活細胞水平上改變基因啟動子內(nèi)特定順式作用元件甲基化修飾水平的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及活細胞水平上改變基因啟動子內(nèi)特定順式作用元 件甲基化修飾水平的方法。
【背景技術】
[0002] 膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell -line derived neurotrophic factor，⑶NF)屬于轉化生長因子（TGF-β)超家族成員，是一種新型的神經(jīng)營養(yǎng)因子，其基 因序列首次從大鼠 B49膠質(zhì)細胞系中克隆獲得。在人類細胞中，GDNF為單拷貝基因，位于 5號染色體pl2-pl3. 1區(qū)，含有2個啟動子和6個外顯子，其中啟動子I區(qū)位于第IV外顯子 上游；啟動子II區(qū)位于第I外顯子上游，含有兩個增強子、兩個沉默子，且存在多個轉錄因 子結合位點，在轉錄起始上發(fā)揮主要作用。近來的研宄發(fā)現(xiàn)，GDNF與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密 切相關，作為膠質(zhì)瘤細胞強有力的促增殖和迀移因子，它在膠質(zhì)瘤細胞中的表達量顯著高 于正常膠質(zhì)細胞（蛋白表達水平升高約5倍）。最近的研宄表明，GDNF基因異常高表達主 要受轉錄水平的調(diào)控 [8]，但其轉錄上調(diào)的分子機制至今仍不清楚。
[0003] 基因的異常高轉錄通常由基因突變或表觀遺傳修飾改變而引發(fā)。我們前期的研宄 發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤細胞中，GDNF基因的DNA拷貝數(shù)以及啟動子、編碼區(qū)的序列都未發(fā)生改變， 表明⑶NF基因的異常高轉錄與基因突變無關。mi等的研宄顯示：⑶NF基因5'端發(fā)生的甲 基化修飾能夠促進腦組織發(fā)育及神經(jīng)的發(fā)生與增殖，與⑶NF基因表達上調(diào)的生物學作用 相似。此外，研宄表明，膠質(zhì)瘤細胞中基因啟動子區(qū)甲基化程度改變能夠調(diào)節(jié)該基因的轉錄 水平，由此我們推測GDNF基因啟動子區(qū)可能發(fā)生了甲基化修飾的改變，并且這種改變參與 了膠質(zhì)瘤細胞中該基因的高轉錄調(diào)控。最近，我們的研宄證實了以上推測，發(fā)現(xiàn)與正常腦組 織相比，不同級別膠質(zhì)瘤組織中GDNF基因啟動子II區(qū)內(nèi)沉默子、增強子等順式作用元件的 DNA甲基化修飾水平發(fā)生了不同程度的改變（增強子甲基化水平下降，沉默子甲基化水平 上升），且這種改變影響了轉錄因子與之的結合，進一步的體外細胞實驗表明GDNF基因啟 動子II區(qū)甲基化水平與該基因的轉錄水平直接相關。然而，啟動子II區(qū)中各種順式作用 元件甲基化修飾改變在調(diào)節(jié)GDNF基因高轉錄過程中所貢獻的份額是多少？至今我們還不 清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種活細胞水平上改變基因啟動子內(nèi)特定順式作用元件甲 基化修飾水平的方法。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供該方法在探討同一啟動子內(nèi)不同順式作用元件甲基化 修飾水平變化對基因轉錄活性的影響中的應用。
[0006] 本發(fā)明的目的可通過以下技術方案實現(xiàn)：
[0007] 活細胞水平上改變基因啟動子內(nèi)特定順式作用元件甲基化修飾水平的方法，包含 以下步驟：
[0008] (1)構建目的基因野生型啟動子熒光素酶載體：合成基因野生型啟動子，將其克 隆到熒光素酶載體中，獲得目的基因野生型啟動子熒光素酶載體；
[0009] (2)構建帶有特定限制性內(nèi)切酶位點的目的基因突變型啟動子熒光素酶載體：以 目的基因野生型啟動子熒光素酶載體為模板，利用基因定點突變和拼接PCR法，獲得了目 的基因突變型啟動子序列，使該啟動子內(nèi)各順式作用元件兩端都帶有甲基化不敏感的單一 限制性內(nèi)切酶位點，將該突變啟動子克隆至熒光素酶載體獲得帶有特定限制性內(nèi)切酶位點 的目的基因突變型啟動子熒光素酶載體；
[0010] (3)目的基因啟動子區(qū)不同順式作用元件的甲基化修飾：利用目的基因突變型啟 動子區(qū)各順式作用元件兩端特定的甲基化不敏感的單一限制性內(nèi)切酶位點對應的內(nèi)切酶 大量雙酶切帶有特定限制性內(nèi)切酶位點的目的基因突變型啟動子熒光素酶載體，分別純化 回收載體骨架和各順式作用元件，隨后利用CpG甲基轉移酶對各順式作用元件進行甲基化 處理，并通過T4連接酶將甲基化的各順式作用元件分別接回相應的熒光素酶載體骨架上， 獲得基因啟動子區(qū)僅特定順式作用元件高甲基化（>90%)的環(huán)形熒光素酶質(zhì)粒。
[0011] 其中，所述的啟動子內(nèi)各順式作用元件優(yōu)選包括整個啟動子、增強子、沉默子和核 心啟動子；所述的CpG甲基轉移酶優(yōu)選M. SssI (高度甲基化處理），M. Hpa I (中度甲基化處 理）或M. Hpa II (低度甲基化處理）；進一步優(yōu)選M. SssI (高度甲基化處理）。
