使用序列表中奇數(shù)序列號序列中一個序列的全部或者其部分作為雜交探針，以及標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)(例如，像是描述在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.，andManiatis，T.MolecularCloningALaboratoryManual.2nd，ed.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989中的)分離得到。另外，包含一條本發(fā)明核酸序列(例如，序列表中奇數(shù)序列號的核苷酸序列)全部或者一部分的核酸分子，可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用基于該序列設(shè)計的寡聚核苷酸引物，分離得到(例如，包含一條本發(fā)明核酸序列(例如，序列表中奇數(shù)序列號的核苷酸序列)全部或者一部分的核酸分子，可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用基于該相同序列設(shè)計的寡聚核苷酸引物，分離得到)。例如，mRNA可以從正常內(nèi)皮細胞分離得到(例如，使用Chirgwinetal.(1979)Biochemistry185294-5299中的硫氰酸胍提取方法)，DNA可以通過逆轉(zhuǎn)錄酶(例如，Gibco/BRL，Bethesda，MD提供的MoloneyMLV逆轉(zhuǎn)錄酶；或者SeikagakuAmerica，Inc.，St.Peterburg，F(xiàn)L提供的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶)制備。為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成的寡聚核苷酸引物，可以基于序列表中列出的一條核苷酸序列設(shè)計。本發(fā)明的核酸，可以使用cDNA或者作為另一種選擇的基因組DNA作模板，合適的寡聚核苷酸引物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增技術(shù)來擴增。這樣擴增出的核酸，可以克隆到合適的載體中，并用DNA序列分析辨別其特征。另外，與MP核苷酸序列相對應(yīng)的寡聚核苷酸，可以用標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)準(zhǔn)備，例如使用自動DNA合成儀。在一個優(yōu)選的實施方案中，分離的本發(fā)明核酸分子包含序列表中列出的一條核苷酸序列。本發(fā)明的核酸序列，正如在序列表中列出的那些，與本發(fā)明的谷氨酸棒桿菌MPDNA是一致的。這些DNA包含編碼MP蛋白的序列(即“編碼區(qū)域”，顯示在每條序列表中奇數(shù)序列號序列中)，以及5’非編碼序列和3’非編碼序列，也顯示在每條序列表中奇數(shù)序列號序列中。作為另一種選擇，核酸分子可以只包含序列表中核酸序列的編碼區(qū)域。為了該申請的目的，可以理解序列表中列出的每條核酸和氨基酸序列，都有一個用于識別的RXA，RXN，RXS或者RXC編號，“RXA”，“RXN”，“RXS”，或者“RXC”后面有5個數(shù)字(即，RXA00007，RXN00023，RXS00116，或者RXC00128)。每條核酸序列最多包含三部分5’上游區(qū)域，編碼區(qū)域，下游區(qū)域。三個區(qū)域的每個部分，都用相同的RXA，RXN，RXS，或者RXC名稱確定以消除混淆。于是敘述“序列表中的一條奇數(shù)編碼的序列”，是指序列表中的任何核酸序列，這些序列也可以用它們不同的RXA，RXN，RXS，或者RXC名稱相互區(qū)分。每條這種序列的編碼區(qū)域都被翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列，這些序列也列在序列表中，為緊隨相應(yīng)核酸序列之后偶數(shù)序列號。例如，RXA02229的編碼區(qū)域列在SEQIDNO1，而它編碼的氨基酸序列列在SEQIDNO2。本發(fā)明的核酸分子序列，與其編碼的氨基酸分子，用相同的RXA，RXN，RXS，或者RXC名稱表示，使得它們?nèi)菀紫嗷ヂ?lián)系。例如，稱為RXA02229，RX00351，RXS02970和RXC02390的氨基酸序列，分別是RXA02229，RX00351，RXS02970和RXC02390核酸分子核苷酸序列編碼區(qū)域的翻譯。本發(fā)明RXA，RXN，RXS和RXC核苷酸和氨基酸序列之間的對應(yīng)，以及它們被指定的序列號列在表1中。本發(fā)明的幾個基因是“F-標(biāo)明的基因”。F-標(biāo)明的基因包括那些列在表1中并在RXA，RXN，RXS，或者RXC標(biāo)明前有“F”的基因。例如，SEQIDNO5，像在表1中表示的那樣，被指定為“FRXA01009”，就是一個F-標(biāo)明的基因，同樣的還有SEQIDNO73、75和77(表1中分別標(biāo)明為“FRXA00007”、FRXA00364”和“FRXA00367”)。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子不包含匯編在表2中的那些谷氨酸棒桿菌分子。對于dapD基因，該基因的序列發(fā)表在Wehrmann，A.，etal.(1998)J.Bacteriol.180(12)3159-3165。然而，本申請發(fā)明者所得到的比發(fā)表的版本長很多。據(jù)說，發(fā)表的版本使用了錯誤的其實密碼子，并因此只表現(xiàn)了真實編碼區(qū)域的一部分。在另一個優(yōu)選的實施方案中，分離的本發(fā)明的核酸分子，包含那些是本發(fā)明核苷酸序列(例如，序列表中奇數(shù)序列號序列)或者其部分的互補分子的核酸分子。與本發(fā)明一條核苷酸序列互補的核酸分子，是指該分子與序列表中列出的一條核苷酸序列(例如，奇數(shù)序列號序列)充分互補，因此它可以與本發(fā)明的一條核苷酸序列雜交，從而形成穩(wěn)定的雙螺旋。同樣在另一個優(yōu)選的實施方案中，分離的本發(fā)明的核酸分子，包含這樣的核苷酸序列，該序列與本發(fā)明的核苷酸序列(例如，序列表中奇數(shù)序列號序列)或者其部分，有至少大約50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％或者60％的同源性，優(yōu)選的有至少大約61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或者70％的同源性，更優(yōu)選的有至少大約71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或者80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，88％，89％或者90％，或者91％，92％，93％，94％，以及甚至更優(yōu)選的有至少大約95％，96％，97％，98％，99％或者更高的同源性。以上引用范圍(例如，70-90％一致性或者80-95％一致性)中間的范圍和一致性值，也包含在本發(fā)明中。例如，包含了這樣的一致性值范圍，這些范圍是上面引用的上限和/或下限值的組合。在另一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明分離的核酸分子包括這樣的核苷酸序列，該序列可以與本發(fā)明的一條核苷酸序列或者其部分進行雜交，例如，在嚴(yán)格條件下雜交。另外，本發(fā)明核酸分子可能只包含序列表中奇數(shù)序列號序列編碼區(qū)域的一部分，例如，可以用作探針或者引物的片段，或者編碼MP蛋白生物活性部分的片段。由谷氨酸棒桿菌MP基因克隆出的核苷酸序列，容許產(chǎn)生探針和引物，這些探針和引物的設(shè)計是用于鑒定和/或克隆其他細胞類型或者其他生物體中的MP同系物，以及其他棒桿菌或者親緣物種中的MP同系物。探針/引物典型的包括相當(dāng)純化的寡聚核苷酸。寡聚核苷酸典型的包括這樣一段核苷酸序列的區(qū)域，該區(qū)域在嚴(yán)格雜交條件下，與本發(fā)明核苷酸序列(例如，序列表中奇數(shù)序列號序列)的有義鏈，這些序列的反義序列，或者其天然存在的突變體的至少大約12個，優(yōu)選的大約25個，更優(yōu)選的大約40，50，或者75個連續(xù)核苷酸雜交?；诒景l(fā)明核苷酸序列的引物，可以用于克隆MP同系物的PCR反應(yīng)?；贛P核苷酸序列的探針，可以用于探測相同的或者同源蛋白的轉(zhuǎn)錄或者基因組序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，探針更是包括另外的附著標(biāo)記基團，例如標(biāo)記基團可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或者酶的輔因子。這種探針可以用作診斷檢測試劑盒的一部分，該試劑盒用于鑒定錯誤表達MP蛋白的細胞，像是通過測定樣本細胞中MP編碼核酸的水平，例如，檢測MPmRNA的水平，或者測定基因組MP基因是否發(fā)生了突變或者缺失。在一個實施方案中，本發(fā)明核酸分子編碼一種蛋白質(zhì)或者其部分，該蛋白質(zhì)或者其部分的氨基酸序列與本發(fā)明的氨基酸序列(例如，序列表中偶數(shù)序列號序列)有充分的同源性，從而使得該蛋白質(zhì)或者其部分可以催化氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝途徑中的酶促反應(yīng)。如此處所用的那樣，術(shù)語“充分的同源性”是指蛋白質(zhì)或者其部分的氨基酸序列，含有最小數(shù)目的與本發(fā)明氨基酸序列一致的或者等價的(例如，具有與序列表偶數(shù)序列號序列中的氨基酸殘基相似側(cè)鏈的氨基酸殘基)氨基酸殘基，從而使得該蛋白質(zhì)或者其部分，能夠催化谷氨酸棒桿菌中氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝途徑中的酶促反應(yīng)。這種代謝途徑蛋白質(zhì)成員，像這里描述的那樣，其功能是催化一種或多種氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖的生物合成或降解。這里也描述了這種活性的實例。因而，“MP蛋白的功能”對于一種或多種這種代謝途徑有作用，和/或直接或者間接影響一種或者多種精細化學(xué)物質(zhì)的產(chǎn)量、生產(chǎn)和/或生產(chǎn)效率。MP蛋白活性的實例在表1中列出。在另一個實施方案中，蛋白質(zhì)與本發(fā)明的全部氨基酸序列有至少大約50-60％的同源性，優(yōu)選的有至少大約60-70％的同源性，更優(yōu)選的有至少大約70-80％，80-90％，90-95％的同源性，最優(yōu)選的有至少大約96％，97％，98％，99％或者更高的同源性(例如，序列表中偶數(shù)序列號序列)。本發(fā)明MP核酸分子編碼蛋白質(zhì)的部分，優(yōu)選是MP蛋白的生物活性部分。如此處所用的那樣，術(shù)語“MP蛋白的生物活性部分”的意思是包含MP蛋白這樣的部分，例如結(jié)構(gòu)域/基元，該部分能夠催化谷氨酸棒桿菌中一種或多種氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝途徑中的酶促反應(yīng)或具有表1中所列活性?？梢赃M行一種酶活性分析，以確定MP蛋白或者其生物活性部分是否可以催化氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝途徑中的酶促反應(yīng)。這種分析方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，在范例的實例8中有詳細的描述。編碼MP蛋白生物活性部分的額外的核酸片段，可以通過以下方法制備，分離本發(fā)明氨基酸序列(例如，序列表中偶數(shù)序列號序列)的一部分，表達MP蛋白或者多肽的編碼部分(例如，通過體外重組表達)，并且估算MP蛋白或者多肽編碼部分的活性。因為遺傳密碼子的簡并性，以及由此可以編碼得到和本發(fā)明核苷酸序列編碼蛋白質(zhì)相同的MP蛋白，所以本發(fā)明進一步包含不同于本發(fā)明核苷酸序列(例如，序列表中奇數(shù)序列號序列)(和其部分)的核酸分子。在另一個實施方案中，分離的本發(fā)明的核酸分子具有這樣的核苷酸序列，該序列編碼具有序列表中列出的氨基酸序列(例如，偶數(shù)序列號)的蛋白質(zhì)。同樣在另一個實施方案中，本發(fā)明核酸分子編碼全長的谷氨酸棒桿菌蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與本發(fā)明的氨基酸序列(由序列表中奇數(shù)序列號開放閱讀框架編碼)有充分的同源性。在一個實施方案中，本發(fā)明的序列并不意味著包括以前技術(shù)上已知的序列，例如那些列在表2或者表4中的在本發(fā)明以前就有效的Genbank序列，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是可以理解的。在一個實施方案中，本發(fā)明包含這樣的核苷酸序列和氨基酸序列，該序列與本發(fā)明的核苷酸序列和氨基酸序列有一定百分比的一致性，該百分比大于技術(shù)上已知的序列(例如，表2或者表4中列出的Genbank序列(或者該序列編碼的蛋白質(zhì)))與本發(fā)明的核苷酸序列和氨基酸序列一致性的百分比。例如，本發(fā)明包含與標(biāo)明為RXA00115(SEQIDNO185)的核苷酸序列有大于和/或至少40％一致性的核苷酸序列，與標(biāo)明為RXA00131(SEQIDNO991)的核苷酸序列有大于和/或至少％一致性的核苷酸序列，以及與標(biāo)明為RXA00219(SEQIDNO345)的核苷酸序列有大于和/或至少39％一致性的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員，通過檢查表4中列出的對于每個特定序列給出的3個最高符合的GPA-計算百分比一致性，以及經(jīng)過從百分之一百中減去最高的GPA-計算百分比一致性，可以計算任何本發(fā)明特定序列百分比一致性的低端域值。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以意識到，其百分比一致性大于如此計算出的低端域值(例如，至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％或者60％，優(yōu)選的至少大約61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或者70％，更優(yōu)選的至少大約71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或者80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，88％，89％或者90％，或者91％，92％，93％，94％，以及甚至更優(yōu)選的至少大約95％，96％，97％，98％，99％或者更高的一致性)的核酸和氨基酸序列，也是包含在本發(fā)明中的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以意識到，除了在序列表中以奇數(shù)序列號列出的谷氨酸棒桿菌MP核苷酸序列之外，導(dǎo)致MP蛋白氨基酸序列改變的DNA多態(tài)性可以在一定群體(例如谷氨酸棒桿菌群體)中存在。這種MP基因的遺傳多態(tài)性，可以由于自然條件的變異而在一個群體的不同個體中存在。如此處所用的那樣，術(shù)語“基因”和“重組基因”是指含有編碼MP蛋白的開放閱讀框架的核酸分子，優(yōu)選的MP蛋白是谷氨酸棒桿菌MP蛋白。這種自然條件的變異典型的可以造成MP基因核苷酸序列1-5％的變化。任何以及全部由于自然條件的變異造成的，并且不改變MP蛋白功能活性的，這種核苷酸的變化，以及引起的MP氨基酸的多態(tài)性，都屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。