β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的涉及一種β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] β -葡聚糖是一種結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖，廣泛存在于禾本科植物（黑麥、大麥、小麥、 燕麥和稻谷）的胚乳細(xì)胞及糊粉層中。物種不同，β-葡聚糖的含量及其所占比例會有很 大區(qū)別；在相同物種中，其含量也會因生長環(huán)境的不同而有所差異。
[0003] 廣義的β-葡聚糖酶是指一類能分解由β-糖苷鍵連接構(gòu)成的D-葡萄糖 聚合物的酶系，主要包括昆布多糖酶（EC. 3. 2. 1.6)、β-葡聚糖苷酶（EC. 3. 2. 1.21)、 纖維素酶（EC. 3. 2. 1.4)、內(nèi)切-β-1，2-葡聚糖酶（EC. 3. 2. 1.71)內(nèi)切β-1，3-葡聚 糖酶（EC. 3. 2. 1.39)、外切 β-1，3-葡聚糖酶（EC. 3. 2. 1.58)、內(nèi)切 β-1，4-葡聚糖 酶（EC. 3. 2. 1.4)、內(nèi)切 β-1，3-1，4-葡聚糖酶（EC. 3. 2. 1.73)、外切 β-1，4-葡聚糖酶 (EC. 3. 2. 1.74)和內(nèi)切β-1，6-葡聚糖酶（EC. 3. 2. 1.75)，在所有這些酶中以β-1，3-1， 4-D-葡聚糖酶（又稱地衣多糖酶）活性最高。
[0004] 狹義的β-葡聚糖酶專指內(nèi)切β-1，3-1，4-葡聚糖酶，其底物為β-1，3和β-1，4 混和糖苷鍵連接的內(nèi)切β-D-葡聚糖。水解內(nèi)切β-D-葡聚糖時(shí)，內(nèi)切β-1，3-1，4-葡聚糖 酶內(nèi)切水解與3-0-吡喃葡萄糖連接的β-1，4糖苷鍵，其產(chǎn)物主要為纖維三糖（3-Ο-β-纖 維二糖-D-吡喃葡萄糖）和纖維四糖（3-0- β -纖維三糖-D-吡喃葡萄糖）。
[0005] β-1，3-1，4-葡聚糖酶是一種重要的工業(yè)用酶，目前主要應(yīng)用于啤酒釀造和飼料 工業(yè)中，近年其在生物防治方面的應(yīng)用受到人們越來越多的關(guān)注。姚烏蘭等首次報(bào)道了多 粘類芽孢桿菌WYllO β -1，3-1，4-葡聚糖酶具有抗稻瘟病菌的特性。以提取的WYllO菌株 基因組DNA為模板進(jìn)行了基因克隆和表達(dá)，為葡聚糖酶在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用開辟了新的研 宄領(lǐng)域。文鳳云等研宄發(fā)現(xiàn)自-1，3-1，4-葡聚糖酶是多粘類芽孢桿菌0?7菌株抗真菌的 活性組分或其中之一，為葡聚糖酶在生物防治方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。金志雄等 [56]報(bào) 道，內(nèi)生枯草芽孢桿菌SWB8分泌的β -1，3-1，4-葡聚糖酶具有抗菌和抗腫瘤細(xì)胞的活性， 為抗菌和高效低毒的抗腫瘤藥物的研宄提供支持。
[0006] 生物防治是解決病原真菌耐藥性、環(huán)境污染等問題的有效方法。目前研宄與應(yīng)用 涉及較多的是微生物菌體，但是微生物菌體的應(yīng)用易受環(huán)境條件和菌劑保質(zhì)期的限制，在 實(shí)際生產(chǎn)中防效不穩(wěn)、效果不夠理想。而許多拮抗菌分泌的抑菌蛋白可以在體外抑制或殺 死有害微生物，如果能夠分離出抑菌蛋白及其編碼序列，這對運(yùn)用基因工程的手段開發(fā)新 型生物保鮮劑將會很有價(jià)值和意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種β-1，3_1，4-葡聚糖酶基因及其應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明 的目的，擬采用如下技術(shù)方案。
[0008] 本發(fā)明一方面涉及一種β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，其特征在于所述的基因核苷 酸序列為SEQ ID NO. L
[0009] 本發(fā)明另一方面涉及β-1，3_1，4-葡聚糖酶，其特征在于所述的酶的氨基酸序列 為 SEQ ID NO. 2.