[0012] 所述的方法，還優(yōu)選包括將步驟（3)獲得的基因啟動子區(qū)僅特定順式作用元件高 甲基化（>90% )的環(huán)形熒光素酶質(zhì)粒直接轉染U251細胞，進行熒光素酶報告基因檢測，分 析各順式作用元件甲基化對基因啟動子啟動活性的影響。
[0013] 所述的基因啟動子區(qū)僅特定順式作用元件高甲基化（>90% )的環(huán)形熒光素酶質(zhì) 粒優(yōu)選包括沉默子高甲基化且增強子和核心啟動子未甲基化的基因啟動子區(qū)環(huán)形質(zhì)粒、增 強子高甲基化且沉默子和核心啟動子未甲基化的基因啟動子區(qū)環(huán)形質(zhì)粒、核心啟動子高甲 基化且沉默子和增強子未甲基化的基因啟動子區(qū)環(huán)形質(zhì)粒、全啟動子高甲基化的基因啟動 子區(qū)環(huán)形質(zhì)粒。
[0014] 所述的甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶位點選自KpnI、SacI、MluI、XhoI、BglII和 HindIII0
[0015] 所述的熒光素酶載體為pGL3-basic載體。
[0016] 所述的基因啟動子優(yōu)選⑶NF基因啟動子II區(qū)（-1300/+149bp)。
[0017] 所述的方法，進一步優(yōu)選包含以下步驟：
[0018] (1)利用全基因合成技術，合成5'端添加了 Kpn I酶切位點，3'端添加了 Hind III酶切位點的人類⑶NF基因啟動子II區(qū)序列（-1300/+149bp)，所述的⑶NF基因啟動 子II區(qū)序列在GenBank中序列號為AF053749 ;將其TA克隆至pMD19T-simple載體，經(jīng)雙酶 切和測序鑒定成功后，命名為 pMD19T_GDNF-promoter Il-wt ;利用 pMD19T_GDNF-promoter Il-wt載體將⑶NF基因野生型啟動子II區(qū)片段亞克隆至pGL3-Basic載體中，測序驗證獲 得含有⑶NF基因野生型啟動子II區(qū)熒光素酶載體pGL3-GDNF-promoter Il-wt ;
[0019] (2)通過PCR突變引物在整個啟動子II、增強子II、沉默子II和核心啟動 子II兩端引入甲基化不敏感的單一酶切位點，經(jīng)兩輪PCR獲得突變型GDNF基因啟動 子II區(qū)序列；將獲得的突變型⑶NF基因啟動子II區(qū)序列克隆到pMDIOT-simple載 體，命名為pMD19T-GDNF-promoterII-mt，隨后亞克隆至pGL3_basic載體中，命名為 pGL3-GDNF-promoter II-mt ；
[0020] (3)利用突變型⑶NF基因啟動子II區(qū)不同順式作用元件兩端對應的甲基化不敏 感的單一限制性內(nèi)切酶，對pGL3-GDNF-promoter II-mt質(zhì)粒進行雙酶切處理，經(jīng)瓊脂糖電 泳分離后分別回收載體骨架和對應的順式作用元件片段；利用M. SssI分別對回收的GDNF 基因啟動子II區(qū)的各個順式作用元件序列進行甲基化處理，并通過T4連接酶將其接回相 應的熒光素酶載體骨架上。通過凝膠電泳的方式分離連接組分，并回收迀移速率較快的環(huán) 形質(zhì)粒DNA，BSP檢驗環(huán)形質(zhì)粒DNA中⑶NF基因啟動子II區(qū)各順式作用元件的甲基化水 平；
[0021] (4)將上一步獲得的GDNF基因啟動子區(qū)僅特定順式作用元件高甲基化的環(huán)形熒 光素酶質(zhì)粒直接轉染U251細胞，48h后進行熒光素酶報告基因檢測，分析各順式作用元件 甲基化對GDNF基因啟動子II區(qū)啟動活性的影響。
[0022] 其中，步驟⑵所述的兩輪PCR獲得突變型GDNF基因啟動子II區(qū)序列的具體 方法為：以野生型pMD19T-GDNF_promoter Il-wt載體為模版，分別以⑶NF-Kpn I-wt-Fl/ GDNF-Sac I-mu-(-1165)-R， GDNF-Sac I-mu-(-1165)-F/GDNF-Mlu I-mu-(-329)-R， ⑶NF-Mlu I-mu-(-329)-F/⑶NF-Xho I-mu-(-189)-R，⑶NF-Xho I-mu-(-189)-F/⑶NF-Bgl II-mu-(+45)-R，⑶NF-Bg I II-mu-(+45)-F/GDNF-Hind III-wt-R24為引物，PCR擴增5段帶 有重復序列的特異性產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用AXGGEN膠回收試劑盒回收目 的片段。以回收的5條PCR產(chǎn)物為模板，⑶NF-Kpn Iit-Fl和⑶NF-Hind III-wt-R24為引 物，PCR擴增獲得突變型⑶NF基因啟動子II區(qū)序列；所述的⑶NF-KpnI-wt-Fl序列如SEQ ID NO. 1 所示，GDNF-HindIII-wt-R24 序列如 SEQ ID NO. 2 所示，GDNF-SacI-mt-(-1165)-F 序列如 SEQ ID N0.3 所示，⑶NF-SacI-mt-(-1165)-R 序列如 SEQ ID N0.4 所示， ⑶NF-MluI-mt-(-329)-F 序列如 SEQ ID N0·5所示，⑶NF-MluI-mt-(-329)-R序列如SE