相應(yīng)天然變體的核酸分子，和本發(fā)明谷氨酸棒桿菌MPDNA的非谷氨酸棒桿菌同源物，可以基于此處公開的它們與谷氨酸棒桿菌MP核酸分子的同源性，使用谷氨酸棒桿菌DNA或者其部分作為雜交探針，在嚴(yán)格雜交條件下根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)分離得到。因此，在另一個實施方案中，分離的本發(fā)明核酸分子的長度至少有15個核苷酸，在嚴(yán)格條件下與含有序列表奇數(shù)序列號核苷酸序列的核酸分子雜交。在其他實施方案中，核酸分子的長度至少有30，50，100，250或者更多個核苷酸。如此處所用的那樣，術(shù)語“在嚴(yán)格條件下雜交”的意思是描述這樣的雜交和清洗的條件，在該條件下彼此之間有至少60％同源性的核苷酸序列相互之間保持典型的雜交。優(yōu)選，這種條件是序列之間有至少大約65％，更優(yōu)選的有至少大約70％，以及甚至更優(yōu)選的有至少大約75或者更高的同源性，相互之間保持典型的雜交。這種嚴(yán)格條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，可以在Ausubeletal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。一種優(yōu)選的但不是限制的嚴(yán)格雜交條件是，在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中大約45℃進行雜交，然后用0.2XSSC，0.1％SDS在50-65℃清洗一次或者多次。優(yōu)選，分離的本發(fā)明的核酸分子，在嚴(yán)格雜交條件下與本發(fā)明的核苷酸序列雜交，相當(dāng)于得到天然存在的核酸分子。如此處所用的那樣，“天然存在的”核酸分子是指具有自然中存在的核苷酸序列(例如，編碼天然蛋白質(zhì))的RNA或者DNA分子。在一個實施方案中，核酸編碼天然谷氨酸棒桿菌MP蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進一步意識到，除了群體中存在的天然存在的MP序列變體以外，可以通過突變把改變引入本發(fā)明核苷酸序列中，從而導(dǎo)致被編碼MP蛋白的氨基酸序列的改變，而不改變MP蛋白的功能。例如，可以在本發(fā)明核苷酸序列中，進行可以導(dǎo)致“非必需”氨基酸殘基的氨基酸取代的核苷酸取代?！胺潜匦琛卑被釟埢侵高@樣的殘基，該殘基可以在MP蛋白的野生型序列(例如，序列表中偶數(shù)序列號序列)中發(fā)生改變，而不改變MP蛋白的活性，而“必需”氨基酸殘基是MP蛋白活性所必需的。然而，其他氨基酸殘基(例如，那些在MP活性結(jié)構(gòu)域中非保守的或者只是半保守的氨基酸殘基)可能對于活性不是必需的，因此也可以在不改變MP活性的情況下被改變。因此，本發(fā)明的另一個方面涉及編碼這樣的MP蛋白的核酸分子的，該MP蛋白含有對MP活性非必需的氨基酸殘基的變化。這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列不同于序列表中偶數(shù)序列號序列，但仍然保持至少一種此處描述的MP活性。在一個實施方案中，分離的核酸分子包含一段編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中該蛋白質(zhì)的氨基酸序列與本發(fā)明的氨基酸序列有至少大約50％的同源性，并且能夠催化氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝途徑中的酶促反應(yīng)，或者具有表1中列出的一種或者多種活性。優(yōu)選，核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與序列表中奇數(shù)序列號氨基酸序列，有至少大約50-60％的同源性，更優(yōu)選的與這種序列有至少大約60-70％的同源性，甚至更優(yōu)選的與這種序列有至少大約70-80％，80-90％，90-95％的同源性，最優(yōu)選的與本發(fā)明的氨基酸序列有至少大約96％，97％，98％，或者99％的同源性。為了確定兩種氨基酸序列(例如，本發(fā)明的一種氨基酸序列與其突變體形式)或者兩種核酸序列的同源性百分比，出于最適宜比較的目的，對序列進行序列對比(例如，為了與其他蛋白質(zhì)或者核酸進行最適宜的序列對比，可以在一種蛋白質(zhì)或者核酸的序列中引入間隙)。然后比較相應(yīng)氨基酸位置的氨基酸殘基或者核酸位置的核苷酸。當(dāng)一條序列(例如，本發(fā)明的一條氨基酸序列)中的一個位置被與其他序列(例如，氨基酸序列的突變體形式)相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或者核苷酸占據(jù)時，該分子在這個位置是同源的(即，如此處所用的氨基酸或者核酸“同源性”與氨基酸或者核酸的“一致性”是相同的)。兩條序列之間的百分比同源性，是一個相同位置數(shù)目被序列均分的函數(shù)(即，％一致性＝相同位置的#/全部位置的#x100)。分離的與本發(fā)明蛋白質(zhì)序列(例如，序列表中偶數(shù)序列號序列)同源的編碼MP蛋白質(zhì)的核酸分子，可以通過向本發(fā)明核苷酸序列中引入一個或者多個核苷酸取代、插入、缺失而產(chǎn)生，從而在編碼蛋白質(zhì)中引入一個或者多個氨基酸取代、插入、缺失?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，在本發(fā)明核苷酸序列中引入突變。優(yōu)選，保守的氨基酸取代是在一個或者多個預(yù)期的非必需氨基酸殘基進行的?！氨Ｊ氐陌被崛〈笔侵赴被釟埢痪哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基所取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族，在技術(shù)上有規(guī)定。這些家族包括，具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有無電荷極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β-支鏈側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)，以及具有芳香組側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，預(yù)期的MP蛋白中的非必需氨基酸殘基，優(yōu)選的被同一側(cè)鏈家族中的其他氨基酸取代。另外，在另一個實施方案中，可以在MP編碼序列全長或者部分，隨機的引入突變，例如通過飽和誘變，根據(jù)此處描述的鑒定具有MP活性突變體的MP活性，篩選出得到的突變體。在一條序列表中奇數(shù)序列號核苷酸序列誘變之后，被編碼蛋白質(zhì)可以重組表達，蛋白質(zhì)活性也可以，例如使用此處描述的分析(參見范例的實例8)，得到確定。除了以上描述的編碼MP蛋白質(zhì)的核酸分子以外，本發(fā)明的另一方面還與分離的反義核酸分子有關(guān)?！胺戳x”核酸包括與編碼蛋白質(zhì)的“有義”核酸互補的核苷酸序列，例如與雙鏈DNA分子編碼鏈互補，或者與mRNA序列互補。因此，反義核酸可以通過氫鍵與有義核酸連接。反義核酸可以與全部MP編碼鏈互補，也可以僅與其部分互補。在一個實施方案中，反義核酸分子，與編碼MP蛋白的核苷酸序列編碼鏈的“編碼區(qū)域”反義。術(shù)語“編碼區(qū)域”是指包含翻譯成氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區(qū)域(例如，SEQIDNO.1(RAX02229)的全部編碼區(qū)域包括1至825核苷酸)。在另一個實施方案中，反義核酸分子，與編碼MP的核苷酸序列編碼鏈的反義。術(shù)語“非編碼區(qū)域”是指編碼區(qū)域兩側(cè)不翻譯成氨基酸的5’和3’序列(即5’和3’非翻譯區(qū)域)?？紤]到此處公布的編碼MP的編碼鏈序列(例如，序列表中列出的奇數(shù)序列號序列)，本發(fā)明反義核酸可以根據(jù)Watson和Crick的堿基配對規(guī)則進行設(shè)計。反義核酸分子可以與MPmRNA的全部編碼區(qū)域互補，但是更優(yōu)選是這樣的寡聚核苷酸，該寡聚核苷酸僅與MPmRNA的編碼區(qū)域或者非編碼區(qū)域的部分是反義的。例如，反義寡聚核苷酸可以與MPmRNA翻譯起始位置附近的區(qū)域互補。例如，反義寡聚核苷酸的長度可以是5，10，15，20，25，30，35，40，45或者50個核苷酸。本發(fā)明的反義核酸分子，可以使用技術(shù)上已知的程序，通過化學(xué)合成或者酶促連接反應(yīng)構(gòu)建?？梢允褂锰烊淮嬖诘暮塑账峄蛘吒鞣N經(jīng)過修飾的核苷酸，化學(xué)合成反義核酸(例如反義寡聚核苷酸)，那些經(jīng)過修飾的核苷酸，是為了增加分子的生物穩(wěn)定性，或者為了增加反義核酸與有義核酸之間形成雙螺旋的物理穩(wěn)定性而設(shè)計的，例如可以使用硫代磷酸衍生物和吖啶取代的核苷酸?？捎糜诋a(chǎn)生反義核酸的經(jīng)修飾的核苷酸的實例包括，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，beta-D-半乳糖基肌苷，N6-異戊基腺嘌呤，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鳥嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基尿嘧啶-2-硫代尿嘧啶，beta-D-甘露糖基queosine，5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代-N6-異戊基腺嘌呤，尿嘧啶-5-含氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫代胞嘧啶，5-甲基-2-硫代尿嘧啶，2-硫代尿嘧啶，4-硫代尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-含氧乙酸甲酯，尿嘧啶-5-含氧乙酸(v)，5-甲基-2-硫代尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w，以及2，6-二氨基嘌呤。另外，反義核酸可以使用表達載體生物合成，其中核酸被反義方向亞克隆到表達載體中(即，由插入核酸轉(zhuǎn)錄的RNA，相對于插入的目的核酸是反義方向的，以下部分有進一步敘述)。本發(fā)明的反義核酸分子，被典型的施用于細胞或者在原位產(chǎn)生，從而它們可以與編碼MP蛋白的細胞mRNA和/或基因組DNA雜交或者結(jié)合，進而抑制蛋白質(zhì)的表達，例如，抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。雜交可以通過常規(guī)核苷酸互補性而形成穩(wěn)定的雙螺旋，或者，例如，當(dāng)反義核酸分子結(jié)合DNA雙螺旋時，它與雙螺旋的大溝發(fā)生特殊相互作用。反義分子可以被修飾，從而使得該分子可以與受體或者與特定細胞表面表達的抗原特異性結(jié)合，例如，反義核酸分子與多肽或者抗體的結(jié)合，該抗體與細胞表面受體或者抗原結(jié)合。反義核酸分子也可以使用此處描述的載體遞送至細胞。為了得到細胞內(nèi)足夠濃度的反義分子，這樣的載體是優(yōu)選，即在該載體中，反義核酸分子被置于原核、病毒或者真核啟動子的控制之下。而在另一個實施方案中，本發(fā)明的反義核酸分子是一種α-異頭物核酸分子。α-異頭物核酸分子與互補的RNA形成特異的雙鏈雜交體，雜交體中兩股鏈走向彼此平行，這與通常的β-單元相反(Gaultieretal.(1987)NucleicAcids.Res.156625-6641)。反義核酸分子也可以包含2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoueetal.(1987)NucleicAcids.Res.156131-3148)或者化學(xué)RNA-DNA類似物(Inoueetal.(1987)FEBSLett.215327-330)。而在另一個實施方案中，本發(fā)明的反義核酸分子是核酶。核酶是催化型RNA分子，具有核糖核酸酶活性，能夠切割單鏈核酸，例如mRNA，它具有與單鏈核酸互補的區(qū)域。因此，核酶(例如，錘頭核酶(描述于HaselhoffandGerlach(1988)Nature334585-591))可以用于催化切割MPmRNA轉(zhuǎn)錄物，從而抑制MPmRNA的翻譯。對于MP編碼核酸分子有特異性的核酶，可以基于此處公布的MPDNA核苷酸序列(即SEQIDNO1(RAX02229))來設(shè)計。例如，可以構(gòu)建四膜蟲屬L-19IVSRNA的衍生物，其活性位點的核苷酸序列與被切割的MP-編碼mRNA的核苷酸序列是互補的。參見，例如，Cechetal.U.S.PatentNo.4,987,071和Cechetal.U.S.PatentNo.5,116,742。另外，MPmRNA可以用于RNA分子庫中篩選具有特異核酶活性的催化型RNA。參見，例如，Bartel，D.andSzostak，J.W.(1993)Science2611411-1418。另外，通過把與MP核苷酸序列調(diào)節(jié)區(qū)域(例如，MP啟動子和/或增強子)互補的核苷酸序列作為目標(biāo)，形成三螺旋結(jié)構(gòu)，可以抑制MP基因的表達，該三螺旋結(jié)構(gòu)可以阻止MP基因在目的細胞中的轉(zhuǎn)錄。一般參見，Helene，C.(1991)AnticancerDrugDes.6(6)569-84；Helene，C.etal.(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；andMaher，L.J.(1992)Bioassays14(12)807-15。B.重組表達載體和宿主細胞本發(fā)明的另一方面涉及載體的，優(yōu)選是含有編碼MP蛋白(或者其部分)核酸的表達載體。如此處所用的那樣，術(shù)語“載體”是指能夠連接其他核酸，并對其進行運輸?shù)暮怂岱肿印Ｒ环N類型的載體是“質(zhì)?！保|(zhì)粒是指環(huán)形雙鏈DNA環(huán)，其中連接有額外的DNA片段。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA片段可以連接到病毒基因組中。某些載體可以在它們被引入的宿主細胞中進行自主復(fù)制(例如，具有細菌復(fù)制起點的細菌載體，以及附加型哺乳動物載體)。其他的載體(例如，非附加型哺乳動物載體)一經(jīng)引入宿主細胞就會整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一同復(fù)制。另外，某些載體能夠指導(dǎo)與之相連接的基因的表達。這些載體此處稱作“表達載體”?？傊亟MDNA技術(shù)使用的表達載體經(jīng)常是質(zhì)粒形式。在本說明中，“質(zhì)粒”和“載體”可以交換使用，因為質(zhì)粒是最常使用的載體形式。然而，本發(fā)明有意包括這些表達載體的其他形式，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和腺伴隨病毒)，它們具有相同的功能。本發(fā)明重組表達載體包括本發(fā)明的核酸，該核酸在宿主細胞中以適合核酸表達的形式存在，這就意味著重組表達載體含有一條或者多條調(diào)節(jié)序列，這些序列是基于用作表達的宿主細胞選出的，它們被可行的連接到要表達的核酸序列上。在重組表達載體中，“可行的連接”的意思是指，感興趣核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許核苷酸序列表達的方式進行連接(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或者在載體被引入的宿主細胞中)。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”的意思是包括啟動子、增強子和其他表達控制元素(例如，聚腺苷酸化信號)。這種調(diào)節(jié)序列在，例如，Goeddel；GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)中有描述。調(diào)節(jié)序列包括，那些在很多類型宿主細胞中，指導(dǎo)核苷酸序列組成型表達的序列，以及那些在某些宿主細胞中，指導(dǎo)核苷酸序列表達的序列。優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列是，例如，像是cos-，tac-，trp-，tet-，trp-tet-，lpp-，lac-，lpp-lac-，lacIq-，T7-，T5-，T3-，gal-，trc-，ara-，SP6-，amy-，SPO2-，λ-PR-或者λPL這樣的啟動子，這些啟動子優(yōu)選的使用在細菌中。另外的調(diào)節(jié)序列是，例如，酵母和真菌的啟動子，例如ADC1，MFα，AC，P-60，CYC1，GAPDH，TEF，rp28，ADH，植物的啟動子，例如，CaMV/35S，SSU，OCS，lib4，usp，STLS1，B33，nos或者ubiquitin-或phaseolin-啟動子。也可以使用人造啟動子。這些對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是可以意識到的，即表達載體的設(shè)計依賴于這些因素用于轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇，所需蛋白質(zhì)的表達水平等。本發(fā)明的表達載體可以引入宿主細胞，從而產(chǎn)生此處描述的核酸所編碼的蛋白質(zhì)或者多肽，包括融合蛋白質(zhì)或者多肽(例如，MP蛋白、MP蛋白的突變形式、融合蛋白質(zhì)等)?？梢栽O(shè)計本發(fā)明的重組表達載體，用于在原核或者真核細胞中表達MP蛋白。例如，MP基因可以在以下細胞中表達，像是谷氨酸棒桿菌這樣的細菌細胞，昆蟲細胞(使用桿狀病毒表達載體)，酵母和其他真菌細胞(參見Romanos，M.A.etal.(1992)“Foreigngeneexpressioninyeastareview”，Yeast8423-488；vandenHondel，C.A.M.J.J.etal.(1991)“Heterologousgeneexpressioninfilamentousfungi”inMoreGeneManipulationsinFungi，J.W.Bennet&L.L.Lasure，eds.，p.396-428AcademicPressSanDiego；andvandenHondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)“Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi，inAppliedMolecularGeneticsofFungi，Peberdy，J.F.etal.，eds.，p.1-28，CambridgeUniversityPressCambridge)藻類或者多細胞植物細胞(參見Schmidt，R.andWillmitzer，L.(1998)HighefficiencyAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofArabidopsisthalianaleafandcotyledonexplants”PlantCellRep.583-586)，或者哺乳動物細胞。適當(dāng)?shù)乃拗骷毎贕oeddel，GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)中有進一步論述。另外，重組表達載體可以在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如使用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。原核細胞中的蛋白質(zhì)表達，經(jīng)常是由含有組成型或者誘導(dǎo)型啟動子的載體進行的，這些啟動子指導(dǎo)融合蛋白質(zhì)或者非融合蛋白質(zhì)的表達。融合載體在編碼蛋白質(zhì)上添加一定數(shù)目的氨基酸，通常是在重組蛋白質(zhì)的氨基末端，但也可以在C末端，或與蛋白中的合適區(qū)域融合。這種融合載體具有3個典型用途1)增加重組蛋白質(zhì)的表達；2)增加重組蛋白質(zhì)的溶解性；和3)用作親和純化的配基，幫助融合蛋白純化。在融合表達載體中，蛋白質(zhì)切割位點經(jīng)常是被引入到融合部分與重組蛋白質(zhì)的結(jié)合處，使得在純化出融合蛋白質(zhì)之后，能夠把重組蛋白質(zhì)與融合部分分離開。這種酶，以及它們的同源識別序列，包括Xa因子、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達載體包括pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smith，D.B.andJohnson，K.S.(1988)Gene6731-40)，pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它們分別與目標(biāo)重組蛋白融合了谷光甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，麥芽糖E結(jié)合蛋白，或者蛋白質(zhì)A。在一個實施方案中，MP蛋白編碼序列被克隆到pGEX表達載體中，產(chǎn)生一個編碼融合蛋白的載體，該載體從N-末端到C-末端包括，GST-凝血酶切割位點-X蛋白質(zhì)。融合蛋白可以使用谷光甘肽-瓊脂糖樹脂，通過親和層析純化。與GST分離開的重組MP蛋白，可以通過用凝血酶切割融合蛋白質(zhì)得到。合適的大腸桿菌誘導(dǎo)型非融合表達載體的實例包括，pTrc(Amannetal.，(1988)Gene69301-315)，pLG338，pACYC184，pBR322，pUC18，pUC19，pKC30，pRep4，pSH1，pSH2，pPLc236，pMBL24，pLG200，pUR290，pIN-III113-B1，λgt11，pBdC1，和pET11d(Studieretal.，GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185，AcademicPress，SanDiego，California(1990)60-89；andPouwelsetal.，eds.(1985)CloningVectors.ElsevierNewYorkIBSN0444904018)。pTrc載體的目標(biāo)基因表達，依賴于雜交trp-lac融合啟動子的宿主RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄。pET11d載體的目標(biāo)基因表達，依賴于共表達的病毒RNA聚合酶(T7gn1)介導(dǎo)的T7gn10-lac融合啟動子的轉(zhuǎn)錄。該病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或者HMS174(DE3)中駐留的λ噬菌體提供，該噬菌體含有在lacUV5啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的T7gn1基因。對于其他種類細菌的轉(zhuǎn)化，可以選擇合適的載體。例如，已知質(zhì)粒pIJ101，pIJ364，pIJ702和pIJ361轉(zhuǎn)化鏈霉菌是有效的，而質(zhì)粒pUB110，pC194，或者pBD214適合轉(zhuǎn)化桿狀菌種。有助于把遺傳信息轉(zhuǎn)入棒狀桿菌的幾種質(zhì)粒包括pHM1519，pBL1，pSA77或者pAJ667(Pouwelsetal.，eds.(1985)CloningVectors，ElsevierNewYorkIBSN0444904018)。一種最大限度增大重組蛋白表達的方案是，在宿主細胞中表達這樣的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有不會減弱的蛋白酶剪切重組蛋白質(zhì)的能力(Gottesman，S.，GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185，AcademicPress，SanDiego，California(1990)119-128)。另一種方案是改變插入表達載體中核酸的核酸序列，使得每個氨基酸的密碼子都是所選用于表達的細菌優(yōu)先使用的，例如谷氨酸棒桿菌(Wadaetal.(1992)NucleicAcidsRes.202111-2118)。本發(fā)明核酸序列的這種改變，是可以通過標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)進行的。在另一個實施方案中，MP蛋白表達載體是酵母表達載體。酵母S.cerivisae用于表達的載體的實例包括，pYepSec1(Baldari，etal.，(1987)EmboJ.6229-234)，2μ，pAG-1，Yep6，Yep13，pEMBKYe23，pMFa(KurjanandHerskowitz，(1982)Cell30933-943)，pJRY88(Schultzetal.，(1987)Gene54113-123)，和pYES2(InvitrogenCorporation，SanDiego，CA)。用于構(gòu)建適合在其他真菌中，例如絲狀真菌中，使用的載體的載體和方法，包括那些詳述于下列文獻中的vandenHondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)“Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi，inAppliedMolecularGeneticsofFungi，J.F.Peberdy，etal.，eds.，p.1-28，CambridgeUniversityPressCambridge，andPouwelsetal.，eds.(1985)CloningVectors，ElsevierNewYorkIBSN0444904018)。另外，本發(fā)明MP蛋白可以使用桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞中表達。在培養(yǎng)的昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中，用于表達蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括，pAC系列(Smithetal.(1983)Mol.CellBiol.32156-2165)和pVL系列(LucklowandSummer(1989)Virology17031-39)。在另一個實施方案中，本發(fā)明MP蛋白可以在單細胞植物細胞(例如藻類)中表達，或者在高等植物(例如種子植物，像是作物植物)的植物細胞中表達。植物表達載體的實例包括那些詳述于下列文獻中的Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.andMasterson，R.(1992)″Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder″，PlantMol.Biol.201195-1197；和Bevan，M.W.(1984)″BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation”，Nucl.Acid.Res.128711-8721，包括pLGV23，pGHlac+，pBIN19，pAK2004和pDH51(Pouwelsetal.，eds.(1985)CloningVectors.ElsevierNewYorkIBSN0444904018)。也是在另一個實施方案中，本發(fā)明核酸使用哺乳動物表達載體在哺乳動物細胞中表達。哺乳動物表達載體的實例包括pCDM8(Seed，B.(1987)Nature329840)和pMT2PC(Kaufmanetal.(1987)EMBOJ.6187-195)。表達載體的控制功能，當(dāng)時用在哺乳動物中時，經(jīng)常是由病毒調(diào)節(jié)元素提供的。例如，通常使用的啟動子來自多形瘤、腺病毒2、巨細胞病毒和猿猴病毒40。其他對于原核細胞和真核細胞都合適的表達體系，參見Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.，andManiatis，T.MolecularCloningALaboratoryManual.2nded.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989的16章和17章。在另一個實施方案中，重組的哺乳動物表達載體，能夠指導(dǎo)特定細胞類型中優(yōu)選核酸的表達(例如，組織特異性調(diào)節(jié)元素被用于表達核酸)。組織特異性調(diào)節(jié)元素在技術(shù)上是已知的。合適的組織特異性啟動子的實例包括但不局限于，白蛋白啟動子(肝臟特異；Pinkertetal.(1987)GeneDev.1268-277)，淋巴特異啟動子(CalameandEaton(1988)Adv.Immunol.43235-275)，T-細胞受體的特殊啟動子(WinotoandBaltimore(1989)EMBOJ.8729-933)和免疫球蛋白的特殊啟動子(Banerjietal.(1983)Cell33729-740；QueenandBaltimore(1983)Cell33741-748)，神經(jīng)元特異的啟動子(例如神經(jīng)絲啟動子；ByrneandRuddle(1989)P4NS865473-5477)，胰腺特異的啟動子(Edlundetal.(1985)Science230912-916)，以及乳腺特異的啟動子(例如乳汁乳清啟動子；U.S.PatentNo.4,873,316和EuropeanApplicationPublicationNo.264,166)。也包括發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動子，例如鼠類hox啟動子(KesselandGruss(1990)Science249374-379)和α-胎蛋白啟動子(CampesandTilghman(1989)GenesDev.3537-546)。本發(fā)明此外還提供了含有本發(fā)明DNA分子的重組表達載體，該DNA分子以反義方向克隆在表達載體中。也就是說，DNA分子可以可操作性的按以下方式連接到調(diào)節(jié)序列上，即允許與MPmRNA反義的RNA分子表達(通過DNA分子的轉(zhuǎn)錄)的方式。可以選擇那些在各種細胞類型中指導(dǎo)反義RNA分子連續(xù)表達的調(diào)節(jié)序列，，例如病毒啟動子和/或增強子，或者可以選擇指導(dǎo)連續(xù)的、組織特異的或者細胞類型特異的反義RNA表達的調(diào)節(jié)序列，作為調(diào)節(jié)序列。反義表達載體可以以重組質(zhì)粒、噬菌粒或者減毒病毒的形式存在，在其中反義核酸在高效調(diào)節(jié)區(qū)域的控制下產(chǎn)生，其活性可以通過引入載體的細胞類型來確定。關(guān)于使用反義基因調(diào)節(jié)基因表達，可以參見Weintraub，H.etal.，AntisenseRNAasamoleculartoolforgeneticsanalysis，Review-TrendsinGenetics，Vol.1(1)1986。本發(fā)明的另一方面，涉及被引入本發(fā)明重組表達載體的宿主細胞的。術(shù)語“宿主細胞”和“重組宿主細胞”在此處可以交替使用。該術(shù)語應(yīng)該理解為，不僅指被挑選的特定細胞，而且也指這些細胞的后代或者可能的后代。因為突變或者環(huán)境影響會使得某些修飾發(fā)生在成功的傳代中，這些后代細胞實際上不可能與母細胞完全相同，但是也包含在此處使用的術(shù)語范圍之內(nèi)。宿主細胞可以是任何原核或者真核細胞。例如，MP蛋白可以在像是谷氨酸棒桿菌這樣的細菌細胞中、昆蟲細胞中、酵母細胞中或者哺乳動物細胞(例如中國大鼠卵巢細胞(CHO)或者COS細胞)中表達。其他合適的宿主細胞，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的?？梢杂米鞅景l(fā)明核酸和蛋白質(zhì)分子宿主細胞的谷氨酸棒桿菌親緣微生物，在表3中列出。載體DNA可以通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染技術(shù)，引入原核或者真核細胞。如此處所用的那樣，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”的意思是指各種本領(lǐng)域熟知的，把外源核酸(例如，線性DNA或者RNA(例如，線性載體或者沒有載體的單獨基因結(jié)構(gòu)))或者以載體形式存在的核酸(例如，質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子或者其他DNA)轉(zhuǎn)入宿主細胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或者氯化鈣共沉淀，DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，或者電傳孔。轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染宿主細胞的合適方法，可以在Sambrook，etal.(MolecularCloningALaboratoryManual.2nd，ed.，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989)，以及其他實驗室手冊上找到。已知，為了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，依靠使用的表達載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，只有一小部分可以把外源DNA整合到其自身基因組中。為了鑒定和篩選這些整合體，編碼篩選標(biāo)記(例如，對抗生素的抗性)的基因通常與感興趣的基因被一同引入宿主細胞。優(yōu)選的篩選標(biāo)記包括那些能賦予藥物抗性的標(biāo)記，例如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。編碼篩選標(biāo)記的核酸，可以與MP蛋白在同一個載體上被引入宿主細胞，或者在單獨的載體上引入宿主細胞。經(jīng)被引入核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞，可以使用藥物篩選鑒定(例如，與篩選標(biāo)記基因合并的細胞可以存活，而其他細胞則死掉)。為了創(chuàng)造同源重組微生物，制備含有至少部分MP基因的載體，該基因具有缺失、添加或者取代，從而改變，例如功能性破壞，MP基因。優(yōu)選的該是谷氨酸棒桿菌MP基因，但是它也可以是來自親緣細菌的同源物，甚至是來自哺乳動物、酵母或者昆蟲。在一個優(yōu)選的實施方案中，設(shè)計載體，使得根據(jù)同源重組，內(nèi)源MP基因被功能性破壞(即，不在編碼功能蛋白質(zhì)；也稱作“敲除”載體)。另外，可以設(shè)計載體，使得根據(jù)同源重組，內(nèi)源MP基因被發(fā)生突變或者改變，但是仍編碼功能蛋白質(zhì)(例如，改變上游調(diào)節(jié)區(qū)域，從而改變?nèi)庠碝P基因的表達)。在同源重組載體中，被改變的MP基因部分，在其5’和3’末端側(cè)面連接有多余的MP核酸，使得同源重組可以發(fā)生在載體攜帶的外源MP基因和微生物的內(nèi)源MP基因之間。多余的側(cè)面連接的MP核酸具有足夠的長度，可以與內(nèi)源基因成功的發(fā)生同源重組。典型的，載體中含有幾千個堿基的側(cè)鏈DNA(5’和3’末端)(參見，例如，Thomas，K.R.，andCapecchi，M.R.(1987)Cell51503foradescriptionofhomologousrecombinationvectors)。引入微生物(例如電傳孔)和細胞的載體，選擇那些其中引入的MP基因與內(nèi)源MP基因，使用技術(shù)上已知的技術(shù)可以同源重組的。在另一個實施方案中，可以產(chǎn)生含有所選擇系統(tǒng)的重組微生物，該系統(tǒng)允許調(diào)節(jié)引入基因的表達。例如，包含的MP基因在載體中處于lac操縱子的控制之下，使得MP基因只能在IPTG存在時表達。這種調(diào)節(jié)系統(tǒng)在技術(shù)上是熟知的。在另一個實施方案中，宿主細胞中的內(nèi)源MP基因被破壞(例如，通過同源重組或者其他技術(shù)上已知的遺傳方法)，使得其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達不能發(fā)生。在另一個實施方案中，宿主細胞中的內(nèi)源的或者引入的MP基因，經(jīng)一個或者多個點突變、缺失或者倒置而改變，但是仍舊編碼功能MP蛋白。而在另一個實施方案中，微生物MP基因的一個或者多個調(diào)節(jié)區(qū)域(例如，啟動子、阻抑物或者誘導(dǎo)子)被改變(例如，通過缺失、剪切、倒置或者點突變)，使得MP基因的表達得到調(diào)節(jié)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以意識到，含有不止一個所述MP基因和蛋白質(zhì)修飾的宿主細胞，使用本發(fā)明的方法可以很容易的產(chǎn)生，這些細胞也包含在本發(fā)明中。本發(fā)明宿主細胞，例如培養(yǎng)的原核或者真核宿主細胞，可以用于產(chǎn)生(例如表達)MP蛋白。因此，本發(fā)明進一步提供了，使用本發(fā)明宿主細胞產(chǎn)生MP蛋白的方法。在一個實施方案中，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞(其中引入了編碼MP蛋白的重組表達載體，或者其基因組中引入了編碼野生型或者改變的MP蛋白的基因)，直到產(chǎn)生MP蛋白。在另一個實施方案中，該方法進一步包括從培養(yǎng)基或者宿主細胞中分離MP蛋白。C.分離的MP蛋白本發(fā)明的另一方面涉及分離的MP蛋白及其生物活性部分的?！胺蛛x的”或者“純化的”蛋白，或者其生物活性部分，當(dāng)使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時基本上沒有細胞物質(zhì)，當(dāng)化學(xué)合成時基本上沒有化學(xué)前體或者其他化學(xué)物質(zhì)。術(shù)語“基本上不含細胞物質(zhì)”包括這樣的MP蛋白制備，其中蛋白質(zhì)被從天然或者重組產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的細胞的細胞組分中分離出。在一個實施方案中，術(shù)語“基本上不含細胞物質(zhì)”包括制備含有至少大約30％(干重)非MP蛋白(此處也稱作“污染蛋白質(zhì)”)的MP蛋白，更優(yōu)選的含有少于大約20％的非MP蛋白，甚至更優(yōu)選的含有少于大約10％的非MP蛋白，最優(yōu)選的含有少于大約5％的非MP蛋白。當(dāng)MP蛋白或者其生物活性部分經(jīng)重組產(chǎn)生時，優(yōu)選是基本上不含培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基少于制備蛋白質(zhì)體積的大約20％，優(yōu)選的少于10％，最優(yōu)選的少于大約5％。術(shù)語“基本上不含化學(xué)前體或者其他化學(xué)物質(zhì)”包括這樣的MP蛋白制備，其中蛋白質(zhì)被從參與蛋白質(zhì)合成的化學(xué)前體或者其他化學(xué)物質(zhì)中分離出。在一個實施方案中，術(shù)語“基本上不含化學(xué)前體或者其他化學(xué)物質(zhì)”包括制備含有至少大約30％(干重)化學(xué)前體或者非MP化學(xué)物質(zhì)的MP蛋白，更優(yōu)選的含有少于大約20％的化學(xué)前體或者非MP化學(xué)物質(zhì)，甚至更優(yōu)選的含有少于大約10％的化學(xué)前體或者非MP化學(xué)物質(zhì)，最優(yōu)選的含有少于大約5％的化學(xué)前體或者非MP化學(xué)物質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施方案中，分離的蛋白質(zhì)或者其生物活性部分，不含有來自獲得MP蛋白的同一生物體的污染蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)典型的是由重組表達產(chǎn)生，例如像谷氨酸棒桿菌這樣微生物中的谷氨酸棒桿菌MP蛋白的重組表達。分離的本發(fā)明的MP蛋白或者其生物活性部分，能夠催化氨基酸、維生素、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝途徑中的酶促反應(yīng)或者具有一種或者多種列在表1中的活性。在一個優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)或者其部分含有這樣的氨基酸序列，該序列與本發(fā)明的氨基酸序列(例如，序列表偶數(shù)序列號序列中的一個序列)有充分的同源性，使得該蛋白質(zhì)或者其生物活性部分，能夠催化氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝途徑中的酶促反應(yīng)。蛋白質(zhì)的部分，優(yōu)選是指此處描述的生物活性部分。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的MP蛋白具有在序列表中以偶數(shù)序列號列出的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，MP蛋白具有由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，該核苷酸序列與本發(fā)明的核苷酸序列(例如，序列表奇數(shù)序列號序列中的一個序列)雜交，例如在嚴(yán)格條件下雜交。在另一個優(yōu)選的實施方案中，MP蛋白具有由這樣的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，該核苷酸序列與本發(fā)明的一條核酸序列或者其部分，有至少大約50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％或者60％的同源性，優(yōu)選的有至少大約61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或者70％的同源性，更優(yōu)選的有至少大約71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或者80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，88％，89％或者90％，或者91％，92％，93％，94％，以及甚至更優(yōu)選的有至少大約95％，96％，97％，98％，99％或者更高的同源性。介于上面引述的值之間的范圍或者一致性值(例如，70-90％的一致性或者80-95％的一致性)，也有意的包含在本發(fā)明中。例如，有意的包含了這樣的一致性值范圍，這些范圍是上面引用的上限和/或下限值的組合。本發(fā)明優(yōu)選的MP蛋白也優(yōu)選的具有至少一種此處描述的MP活性。例如，一種本發(fā)明優(yōu)選的MP蛋白包含這樣的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，該核苷酸序列與本發(fā)明的核苷酸序列雜交，例如在嚴(yán)格條件下雜交，并且該序列能夠催化氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖代謝途徑中的酶促反應(yīng)，或者具有一種或者多種列在表1中的活性。在其他實施方案中，MP蛋白與本發(fā)明的氨基酸序列(例如，序列表偶數(shù)序列號序列中的一個序列)有充分的同源性，并且具有本發(fā)明氨基酸序列蛋白質(zhì)的功能活性，正如以上I部分詳細描述的那樣，其氨基酸序列由于天然改變或者突變而有所不同。因此，在另一個實施方案中，MP蛋白是這樣的蛋白質(zhì)，它具有的氨基酸序列與本發(fā)明的完全氨基酸序列，有至少大約50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％或者60％的同源性，優(yōu)選的有至少大約61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或者70％的同源性，更優(yōu)選的有至少大約71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或者80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，88％，89％或者90％，或者91％，92％，93％，94％，以及甚至更優(yōu)選的有至少大約95％，96％，97％，98％，99％或者更高的同源性，并且具有至少一種此處描述的MP活性。介于上面引述的值之間的范圍或者一致性值(例如，70-90％的一致性或者80-95％的一致性)，也有意的包含在本發(fā)明中。例如，有意的包含了這樣的一致性值范圍，這些范圍是上面引用的上限和/或下限值的組合。在另一個實施方案中，本發(fā)明與這樣的全長谷氨酸棒桿菌蛋白質(zhì)有關(guān)，該蛋白質(zhì)與本發(fā)明的氨基酸序列有充分的同源性。MP蛋白的生物活性部分包含這樣的多肽，該多肽含有來自MP蛋白氨基酸序列的氨基酸序列，例如，序列表偶數(shù)序列號的氨基酸序列或者與MP蛋白同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列，該部分含有比全長MP蛋白或者全長MP蛋白同源蛋白質(zhì)更少的氨基酸，并且表現(xiàn)出至少一種MP蛋白活性。典型的生物活性部分(肽，例如，氨基酸長度為像是5，10，15，20，30，35，36，37，38，39，40，50，100或者更多的肽)包括一個具有至少一種MP蛋白活性的結(jié)構(gòu)域或者基元。另外，其他生物活性部分，其中蛋白質(zhì)的其他部分已被刪除，可以通過重組技術(shù)制備，并鑒定其此處描述的一種或者多種活性。優(yōu)選的MP蛋白的生物活性部分，含有一個或者多個挑選的具有生物活性的結(jié)構(gòu)域/基元或者其部分。MP蛋白優(yōu)選的通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)。例如，把編碼蛋白質(zhì)的核酸分子克隆到表達載體中(如上所述)，將表達載體引入宿主細胞(如上所述)并在宿主細胞中表達MP蛋白。然后按照合適的純化方案，使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)，從細胞中分離MP蛋白。除了重組表達，可以使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成MP蛋白、多肽或者肽。另外，天然MP蛋白可以從細胞(例如內(nèi)皮細胞)中分離，例如使用抗-MP抗體，該抗體可以使用本發(fā)明的MP蛋白或者其部分通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生。本發(fā)明也提供了MP嵌合蛋白或者融合蛋白。如此處所用的，MP“嵌合蛋白”或者“融合蛋白”含有可操作性連接到非MP多肽上的MP多肽?！癕P多肽”是指含有MP相關(guān)氨基酸序列的多肽，而“非MP蛋白”是指含有這樣的蛋白質(zhì)相關(guān)氨基酸序列的多肽，該蛋白質(zhì)與MP蛋白沒有基本的同源性，例如，來自相同或者不同生物體的與MP蛋白不同的蛋白質(zhì)。在融合蛋白質(zhì)中，術(shù)語“可操作性連接”的意思是指，MP蛋白與非MP蛋白相互之間是符合讀框的融合。非MP多肽可以融合到MP多肽的N-末端或者C-末端。例如，在一個實施方案中，融合蛋白質(zhì)是DST-MP融合蛋白，其中MP序列融合到GST序列的C-末端。該融合蛋白質(zhì)有助于重組MP蛋白的純化。在另一個實施方案中，融合蛋白質(zhì)是在其N-末端有異源信號序列的MP蛋白。在某些宿主細胞(例如哺乳動物宿主細胞)中，通過使用異源信號序列可以增加MP蛋白的表達和/或分泌。優(yōu)選，本發(fā)明的嵌合蛋白或者融合蛋白通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。例如，依照常規(guī)技術(shù)編碼不同多肽序列的DNA片段被符合讀框的連接在一起，例如，使用平頭末端或者交錯末端的末端連接，使用限制性酶進行消化以提供合適的末端，使用粘性末端補平作為合適的末端，使用堿性磷酸酶處理以避免不合需要的連接，以及使用酶促連接。在另一個實施方案中，可以使用常規(guī)技術(shù)包括自動DNA合成儀合成融合基因。另外，可以使用錨引物進行基因片段的PCR擴增，錨引物可以增加兩條連續(xù)基因片段之間的互補的突出端，連續(xù)基因可以隨后進行退火和再擴增而產(chǎn)生嵌合基因序列(參見，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology，eds.Ausubeletal.JohnWiley&Sons1992)。另外，很多已經(jīng)編碼融合部分(例如GST多肽)的表達載體是商業(yè)提供的。MP-編碼核酸可以被克隆到這種表達載體中，使得融合部分符合讀框的連接到MP蛋白上。MP蛋白的同源物可以通過突變產(chǎn)生，例如MP蛋白的不連續(xù)點突變或者剪切。如此處所用的，術(shù)語“同源物”是指MP蛋白的變體形式，它們可以用作MP蛋白活性的激動劑或者拮抗物。MP蛋白的激動劑可以基本上具有MP蛋白相同的或者部分的生物活性。MP蛋白的拮抗物可以抑制MP蛋白天然存在形式的一種或者多種活性，例如，通過與包含MP蛋白的MP系統(tǒng)的下游或者上游成員競爭性結(jié)合。因此，本發(fā)明的谷氨酸棒桿菌MP蛋白及其同源物，可以調(diào)節(jié)一條或者多條糖類轉(zhuǎn)運途徑的活性，或者調(diào)節(jié)MP蛋白在該微生物中發(fā)揮作用的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑的活性。在另外的實施方案中，MP蛋白的同源物可以通過篩選MP蛋白突變體的組合文庫，例如剪切突變體，來鑒定MP蛋白激動劑或者拮抗劑活性。在一個實施方案中，MP變體的多樣性文庫通過在核酸水平上組合性突變而產(chǎn)生，并由多樣性基因文庫編碼。MP變體的多樣性文庫可以通過，例如，把合成的寡聚核苷酸混合物酶促連接到基因序列中，使得潛在MP序列的簡并集合作為單個多肽，或者其中含有MP序列集合的更大的融合蛋白質(zhì)(例如為了噬菌體展示)的集合，是可以表達的。有各種方法可以用于從簡并寡聚核苷酸序列，產(chǎn)生潛在MP同源物文庫?？梢杂米詣覦NA合成儀進行簡并基因序列的化學(xué)合成，然后合成基因被連接到合適的表達載體中?；蚝啿⒓系氖褂茫试S混合的提供編碼所需潛在MP序列集合的全部序列。合成簡并寡聚核苷酸的方法在技術(shù)上是已知的(參見，例如，Narang，S.A.(1983)Tetrahedron393；Itakuraetal.(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakuraetal.(1984)Science1981056；Ikeetal.(1983)NucleicAcidRes.11477)。另外，編碼MP蛋白片段的文庫，可用于產(chǎn)生MP片段的多樣性群體，該群體用于篩選并挑選MP蛋白的同源物。在一個實施方案中，編碼序列片段的文庫可以這樣產(chǎn)生，即在大約每分子只產(chǎn)生一個切口的條件下，用核酸酶處理MP編碼序列的雙鏈PCR片段，變性雙鏈DNA，復(fù)性DNA以形成雙鏈DNA，該雙鏈DNA可以包含從不同有切口的產(chǎn)物形成的有義/反義對，在重新形成的雙螺旋中通過S1核酸酶處理除去單鏈部分，以及把最后得到的片段文庫連接到表達載體中。通過該方法，可以得到編碼N-末端、C-末端和不同大小MP蛋白中間片段的表達文庫。篩選由點突變或者剪切得到的組合文庫中的基因產(chǎn)物的許多技術(shù)，以及篩選cDNA文庫中具有所挑選特性基因產(chǎn)物的技術(shù)，在技術(shù)上都是已知的。這些技術(shù)都適用于由MP同源物組合突變得到的基因文庫的快速篩選。篩選大型基因庫的應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，能夠用于高產(chǎn)量分析，包括把基因組文庫克隆到可復(fù)制表達載體中，用得到的載體文庫轉(zhuǎn)化載體文庫，以及在一定條件下表達組合基因，在該條件下所需活性的檢測有助于編碼被檢測產(chǎn)物基因的載體的分離。回歸系綜突變(REM)，一種增加文庫中功能突變體頻率的新技術(shù)，可以與篩選分析一起用于鑒定MP同源物(ArkinandYourvan(1992)PANS897811-7815；Delgraveetal.(1993)ProteinEngineering6(3)327-331)。在另一個實施方案中，使用技術(shù)上已知的方法，基于細胞的分析可以用于分析多樣性MP文庫。D.本發(fā)明的應(yīng)用和方法此處描述的核酸分子、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)同源物、融合蛋白質(zhì)、引物、載體和宿主細胞，可以應(yīng)用于下述一種或者多種方法中鑒定谷氨酸棒桿菌和親緣微生物；繪制谷氨酸棒桿菌親緣生物體的基因組圖譜；鑒定和定位谷氨酸棒桿菌的感興趣序列；進化研究；確定MP蛋白的功能必需區(qū)域；MP蛋白活性調(diào)節(jié)；MP途徑活性調(diào)節(jié)；所需化合物，例如精細化學(xué)物質(zhì)的細胞生產(chǎn)的調(diào)節(jié)。本發(fā)明MP核酸分子具有各種用途。首先，它們可以用于鑒定一種生物體是否是谷氨酸棒桿菌或者其近親生物體。它們也可以用于鑒定混合微生物群體中谷氨酸棒桿菌或者其親緣生物體的存在。本發(fā)明提供了許多谷氨酸棒桿菌基因的核酸序列；在嚴(yán)格條件下，使用跨越對谷氨酸棒桿菌特異基因的探針，探測從單一或者混合微生物培養(yǎng)物中提取的基因組DNA，可以確定該生物體是否存在。盡管谷氨酸棒桿菌本身是非致病性的，但是它與致病種類相關(guān)，例如白喉棒桿菌。白喉棒桿菌是白喉的致病源，白喉是一種發(fā)展迅速、急性、發(fā)燒的感染，它涉及局部病狀和系統(tǒng)病狀。得這種疾病時，上呼吸道發(fā)生局部病變，并且包括上皮細胞壞死性損傷；細菌分泌毒素，毒素從病變處散布到身體易受感染的末梢組織。這些組織包括心臟、肌肉、外周神經(jīng)、腎上腺、腎臟、肝臟和脾臟，在其中由于蛋白質(zhì)合成被抑制而造成的變質(zhì)性改變，會導(dǎo)致該疾病的系統(tǒng)病狀。白喉在世界許多地區(qū)保持高發(fā)病率，這些地區(qū)包括非洲、亞洲、東歐和前蘇聯(lián)的獨立國家。從1990年起，在后兩個地區(qū)白喉的持續(xù)流行，導(dǎo)致了至少5,000人死亡。在一個實施方案中，本發(fā)明與鑒定受試者中白喉棒桿菌存在或者活性的方法有關(guān)。該方法包括鑒定受試者中本發(fā)明的一條或者多條核酸或者氨基酸序列(例如，分別列在序列表中的奇數(shù)或者偶數(shù)序列號序列)，從而檢測受試者中白喉棒桿菌的存在或者活性。谷氨酸棒桿菌和白喉棒桿菌是有親緣關(guān)系的細菌，谷氨酸棒桿菌中的許多核酸和蛋白質(zhì)分子是白喉棒桿菌中核酸和蛋白質(zhì)分子的同源物，因此也可以用于檢測受試者中的白喉棒桿菌。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)分子也可以用作基因組特定區(qū)域的標(biāo)記。這不僅在繪制基因組圖譜時有用，而且可以用于谷氨酸棒桿菌蛋白質(zhì)功能研究。例如，為了鑒定特定谷氨酸棒桿菌DNA結(jié)合蛋白與之結(jié)合的基因組區(qū)域，可以消化谷氨酸棒桿菌基因組，將片段與DNA結(jié)合蛋白孵育。與蛋白質(zhì)結(jié)合的片段可以進一步用本發(fā)明的核酸分子探測，優(yōu)選使用易檢測標(biāo)記；這些核酸分子與基因組片段的結(jié)合，可以定位片段在谷氨酸棒桿菌基因組圖譜上的位置，而且，當(dāng)使用不同的酶進行多次操作時，有助于快速確定蛋白質(zhì)與之結(jié)合的核酸序列。另外，本發(fā)明核酸分子可以與親緣種類有充分的同源性，使得這些核酸分子可以作為構(gòu)建親緣細菌基因組圖譜的標(biāo)記，例如乳發(fā)酵短桿菌。本發(fā)明的MP核酸分子又可以用于進化和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究。本發(fā)明分子參與的糖類攝取系統(tǒng)，被各種各樣的細菌所使用；通過比較本發(fā)明核酸分子序列和那些在其他生物體中編碼相似酶的核酸分子序列，可以估算生物體的進化相關(guān)性。類似的，這種比較允許估算保守序列區(qū)域和非保守序列區(qū)域，這可以有助于確定蛋白質(zhì)中對于酶功能必需的區(qū)域。這種類型的確定對于蛋白質(zhì)工程研究是有價值的，并且可以指示那些蛋白質(zhì)可以忍受突變而不失去功能。本發(fā)明MP核酸分子的操作可以導(dǎo)致具有與野生型MP蛋白不同功能的MP蛋白的產(chǎn)生?？梢蕴岣哌@些蛋白質(zhì)的效率或者活性，可以使之以比通常更多的數(shù)目出現(xiàn)在細胞中，或者降低其效率或者活性。本發(fā)明也提供了篩選可調(diào)節(jié)MP蛋白活性的分子的方法，這些分子或者通過與蛋白質(zhì)本身或者底物相互作用，或者與MP蛋白的配偶體結(jié)合，或者通過調(diào)節(jié)本發(fā)明MP核酸分子的轉(zhuǎn)錄或者翻譯來調(diào)節(jié)MP蛋白活性。在該方法中，表達一種或者多種MP蛋白的微生物，與一種或者多種試驗化合物接觸，并且評估每種測試化合物對于MP蛋白活性或者表達水平的作用。當(dāng)需要從谷氨酸棒桿菌的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)物中分離的所需精細化學(xué)物質(zhì)是氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷或海藻糖時，通過重組遺傳機制調(diào)節(jié)一種或多種本發(fā)明蛋白的活性效率或活性可以直接影響這些精細化學(xué)物質(zhì)中的一種。例如，對所需氨基酸生物合成途徑中的酶而言，該酶活性或效率的提高(包括存在多個拷貝的基因)應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致所需氨基酸的生產(chǎn)或生產(chǎn)效率增加。對于其合成與所需氨基酸的生物合成競爭的氨基酸生物合成途徑中的酶，該酶活性或效率的降低(包括基因缺失)會導(dǎo)致所需氨基酸生產(chǎn)或生產(chǎn)效率的增加，是由于對中間體化合物和/或能量的競爭減少。對于所需氨基酸降解途徑的酶，該酶活性或效率的降低會導(dǎo)致所需產(chǎn)物的產(chǎn)量或生產(chǎn)效率更高，這是由于其降解減少了。最后，對所需氨基酸生物合成相關(guān)酶進行誘變使得該酶不再被反饋抑制，這會導(dǎo)致所需氨基酸的產(chǎn)量或生產(chǎn)效率提高。對本發(fā)明的維生素、輔因子、營養(yǎng)因子、核苷酸、核苷和海藻糖代謝相關(guān)的生物合成和降解酶來說，同樣如此。類似地，當(dāng)所需精細化學(xué)物質(zhì)不是上述化合物之一時，本發(fā)明的一種蛋白活性的調(diào)節(jié)仍有可能影響谷氨酸棒桿菌大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)該化合物的效率和/或產(chǎn)量。任何生物體的代謝途徑都是密切關(guān)聯(lián)的，一種途徑使用的中間體經(jīng)常由不同的途徑供給。酶表達和功能可以根據(jù)不同代謝過程化合物的細胞水平來調(diào)節(jié)，基礎(chǔ)生產(chǎn)必需的分子如氨基酸和核苷酸的細胞水平對大規(guī)模培養(yǎng)中的微生物活力具有重大影響。因此，調(diào)節(jié)一種氨基酸生物合成酶使得其對反饋抑制不再有反應(yīng)或其效率或轉(zhuǎn)變提高，會導(dǎo)致一種或多種氨基酸細胞水平增加。結(jié)果，該增加的氨基酸供給不但增加對蛋白質(zhì)合成必需分子的供應(yīng)，也會增加用作多種其它生物合成途徑中的中間體和前體的分子的供應(yīng)。如果細胞內(nèi)特定氨基酸有限，增加其生產(chǎn)也會增加細胞進行多種其它代謝反應(yīng)的能力，并使細胞更有效地生產(chǎn)各種蛋白，可能會增加大規(guī)模培養(yǎng)中的細胞總生產(chǎn)速率或存活能力。活力增加提高了發(fā)酵培養(yǎng)物中能夠產(chǎn)生所需精細化學(xué)物質(zhì)的細胞的數(shù)量，從而增加該化合物的產(chǎn)量。通過調(diào)節(jié)本發(fā)明降解酶活性，使得該酶不再催化對所需化合物生物合成重要，或使大規(guī)模培養(yǎng)物中的細胞生長和增殖更有效的細胞化合物的降解或催化效率降低，也會存在類似情況。應(yīng)當(dāng)強調(diào)的是，優(yōu)化本發(fā)明某些分子的降解活性或降低生物合成活性也會對谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)某些精細化學(xué)物質(zhì)有正面作用。例如，通過降低與所需化合物生物合成途徑競爭一種或多種中間體的途徑中生物合成酶的活性效率，更多的中間體可以用于所需物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。類似情形下需要提高一種或多種本發(fā)明蛋白的降解能力或效率。前面提到的導(dǎo)致所需化合物產(chǎn)量增加的MP蛋白誘變方案的列表，并不意味著僅局限于此；這些誘變方案的變化對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是很明白的。經(jīng)過這些機制，本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)分子可以用于產(chǎn)生表達突變MP核酸和蛋白質(zhì)分子的谷氨酸棒桿菌或者其親緣菌株，從而增加所需化合物的產(chǎn)量、生產(chǎn)和/或生產(chǎn)效率。該所需化合物可以是谷氨酸棒桿菌的任何天然產(chǎn)物，這包括生物合成途徑的最終產(chǎn)物和天然存在代謝途徑的中間體，以及不是在谷氨酸棒桿菌代謝中天然存在但是由本發(fā)明谷氨酸棒桿菌菌株產(chǎn)生的分子。本發(fā)明進一步由以下實例闡明，這些實例不應(yīng)該被解釋為僅局限于此。本申請中所引用的所有參考文獻、專利申請、專利、發(fā)表的專利申請、表和序列列表中的內(nèi)容，全部引入作為參考。表1包括的基因表1(續(xù))表1(續(xù))丙氨酸和天冬氨酸及天冬酰胺代謝表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表1(續(xù))表3可用于實施本發(fā)明的棒桿菌和短桿菌ATCC美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD，USAFERM發(fā)酵研究所，Chiba，JapanNRRLARS農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)保藏中心，NRRL，Peoria，IL，USACECT西班牙典型培養(yǎng)，Valencia，西班牙NCIMB國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司，Aberdeen，UKCBS真菌菌種保藏中心，Baarn，NLNCTC國立典型培養(yǎng)保藏中心，London，UKDSMZ德意志微生物保藏中心，Braunsehweig，德國可參見Sugawara，H.etal.(1993)WorlddirectoryofcollectionsofculturesofmicroorganismsBacteria，fungiandyeasts(4thedn)，Worldfederationforculturecollectionsworlddatacenteronmicroorganisms，Saimata，Japen.表4序列比較結(jié)果表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))表4(續(xù))實施例實施例1谷氨酸棒桿菌ATCC13032全部基因組DNA的制備谷氨酸棒桿菌(ATCC13032)培養(yǎng)物在BHI培養(yǎng)基(Difco)中，30℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。離心收集細胞，棄上清，細胞重新懸浮在5ml緩沖液I(培養(yǎng)物原體積的5％-所有指出的體積都是對于100ml培養(yǎng)物體積計算的)中。緩沖液I的組成140.34g/l蔗糖，2.46g/lMgSO4×7H2O，10ml/lKH2PO4溶液(100g/l，KOH調(diào)節(jié)至PH6.7)，50g/lM12濃縮物(10g/l(NH4)2SO4，1g/lNaCl，2g/lMgSO4×7H2O，0.2g/lCaCl2，0.5g/l酵母提取物(Difco))，10ml/l微量元素混合物(200mg/lFeSO4×H2O，10mg/lZnSO4×7H2O，3mg/lMnCl2×4H2O，30mg/lH3BO3，20mg/lCoCl2×6H2O，1mg/lNiCl2×6H2O，3mg/lNa2MoO4×2H2O)，500mg/l絡(luò)合劑(EDTA或者檸檬酸)，100ml/l維生素混合物(0.2mg/l生物素，0.2mg/l葉酸，20mg/lp-氨基安息香酸，20mg/l核黃素，40mg/lpanthothenate，140mg/l煙酸，40mg/l鹽酸吡多醛，200mg/l肌醇)。懸浮液中加入溶菌酶至終濃度2.5mg/ml。37℃孵育大約4小時之后，細胞壁被降解，得到的原生質(zhì)體用離心收集。沉淀用5ml緩沖液I洗一次，用5mlTE緩沖液(10mMTris-HCl，1mlEDTA，pH8)洗一次。沉淀用4mlTE緩沖液重懸，并加入0.5mlSDS溶液(10％)和0.5mlNaCl溶液(5M)。加入蛋白酶K至終濃度200μg/ml，懸浮液在37℃孵育約18小時。DNA用苯酚、苯酚-氯仿-異戊醇、氯仿-異戊醇按照標(biāo)準(zhǔn)程序提取純化。然后，加入1/50體積的3M乙酸鈉和2倍體積的乙醇，在-20℃孵育30分鐘，用使用SS34轉(zhuǎn)頭(Sorvall)的高速離心機12,000rpm離心30分鐘，沉淀DNA。把DNA溶解在含有20μg/mlRNaseA的1mlTE緩沖液中，在1000mlTE緩沖液中4℃透析至少3小時。這段時間中，更換緩沖液3次。每0.4ml透析的DNA溶液中，加入0.4ml2MLiCl和0.8ml乙醇。在-20℃孵育30分鐘后，離心(13,000rpm，BiofugeFresco，Heraeus，Hanau，Germany)收集DNA。DNA沉淀融解在TE緩沖液中。按該程序制備的DNA可以用于所有目的，包括southern雜交和基因組文庫的構(gòu)建。實施例2在大腸桿菌中谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組文庫的構(gòu)建使用如在實施例1中所描述制備的DNA，按照已知的和充分建立的方法(參見，例如Sambrook，J.etal.(1989)“MolecularCloningALaboratoryManual”ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，或者Ausubel，F(xiàn).M.etal.(1994)“CurrentProtocolsinMolecularBilogy”，JohnWiley&Sons.)，可以構(gòu)建粘粒文庫和質(zhì)粒文庫?？梢允褂萌魏钨|(zhì)粒和粘粒。質(zhì)粒pBR322(Sutcliffe，J.G.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，753737-3741)；pACY177(Change&Cohen(1978)J.Bacteriol1341141-1156)，pBS系列質(zhì)粒(pBSSK+，pBSSK-和其他質(zhì)粒；Stratagene，LaJolla，USA)，粘粒SuperCosl(Stratagene，LaJolla，USA)或者Lorist6(Gibson，T.J.，RosenthalA.andWaterson，R.H.(1987)Gene53283-286)可以用于特殊用途。專門在谷氨酸棒桿菌中使用的基因文庫可以用質(zhì)粒pSL109(Lee，H.-S.andA.J.Sinskey(1994)J.Microbiol.Biotechnol.4256-263)構(gòu)建。實施例3DNA測序和計算機功能分析按照標(biāo)準(zhǔn)方法，使用如在實施例2中所描述基因組文庫，可以進行DNA測序，特別是用使用ABI377測序儀的鏈終止方法(參見，例如Fleischman，R.D.etal.(1995)“Whole-genomeRandomSequencingandAssemblyofHaemophilusInfluenzaeRd.，Science，269496-512)。使用具有以下核苷酸序列的測序引物5’-GGAAACAGTATGACCATG-3’或者5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’。實施例4體內(nèi)誘變可以通過大腸桿菌或者其他微生物(例如，芽孢桿菌某些菌或者像是釀酒酵母的酵母)的質(zhì)粒(或者其他載體)DNA的傳代，進行谷氨酸棒桿菌的體內(nèi)誘變，其中這些微生物保持其遺傳信息整體性的能力已被損傷。典型的突變株，在DNA修復(fù)系統(tǒng)的基因中有突變(例如，mutHLS，mutD，mutT等；參考文獻參見Rupp，w.D.(1996)DNArepairmechanisms，inEscherichiacoliandSalmonella，p.2277-2294，ASMWashington.)。這些菌株對于技術(shù)熟練的人來說是熟知的。這些菌株的使用闡述在，例如Greener，A.andCallahan，M.(1994)Strategies732-34中。實施例5在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌之間傳遞的DNA棒桿菌和短桿菌菌種含有能自發(fā)復(fù)制的內(nèi)源質(zhì)粒(像是例如，pHM1519或者pBL1)(評論參見，例如，Martin，J.F.etal.(1987)Biotechnology，5137-146)。大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌的穿梭載體，可以使用大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)載體容易的構(gòu)建(Sambrook，J.etal.(1989)“MolecularCloningALaboratoryManual”ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress或者Ausubel，F(xiàn).M.etal.(1994)“CurrentProtocolsinMolecularBilogy”，JohnWiley&Sons.)，即在其中加入谷氨酸棒桿菌的復(fù)制叉起始點和合適的標(biāo)記。這種復(fù)制起始點，優(yōu)選是從棒桿菌和短桿菌菌種中分離的內(nèi)源質(zhì)粒獲得的。用作這些菌種轉(zhuǎn)化標(biāo)記這一特殊用途的是卡那霉素抗性基因(例如來自Tn5或者Tn903轉(zhuǎn)座子的那些卡那霉素抗性基因)或者氯霉素抗性基因(Winnacker，E.L.(1987)“FromGenestoClones-IntroductiontoGeneTechnology，VCH，weinheim)。在構(gòu)建各種野生型穿梭載體的文獻中有許多實例，這些穿梭載體可以在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中復(fù)制，并且可以用于各種目的，其中包括基因過量表達(參考文獻參見，例如，Yoshihama，M.etal.(1985)J.Bacteriol.162591-597，MartinJ.F.etal.(1987)Biotechnology，5137-146和Eikmanns，B.J.eta，(1991)Gene，10293-98)。使用標(biāo)準(zhǔn)方法可以把感興趣的基因克隆到上述穿梭載體中，并且可以把該雜交載引入谷氨酸棒桿菌菌株中。谷氨酸棒桿菌的轉(zhuǎn)化可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Kastsumata，R.etal.(1984)J.Bacteriol.159306-311)，電傳孔(Liebl，E.etal.(1989)FEMSMicrobiol.Letters，53399-303)實現(xiàn)，當(dāng)使用特殊的載體時，也可以通過結(jié)合作用(例如在Sch_fer，Aetal.(1990)J.Bacteriol.1721663-1666)實現(xiàn)。也可以通過從谷氨酸棒桿菌制備質(zhì)粒DNA(使用技術(shù)上已知的標(biāo)準(zhǔn)方法)并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，而把穿梭載體從谷氨酸棒桿菌轉(zhuǎn)移到大腸桿菌。這一轉(zhuǎn)化步驟可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法進行，但是使用Mcr缺陷型大腸桿菌菌株，例如NM522(Gough&Murray(1983)J.Mol.Biol.1661-19)是有利的。使用含有pCG1(U.S.PatentNo.4,617,267)或者其片段的質(zhì)粒，并且可以選擇來自TN903的卡那霉素抗性基因(Grindley，N.D.andJoyce，C.M.(1980)Proc.Natl.AcadSci.USA77(12)7176-7180)，就可以在谷氨酸棒桿菌中過量表達基因。另外，使用質(zhì)粒pSL109(Lee，H.-S.andA.J.Sinskey(1994)J.Microbiol.Biotechnol.4256-263)也可以在谷氨酸棒桿菌中過量表達基因。除了使用可復(fù)制質(zhì)粒以外，也可以通過基因組整合而實現(xiàn)基因的過量表達。谷氨酸棒桿菌或者其他棒桿菌或者短桿菌菌種的基因組整合，可以通過熟知的方法實現(xiàn)，例如基因組區(qū)域的同源重組，限制性核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合(REMI)(參見例如，DEPatent19823834)，或者通過使用轉(zhuǎn)座子。也可以通過修飾調(diào)節(jié)區(qū)域(例如，啟動子、阻抑物和/或增強子)，通過使用定向位點方法(例如同源重組)或者基于隨機事件方法(例如轉(zhuǎn)座子誘變或者REMI)的序列修飾、插入或者缺失，來調(diào)節(jié)感興趣基因的活性。用作轉(zhuǎn)錄終止子的核酸序列，也可以被插入到本發(fā)明一個或者多個基因編碼區(qū)域的3’；這樣的終止子在技術(shù)上是熟知的，并且描述在例如Winnacker，E.L.(1987)FromGenestoClones-IntroductiontoGeneTechnology.VCHWeinheim中。實施例6突變蛋白質(zhì)表達的估算被轉(zhuǎn)化宿主細胞中突變蛋白質(zhì)活性的觀測，依賴于這一事實，即突變蛋白質(zhì)以與野生型蛋白質(zhì)相似的方式和相似的數(shù)量表達。確定突變基因轉(zhuǎn)錄水平(用于基因產(chǎn)物翻譯的mRNA的數(shù)量指標(biāo))的一種有用的方法是進行Northern雜交(參考文獻參見，例如，Ausubeletal.(1988)CurrentProtocolsinMolecularBiology，WileyNewYork)，其中設(shè)計的用于結(jié)合感興趣基因的引物標(biāo)記有可探測的標(biāo)記(通常是放射性的或者化學(xué)發(fā)光的)，從而，當(dāng)生物體培養(yǎng)物的全部RNA被提取出，跑凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到穩(wěn)定介質(zhì)上并與該探針孵育，結(jié)合探針的結(jié)合和數(shù)量便指示了該基因mRNA的存在和數(shù)量。該信息是突變基因轉(zhuǎn)錄程度的證據(jù)?？梢允褂脦追N方法從谷氨酸棒桿菌中制備全部細胞RNA，這在技術(shù)上是熟知的，例如描述在Bormann，E.R.etal.(1992)Mol.Microbiol.6317-326中的。為了估算由該mRNA翻譯的蛋白質(zhì)的存在和相對數(shù)量，可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如Wesstern雜交(參見，例如，Ausubeletal.(1988)CurrentProtocolsinMolecularBiology，WileyNewYork)。在該方法中，提取全部細胞蛋白質(zhì)，通過凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到像是硝酸纖維素這樣的介質(zhì)上，和與所需蛋白質(zhì)特異結(jié)合的探針共孵育，例如抗體。該探針通常標(biāo)記有易于檢測的化學(xué)發(fā)光的或者比色的標(biāo)記。觀測到的標(biāo)記的存在和數(shù)量，指示了出現(xiàn)在細胞中的所需突變蛋白質(zhì)的存在和數(shù)量。實施例7遺傳修飾的谷氨酸棒桿菌的生長-介質(zhì)和培養(yǎng)條件遺傳修飾的谷氨酸棒桿菌可以培養(yǎng)在合成或者天然生長培養(yǎng)基中。用于谷氨酸棒桿菌的各種不同的生長培養(yǎng)基是已知的并且是易于得到的(Lieb，etal.(1989)Appl.Microbiol.Biotechno.，32205-210；vonderOstenetal.(1998)BiotechnologyLetters，1111-16；PatentDE4，120，867，Liebl(1992)“TheGenuSCorynebacterium，inProcaryotes，VolumeII，Balows，A.etal.，eds.Springer-Verlag)。這些培養(yǎng)基含有一種或者多種碳源、氮源、無機鹽、維生素和微量元素。優(yōu)選的碳源是糖類，例如單糖、二糖或者多糖。例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖，棉子糖，淀粉或者纖維素，都可用作很好的碳源。也可以通過復(fù)雜化合物向培養(yǎng)基提供糖類，例如糖蜜或者其他糖類精煉的副產(chǎn)物。提高不同碳源的混合物也是有利的。其他可用的碳源有酒精和有機酸，例如甲醇、乙醇、乙酸或者乳酸。氮源通常是有機或者無機的氮化合物，或者含有這些化合物的物質(zhì)。代表性的氮源包括氨氣或者銨鹽，例如NH4Cl或者(NH4)2SO4、NH4OH、硝酸鹽、尿素、氨基酸或者復(fù)雜的氮源，例如玉米浸泡液、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉類提取物或者其他。可以包含在培養(yǎng)基中的無機鹽化合物，包括鹽酸鹽、磷酸鹽或者硫酸鹽的鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅或者鐵。螯合劑可以加到培養(yǎng)基中，以維持溶液中的金屬離子。特別有用的螯合劑包括二羥基苯酚，像是兒茶酚和原兒茶酸，或者有機酸，像是檸檬酸。培養(yǎng)基典型的也含有生長因子，例如維生素和生長促進劑，它們的實例包括生物素、核黃素、硫胺、葉酸、煙酸、泛酸鹽和吡多醇。生長因子和鹽經(jīng)常來自復(fù)雜的培養(yǎng)基成分，例如酵母提取物、糖蜜、玉米浸泡液和其他成分。培養(yǎng)基化合物的確切組成強烈的依賴于直接實驗，而且對于每一個具體情況具體決定。關(guān)于培養(yǎng)基最優(yōu)化的信息通過在教科書“AppliedMicrobiol.Physiology，APracticalApproach”(eds.P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRLPress(1997)pp.53-73，ISBN0199635773)”中。也可以從商業(yè)供應(yīng)商那里選擇生長培養(yǎng)基，像是standard1(Merck)或者BHI(grainheartinfusion，DIFCO)或者其他的。所有培養(yǎng)基組分都要通過加熱(1.5bar，120℃，20分鐘)或者無菌過濾滅菌。組分可以一起滅菌，或者如果必要的話分開單獨滅菌。所有的培養(yǎng)基組分可以在生長的開始就加入，或者可以選擇連續(xù)性或者分批加入。培養(yǎng)條件對每個實驗分別確定。溫度應(yīng)該在15℃到45℃范圍內(nèi)。溫度可以保持恒定，或者在實驗中改變。培養(yǎng)基的pH在5到8.5范圍內(nèi)，優(yōu)選的在大約7.0，并且可以通過培養(yǎng)基中緩沖液的添加來維持。針對這一目的有代表性的緩沖液是磷酸鉀緩沖液。合成緩沖液，例如MOPS、HEPES、ACES以及其他的，也可以代替使用或者同時使用。也可以在生長過程中通過添加NaOH或者NH4OH，以維持穩(wěn)定的培養(yǎng)pH。如果使用像是酵母提取物這樣的復(fù)雜培養(yǎng)基組分，可以減少添加緩沖液的必要性，這是因為許多復(fù)雜化合物具有很強的緩沖能力這一事實。如果使用發(fā)酵罐培養(yǎng)微生物，也可以使用氨氣控制pH。孵育時間通常在幾小時到幾天范圍內(nèi)。這一時間的選取是為了允許在液體培養(yǎng)基中積累最大量的產(chǎn)物。公布的生長實驗可是在各種容器中進行，例如微量滴定板、玻璃試管、玻璃搖瓶或者不同大小的玻璃或者金屬的發(fā)酵罐。為了篩選大量的克隆，微生物應(yīng)該培養(yǎng)在有擋板或者沒有擋板的微量滴定板、玻璃試管或者搖瓶中。優(yōu)選的使用100ml搖瓶，加入10％(體積)的所需培養(yǎng)基。搖瓶應(yīng)該放在搖床上搖動(振幅25毫米)，速度范圍100-300rpm。可以通過保持濕潤的空氣減少蒸發(fā)損失；或者，對蒸發(fā)損失進行數(shù)學(xué)修正。如果要檢測遺傳修飾的克隆，那么也應(yīng)該檢測未經(jīng)修飾的對照克隆或者含有基本質(zhì)粒但沒有任何插入的對照克隆。使用生長在瓊脂板上30℃孵育的細胞，例如CM平板(10g/l葡萄糖，2.5g/lNaCl，2g/l尿素，10g/l多胨，5g/l酵母提取物，5g/l肉汁提取物，22g/l瓊脂，2MNaOH調(diào)至pH6.8)，接種培養(yǎng)基至OD600值為0.5-1.5。培養(yǎng)基的接種可以通過引入來自CM平板的谷氨酸棒桿菌細胞的鹽懸浮液，或者通過加入該細菌的液體預(yù)培養(yǎng)物實現(xiàn)。實施例8突變蛋白質(zhì)功能的體外分析酶的活性和動力學(xué)參數(shù)的測定在技術(shù)上是已經(jīng)很好建立了的。任何對給定的經(jīng)過改變的酶的活性測定實驗，必須適合野生型酶的特殊活性，這完全在技術(shù)熟練者的能力之內(nèi)。關(guān)于酶的概括評論，以及關(guān)于結(jié)構(gòu)、動力學(xué)、原理、方法、應(yīng)用和確定許多酶活性實例的明確細節(jié)，可以在例如以下參考文獻中找到Dixon，M.，andWebb，E.C.，(1979)Enzymes.LongmansLondon；Fersht，(1985)EnzymeStructureandMechanism.FreemanNewYork；Walsh，(1979)EnzymaticReactionMechanisms.FreemanSanFrancisco；Price，N.C.，Stevens，L.(1982)FundamentalsofEnzymology.OxfordUniv.PressOxford；Boyer，P.D.，ed.(1983)TheEnzymes，3rded.AcademicPressNewYork；Bisswanger，H.，(1994)Enzymkinetik，2nded.VCHWeinheim(ISBN3527300325)；Bergmeyer，H.U.，Bergmeyer，J.，Graβl，M.，eds.(1983-1986)MethodsofEnzymaticAnalysis，3rded.，vol.I-XII，VerlagChemieWeinheim；andUllmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry(1987)vol.A9，“Enzymes”.VCHWeinheim，p.352-363。結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)的活性可以通過幾種技術(shù)上已知的方法測定，例如DNA條帶移位分析(也稱作凝膠阻滯分析)。這些蛋白質(zhì)對其他分子表達的作用，可以用報告基因分析測定(例如描述在Kolmar，H.etal.(1995)EMBOJ.143895-3904中的，及其引用的參考文獻)。報告基因測試系統(tǒng)是已知的，并且在原核和真核細胞中的應(yīng)用都已建立，使用像是beta-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白和幾種其他蛋白質(zhì)這樣的酶。膜轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)活性的測定可以根據(jù)例如描述在Gennis，R.B.(1989)“Pores，ChannelsandTransporters”，inBiomembrane，MolecularStructureandFunction，SpringerHeidelberg，p.85-137；199-234；and270-322中的那些技術(shù)進行。實施例9突變蛋白質(zhì)對于所需產(chǎn)物生產(chǎn)的效果的分析谷氨酸棒桿菌遺傳修飾對于所需化合物(例如氨基酸)生產(chǎn)的作用，可以這樣估計，即通過合適條件下(例如以上描述的那些)生長已修飾的微生物，并且分析增加所需產(chǎn)物(例如，氨基酸)生產(chǎn)的培養(yǎng)基和/或細胞組分。這些分析技術(shù)對于熟練常規(guī)技術(shù)者來說是熟知的，包括光譜分析、薄層層析、各種染色方法、酶促方法和微生物方法，以及像是高效液相色譜(Ullman，EncyclopediaofIndustrialChemistry，vol.A2，p.89-90andp.443-613，VCHWeinheim(1985)；Fallon，A.etal.，(1987)“ApplicationsofHPLCinBiochemistry”inLaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology，vol.17；Rehmetal.(1993)Biotechnology，vol.3，ChapterIII“Productrecoveryandpurification”，page469-714，VCHWeinheim；Belter，P.A.etal.(1988)Bioseparationsdownstreamprocessingforbiotechnology，JohnWileyandSons；Kennedy，J.F.andCabral，J.M.S.(1992)Recoveryprocessesforbiologicalmaterials，JohnWileyandSons；Shaeiwitz，J.A.andHenry，J.D.(1988)Biochemicalseparations，inUlmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry，vol.B3，Chapter11，page1-27，VCHWeinheim；andDechow，F(xiàn).J.(1989)Separationandpurificationtechniquesinbiotechnology，NoyesPublications)這樣的分析層析。除了對最終發(fā)酵產(chǎn)物的測定，也可以對用于所需化合物生產(chǎn)的代謝途徑的其他組分進行分析，例如中間體和副產(chǎn)物，以確定化合物的總生產(chǎn)效率。分析方法包括培養(yǎng)基中營養(yǎng)物水平(例如，糖類、烴、氮源、磷酸以及其他離子)的測定，生物量組成和生長的測定，生物合成途徑常見代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)的分析，以及對發(fā)酵中產(chǎn)生氣體的測定。這些測定的標(biāo)準(zhǔn)方法略述在AppliedMicrobialPhysiology，APracticalApproach，P.M.RhodesandP.F.Stanbury，eds.，IRLPress，p.103-163；and165-192(ISBN0199635773)及其引用的參考文獻中。實施例10谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)物中所需產(chǎn)物的純化從谷氨酸棒桿菌細胞中或者上述培養(yǎng)基的上清中回收所需產(chǎn)物，可以通過技術(shù)上已知的各種方法進行。如果所需產(chǎn)物不是細胞分泌的，那么可以通過低速離心從培養(yǎng)基中收集細胞，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)裂解細胞，例如機械力或者超聲波。離心除去細胞碎片，保留含有可溶蛋白的上清部分用于進一步純化所需化合物。如果產(chǎn)物是從谷氨酸棒桿菌細胞分泌的，那么用低速離心從培養(yǎng)基中除去細胞，保留上清部分用于進一步純化。任何一種純化方法得到的上清部分，用合適的樹脂進行層析，所需分子被層析樹脂保留，而樣品中的很多雜質(zhì)不被保留，或者雜質(zhì)被樹脂保留，而樣品不被保留。使用相同或者不同的層析樹脂，可以根據(jù)需要重復(fù)這一層析步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以非常熟練的選擇合適的層析樹脂，并且熟知這些樹脂對于待純化特定分子最有效的應(yīng)用。純化的產(chǎn)物可以用過濾或者超濾濃縮，并且貯存在產(chǎn)物穩(wěn)定性最大的溫度下。技術(shù)上已知的純化方法非常多，前述的純化方法并不意味著僅僅局限于此。這些純化方法描述在，例如Bailey，J.E.&Ollis，D.F.BiochmicalEngineeringFundamentals，McGraw-HillNewYork(1986)中。分離化合物的特性和純度，可以技術(shù)上的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)估計。這包括高效液相色譜(HPLC)、分光方法、染色方法、薄層層析、NIRS、酶促方法或者微生物方法。這些分析方法在以下文獻中有評論Pateketal.(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhovaetal.(1996)Biotekhnologiya1127-32；andSchmidtetal.(1998)BioprocessEngineer.1967-70.Ulmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry，(1996)vol.A27，VCHWeinheim，p.89-90，p.521-540，p.540-547，p.559-566，575-581andp.581-587；Michal，G.(1999)BiochemicalPathwaysAnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology，JohnWileyandSons；Fallon，A.etal.(1987)ApplicationsofHPLCinBiochemistryinLaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology，vol.17。實施例11本發(fā)明基因序列的分析序列比較和兩條序列之間同源性百分比的測定，是技術(shù)上已知的技術(shù)，可以使用數(shù)學(xué)運算法則完成，例如KarlinandAltschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-68中的運算法則，該運算法則在KarlinandAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-77中有修改。該運算法則被整合在Altschul，etal.(1990)J.Mol.Biol.215403-10中的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。BLAST核苷酸搜尋可以用NBLAST程序進行，score＝100，wotdlength＝12，可以得到與本發(fā)明MP核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜尋可以用XBLAST程序進行，score＝50，wordlength＝3，可以得到與本發(fā)明MP蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。出于比較的目的，為了獲得有間隙的序列對比，可以使用描述在Altschuletal.，(1997)NucleicAcidsRes.25(17)3389-3402中的GappedBLAST。當(dāng)使用BLAST和GappedBLAST程序時，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道對于特定的待分析序列如何優(yōu)化程序(例如，XBLAST和NBLAST)的參數(shù)。用于序列比較的另一個數(shù)學(xué)運算法則實例是，Meyers和Miller運算法則((1998)Comput.Appl.Biosci.411-17)。該運算法則被整合在ALIGN程序(2.0版)中，該程序是GCG序列序列對比軟件包的一部分。當(dāng)使用ALIGN程序比較氨基酸序列時，可以使用PAM120重量殘基表、間隙長度處罰12、間隙處罰4。其他的序列分析運算法則在技術(shù)上也是已知的，包括ADVANCE和ADAM，敘述在TorelliandRobotti(1994)Comput.Appl.Biosci.103-5中；和FASTA，敘述在PearsonandLipman(1998)P.N.A.S.852444-8中。兩條氨基酸序列之間的百分比同源性也可以使用GCG軟件包(http//WWW.gcg.com有提供)中的GAP程序?qū)崿F(xiàn)，使用Blosum62矩陣或者PAM250矩陣，間隙分量12、10、8、6或者4，長度分量2、3或者4。兩條核酸序列之間的百分比同源性可以使用GCG軟件包中的GAP程序?qū)崿F(xiàn)，使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，例如間隙分量50和長度分量3。本發(fā)明基因序列與Genbank中序列之間的比較分析，可以使用技術(shù)上已知的技術(shù)進行(參見，例如，BexevanisandOuellette，eds.(1998)BioinformaticsAPracticalGuidetotheAnalysisofGenesandProteins.JohnWileyandSonsNewYork)。本發(fā)明基因序列，通過三個步驟的方法與Genbank中的序列進行比較。在第一步中，對本發(fā)明的每一條序列相對Genbank中的核苷酸序列進行BLASTN分析(例如，本地序列對比分析)，保留最高的500個匹配作進一步分析。然后對這500個匹配作FASTA搜尋(例如，本地與全世界的組合序列對比分析，在其中對限定的序列區(qū)域進行序列對比)。接下來，對本發(fā)明的每條基因序列與FASTA的三個最高匹配，使用GCG軟件包中的GAP程序(使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù))進行全世界序列對比。為了得到正確結(jié)果，從Genbank選出的序列長度，使用技術(shù)上熟知的方法調(diào)節(jié)為查詢序列的長度。該分析的結(jié)果列在表4中。雖然這樣得到的結(jié)果，與對本發(fā)明每條基因相對于Genbank每條對照所進行的單獨GAP(全世界)分析得到的結(jié)果，是一致的，但是相對于大數(shù)據(jù)庫的GAP(全世界)分析來說，所需的計算時間大大減少。沒有得到截止值以上序列對比的本發(fā)明序列，在表4中表明，缺少序列對比信息。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠深一層的理解，在表4中列出的標(biāo)題“％homology(GPA)”下的GAP序列對比同源性百分比，是以歐洲數(shù)字格式列出的，其中‘，’代表十進制點。例如，該列中的值“40,345”代表“40.345％”。實施例12DNA微陣列的構(gòu)建和操作本發(fā)明的序列還可以用于DNA微陣列(DNA陣列的設(shè)計、方法和應(yīng)用技術(shù)上是熟知的，描述在，例如，Schena，M.teal.(1995)Science270467-470；Wodicka，L.etal.(1997)NatureBiotechnology151359-1367；DeSaizieu，A.etal.(1998)NatureBiotechnology1645-48；andDeRisi，J.L.etal.(1997)Science278680-686)的構(gòu)建和應(yīng)用。DNA微陣列使用固體或者可彎曲的支持物，包括硝酸纖維素、尼龍、玻璃、硅或者其他材料。核酸分子可以以有序的方式連接在表面。合適標(biāo)記之后，其他核酸或者核酸混合物可以與固定的核酸分子雜交，標(biāo)記可以用于監(jiān)控和測量確定區(qū)域雜交分子的單獨的信號強度。本方法允許同時定量適用的核酸樣品或者混合物中的全部或者所選擇核酸的相對或者絕對數(shù)量。因此，DNA微陣列允許多種(多至6800或者更多)類似核酸表達的分析(參見例如，Schena，M.(1996)BioEssays18(5)427-431)。本發(fā)明序列可以用于設(shè)計寡聚核苷酸引物，這些引物可以通過像聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)這樣的核酸擴增反應(yīng)擴增一條或者多條谷氨酸棒桿菌基因的確定區(qū)域。5’或者3’寡聚核苷酸引物或者合適連接體的選擇和設(shè)計，允許得到的PCR產(chǎn)物共價連接到上述支持介質(zhì)的表面(也描述在，例如，Schena，M.etal.(1995)Science270467-470)。核酸微陣列也可以通過如在Wodicka，Letal.(1997)NatureBiotechnology151359-1367中描述的原位寡聚核苷酸合成構(gòu)建。通過照相平板方法，可將矩陣中精確確定的區(qū)域暴露在光線中。保護基團是光不穩(wěn)定的，從而被激活并經(jīng)受核苷酸添加，但是被掩飾而見不到光的區(qū)域不進行任何修飾。接下來的保護和光激活循環(huán)，允許在確定位置不同寡聚核苷酸的合成。本發(fā)明確定的小區(qū)域可以在微陣列上通過固相寡聚核苷酸合成而合成。出現(xiàn)在樣品或者核苷酸混合物中的本發(fā)明核酸分子，可以與微陣列雜交。可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法標(biāo)記這些核酸分子。簡單的說，核酶分子(例如，mRNA分子或者DNA分子)可以通過與同位素或者熒光標(biāo)記的核苷酸結(jié)合而被標(biāo)記，例如，在逆轉(zhuǎn)錄或者DNA合成中。標(biāo)記核酸與微陣列的雜交有描述(例如在Schena，M.etal.(1995)supra；Wodicka，L.etal.(1997)，supra；andDeSaizieuA.etal.(1998)，supra中)。雜交分子的檢測和定量要適合特定的結(jié)合標(biāo)記。放射性標(biāo)記可被探測，例如，在Schena，M.etal.(1995)supra中描述的，熒光標(biāo)記也可以探測，例如使用Shalonetal.(1996)GemoneResearch6639-645的方法。如上所述，本發(fā)明序列在DNA微陣列中的應(yīng)用，允許不同的谷氨酸棒桿菌菌株或者其他棒桿菌的比較分析。例如，通過核酸陣列方法，可以促進基于個別轉(zhuǎn)錄分部圖的菌株內(nèi)改變的研究，以及促進對特定和/或所需的像是致病性、生產(chǎn)能力和壓力承受能力這樣的菌株性質(zhì)重要的基因的鑒定。同樣，使用核酸陣列技術(shù)，也可以比較發(fā)酵反應(yīng)過程中本發(fā)明基因表達的分部圖。實施例13細胞蛋白質(zhì)群體動力學(xué)的分析(蛋白質(zhì)組學(xué))本發(fā)明的基因、組成和方法，可以用于研究蛋白質(zhì)群體的相互作用和動力學(xué)，稱作“蛋白質(zhì)組學(xué)”。感興趣的蛋白質(zhì)群體包括，但是不局限于，谷氨酸棒桿菌的全部蛋白質(zhì)群體(例如，和其他生物體的蛋白質(zhì)群體比較起來)，在特殊環(huán)境或者代謝條件下(例如，發(fā)酵中、高溫或者低溫、或者高pH或低pH)有活性的那些蛋白質(zhì)，或者在特定生長或者發(fā)育階段有活性的那些蛋白質(zhì)。可以用各種熟知的技術(shù)分析蛋白質(zhì)群體，例如凝膠電泳。細胞蛋白質(zhì)可以通過例如裂解或者提取獲得，也可以使用各種電泳技術(shù)彼此分離。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，很大程度上基于它們的分子重量。等電聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳(IEF-PAGE)通過等點點(這不僅反映了氨基酸序列，而且放映了蛋白質(zhì)的翻譯后修飾)分離蛋白質(zhì)。另一種更加優(yōu)選的蛋白質(zhì)分析方法是，IEF-PAGE和SDS-PAGE的連續(xù)結(jié)合，稱為2-D-凝膠電泳(在例如Hermannetal.(1998)Electrophoresis193217-3221；Fountoulakisetal.(1998)Electrophoresis191193-1202；Langenetal.(1997)Electrophoresis181184-1192；Antelmannetal.(1997)Electrophoresis181451-1463中有描述)。用這些方法分離的蛋白質(zhì)可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)顯現(xiàn)，例如通過染色或者標(biāo)記。合適的染色在技術(shù)上是已知的，包括考馬斯亮藍、銀染或者熒光染料，例如SyproRuby(MolecularProbes)。谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)基中包含有放射性標(biāo)記的氨基酸或者其他蛋白質(zhì)前體(例如，35S-甲硫氨酸，35S-半胱氨酸，14C-標(biāo)記氨基酸，15N-氨基酸，15NO3或者15NH4+或者13C-標(biāo)記氨基酸)，可以使得這些細胞在其蛋白質(zhì)分離之前就標(biāo)記蛋白質(zhì)。類似的，也可以使用熒光標(biāo)記。根據(jù)前述技術(shù)可以提取、隔離和分離這些標(biāo)記蛋白質(zhì)。用這些技術(shù)顯現(xiàn)的蛋白質(zhì)，可以通過測量所用的染料或者標(biāo)記作進一步分析。特定蛋白質(zhì)的數(shù)量可以使用例如光學(xué)方法，進行定量確定，并且可以與在同一塊凝膠上或者其他凝膠上的其他蛋白質(zhì)的數(shù)量進行比較?？梢酝ㄟ^例如光學(xué)比較、分光分析、凝膠圖象分析和掃描，或者通過使用照相膠片或者顯示器，對凝膠上的蛋白質(zhì)進行比較。這些技術(shù)在技術(shù)上是熟知的。為了確定特定蛋白質(zhì)的特性，可以使用直接序列測定或者其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。例如，可以使用N-和/或C-末端氨基酸測序(例如Edman降解)，以及質(zhì)譜分析(特別是MALDI或者ESI技術(shù)(參見例如，Langenetal.(1997)Electrophoresis181184-1192))。此處提供的蛋白質(zhì)序列，可以用作通過這些技術(shù)進行的谷氨酸棒桿菌蛋白質(zhì)鑒定。通過這些技術(shù)得到的信息，可以用于比較蛋白質(zhì)存在、活性、不同生物條件下(例如，在其他條件中的不同生物體、發(fā)酵時間點、培養(yǎng)基條件、或者生物環(huán)境)不同樣品間修飾的各種模式。這些試驗得到的數(shù)據(jù)，可以單獨的，或者與其他技術(shù)相結(jié)合的用于各種應(yīng)用，例如比較特定情況下(例如代謝情況)各種生物體的行為，增加生產(chǎn)精細化學(xué)物質(zhì)的菌株的生產(chǎn)能力，或者增加精細化學(xué)物質(zhì)生產(chǎn)的效率。等同聲明本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識到，或者能夠確定僅僅使用常規(guī)實驗，此處描述的本發(fā)明的特定實施方案有很多等價物。下面的權(quán)利要求意圖包含這些等價物。權(quán)利要求1.分離的核酸分子，該分子包含SEQIDNO449列出的核苷酸序列或其互補序列。2.分離的編碼多肽的核酸分子，該多肽包含SEQIDNO450列出的氨基酸序列或其互補序列。3.分離的編碼多肽的天然存在等位基因變體的核酸分子，該多肽包含SEQIDNO450列出的氨基酸序列或其互補序列。4.分離的含有核苷酸序列的核酸分子，該序列與SEQIDNO449列出的完整核苷酸序列或其互補序列有至少50％的同一性。5.分離的核酸分子，該核酸分子編碼包含與SEQIDNO450列出的完整氨基酸序列具有至少50％的同一性的氨基酸序列。6.分離的含有SEQIDNO449列出的核苷酸序列或其互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的核酸分子。7.分離的核酸分子，該核酸分子包括權(quán)利要求1-6中任一項的核酸分子和編碼異源多肽的核苷酸序列。8.包含權(quán)利要求1-7中任一項的核酸分子的載體。9.權(quán)利要求8的載體，該載體是表達載體。10.權(quán)利要求9的表達載體轉(zhuǎn)染的分離的宿主細胞。11.權(quán)利要求10的宿主細胞，其中該細胞來源于微生物。12.權(quán)利要求11的宿主細胞，其中該細胞屬于棒桿菌屬或者短桿菌屬。13.權(quán)利要求10的宿主細胞，其中所說的核酸分子的表達，導(dǎo)致該細胞精細化學(xué)物質(zhì)生產(chǎn)的調(diào)節(jié)。14.權(quán)利要求13的宿主細胞，其中所說的精細化學(xué)物質(zhì)選自下列物質(zhì)有機酸，蛋白質(zhì)源氨基酸，非蛋白質(zhì)源氨基酸，嘌呤堿基和嘧啶堿基，核苷，核苷酸，脂質(zhì)，飽和和不飽和脂肪酸，二醇，糖類，芳香族化合物，維生素，輔因子，聚酮化合物和酶。15.生產(chǎn)多肽的方法，包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求10的宿主細胞，從而生產(chǎn)多肽。16.分離的含有SEQIDNO450列出的氨基酸序列的多肽。17.分離的含有包含SEQIDNO450列出的氨基酸序列的多肽的天然存在等位基因變體的多肽。18.分離的由核酸分子編碼的多肽，該核酸分子包含的核苷酸序列與SEQIDNO449列出的完整核酸序列有至少50％的同一性。19.分離的多肽，該多肽包含的氨基酸序列與SEQIDNO450列出的完整氨基酸序列有至少50％的同一性。20.分離的多肽，該多肽包含含有SEQIDNO450的氨基酸序列的多肽的片段，其中所述多肽片段保持酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性。21.分離的多肽，由包含SEQIDNO449列出的核苷酸序列的核酸分子編碼。22.權(quán)利要求16-21中任一項的分離的多肽，進一步包含異源氨基酸序列。23.生產(chǎn)精細化學(xué)物質(zhì)的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求10的細胞，從而產(chǎn)生精細化學(xué)物質(zhì)。24.權(quán)利要求23的方法，其中所說的方法另外包括從所說的培養(yǎng)物中回收精細化學(xué)物質(zhì)的步驟。25.權(quán)利要求23的方法，其中所說的細胞屬于棒桿菌屬或者短桿菌屬。26.權(quán)利要求23的方法，其中所說的細胞選自谷氨酸棒桿菌、力士棒桿菌、百合花棒桿菌、嗜乙酰乙酸棒桿菌、醋谷棒桿菌、嗜乙酰棒桿菌、產(chǎn)氨棒桿菌、Corynebacteriumfujiokense、Corynebacteriumnitrilophilus、產(chǎn)氨短桿菌、Brevibacteriumbutanicum、分歧短桿菌、黃色短桿菌、希氏短桿菌、酮戊二酸短桿菌、Brevibacteriumketosoreductum、乳發(fā)酵短桿菌、擴展短桿菌、解石蠟短桿菌和表3所列菌株。27.權(quán)利要求23的方法，其中所說載體的核酸分子的表達，導(dǎo)致該細胞精細化學(xué)物質(zhì)生產(chǎn)的調(diào)節(jié)。28.權(quán)利要求23的方法，其中所說的精細化學(xué)物質(zhì)選自下列物質(zhì)有機酸，非蛋白質(zhì)源氨基酸，嘌呤堿基和嘧啶堿基，核苷，核苷酸，脂質(zhì)，飽和和不飽和脂肪酸，二醇，糖類，芳香族化合物，維生素，輔因子，聚酮化合物和酶。29.權(quán)利要求23的方法，其中所說的精細化學(xué)物質(zhì)是氨基酸。30.權(quán)利要求29的方法，其中所說的氨基酸選自下列氨基酸賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、組氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸。31.生產(chǎn)精細化學(xué)物質(zhì)的方法，包括培養(yǎng)這樣的細胞，該細胞的基因組DNA由于導(dǎo)入了權(quán)利要求1-7中任一項的核酸分子而改變。32.診斷受試者中白喉棒桿菌的存在或者活性的方法，包括檢測受試者中權(quán)利要求1-6的核酸分子或權(quán)利要求16-21的多肽分子中至少一種物質(zhì)的存在，從而診斷受試者中白喉棒桿菌的存在或者活性。33.含有SEQIDNO449列出的核酸分子的分離的宿主細胞，其中的核酸分子被破壞。34.含有SEQIDNO449列出的核酸分子的分離的宿主細胞，其中的核酸分子含有一個或者多個與SEQIDNO449列出的序列相比的核酸修飾。35.含有SEQIDNO449列出的核酸分子的分離的宿主細胞，其中該核酸分子調(diào)節(jié)區(qū)域相對于該分子野生型調(diào)節(jié)區(qū)域進行了修飾。全文摘要本發(fā)明涉及編碼代謝途徑蛋白的谷氨酸棒桿菌基因。描述了分離的編碼新的谷氨酸棒桿菌MP蛋白的核酸分子，該分子被稱為MP核酸分子。本發(fā)明也提供了反義核酸分子，含有MP核酸分子的重組表達載體，以及已導(dǎo)入表達載體的宿主細胞。本發(fā)明也進一步提供了分離的MP蛋白，MP突變蛋白，融合蛋白質(zhì)，抗原肽，以及基于谷氨酸棒桿菌MP基因遺傳工程提高由該生物體進行的所需化合物生產(chǎn)的方法。文檔編號C12Q1/68GK101082049SQ20071000515公開日2007年12月5日申請日期2000年6月23日優(yōu)先權(quán)日1999年6月25日發(fā)明者M·波姆佩朱斯,B·克雷格爾,H·施雷德,O·策爾德,G·哈貝豪爾申請人:Basf公司