[0010] 本發(fā)明另一方面還涉及上述β-1，3-1，4-葡聚糖酶的應(yīng)用，所述的應(yīng)用是抗梨黑 斑病中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的酶可以顯著地控制梨鏈格孢霉孢子的萌發(fā)和芽管的伸長，并對菌絲生長 具有破壞作用。通過在梨果上損傷接種和直接噴施重組酶及病原菌的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：接種重組 酶后梨果的病斑直徑小于只接種病原菌的病斑直徑，且腐爛程度也明顯低于對照；梨果經(jīng) 酶液處理后，發(fā)病率為37. 61 %，防病效果為66. 25%，相較于現(xiàn)有的β -1，3-1，4-葡聚糖酶 具有更好的防治效果。
[0012] 微生物信息
[0013] 本發(fā)明所篩選的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)J18已經(jīng)保藏于中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 3665,保藏地址為：北京市朝陽 區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所，保藏日期為2010年03月12日。
【附圖說明】
[0014] 圖1 :重組蛋白的Western Blot檢測
[0015] 圖2 !SDS-PAGE分析純化后的重組蛋白
[0016] M :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，2 :親和純化后的重組蛋白
[0017] 圖3 :重組酶對梨鏈格孢霉菌絲的抑制作用
[0018] 圖4 :重組酶在PDA平板上對梨鏈格孢霉的抑制
[0019] 圖5 :重組酶對梨黑斑病的防治
[0020] 左：重組酶；右：對照（無菌水）
[0021] 圖6 :重組酶對梨黑斑病的防治效果
[0022] 左：對照（只噴施病原菌）；右：重組酶處理
[0023] 圖7 :溫度對抑菌效果的影響
[0024] 圖8 :pH對抑菌效果的影響
[0025] 圖9 :光照對抑菌效果的影響
【具體實(shí)施方式】 [0026] 實(shí)施例1
[0027] 1.菌株的分離
[0028] 從四川成都梨果園土樣中篩選到一株枯草芽孢桿菌（Bacillus substilis)J18， 該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，中國微生物菌種保藏中心 登記編號 CGMCC No. 8343。
[0029] 2.試驗(yàn)方法
[0030] 2.1引物的設(shè)計(jì)與合成
[0031] 通過在GenBank文庫中進(jìn)行序列查找與同源性比對，根據(jù)已登錄的β-1，3-1， 4-葡聚糖酶的基因序列及表達(dá)載體pET28a(+)的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，在正反向引物5'端 分別引入BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)，并加入相應(yīng)的保護(hù)性堿基，由上海生物工程公司合成。
[0032] 引物序列如下：
[0033] 上游引物 Gl :5，-CGGGATCCATGCAAACAGGTGGATCG-3，
[0034] 下游引物 G2 :5' -CCGCTCGAGGCTTATTTTTTTGTATAGCGCACCC-3 '
[0035] 2. 2 β-1，3-1，4-匍聚糖酶基因的克隆
[0036] 2. 2. 1枯草芽孢桿菌（B. substilis) J18基因組DNA的提取
[0037] 對枯草芽孢桿菌J18基因組DNA進(jìn)行提取，按照試劑盒說明書進(jìn)行。具體步驟如 下：
[0038] (1)將枯草芽孢桿菌J18以1% (V/V)的接種量接種于LB培養(yǎng)基，在37°C條件下、 200r/min振蕩過夜培養(yǎng)。吸取IOmL菌液5000r/min離心lOmin，保留菌體。
[0039] (2)用 STE(lmM EDTA，pH8. O ;10mM Tris-HCl，pH8. O ;0· IM NaCl)洗滌一次， 5000r/min 離心 lOmin，棄上清。
[0040] (3)力卩 4mL TE(lmmol/L EDTA，pH8. 0 ;10mmol/L Tris-HCl，pH8. 0)懸浮沉淀，并加 8 μ L 溶菌酶溶液（50mg/mL)，37°C 靜置 20min。
[0041] (4)加 10 yL Rnase(10mg/mL)，再加入 0· 5mL 的 10% SDS 溶液，37°C靜置 30min。
[0042] (5)加 10以1^蛋白酶1((2〇11^/1^)，37°〇靜置6〇1^11。
[0043] (6)加入相同體積的Tris-飽和酷溶液，混勾，8000r/min離心5min，吸取上清轉(zhuǎn)移 至新的I. 5mLEP管中。
[0044] (7)向上清液中加入相同體積的酷：氯仿，混勾，8000r/min離心5min，吸取上清轉(zhuǎn) 移至新的1.5mLEP管中。
[0045] (8)向上清液中加入1/5體積、濃度為10mol/L的醋酸按和2倍體積無水乙醇，顛 倒混合，靜置l〇min，離心沉淀DNA。用70%乙醇洗滌，吸干，加500 μ LTE溶解DNA，-20°C保 存。
[0046] 2. 2. 2 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因 PCR擴(kuò)增
[0047] 以提取的枯草芽孢桿菌（B. subtilis) J18的基因組DNA為模板，Gl和G2為引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在0. 2mL的PCR小管中加入以下成分。
[0048] PCR反應(yīng)體系（20 μ L)如下：
[0049] 模板 Ιμ? IOxPCRbuffer 2\xb 上游引物σ?(10μΜ) ΙμΙ 下游引物G2(10pM) Ιμ? dNTP(2.5mM) 2\iL· pfii 酶(5U/pL) 0.2μ? (MH2O 12.8μ?
[0050] PCR 擴(kuò)增程序：95°C 5min ;95°C 45s，61°C 50s，72°C 90s，共進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié) 束后，72°C延伸IOmin ;4°C保存。I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0051] 2. 2. 3瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物
[0052] (1)1.0%瓊脂糖凝膠制備
[0053] 將0. 2g瓊脂糖加入到20mL的I X TAE緩沖液（PH8. 0)中，混勻以后放入微波爐 中加熱，直至瓊脂糖全部溶解。待瓊脂糖冷卻以后，溫度大約為40 °C -60 °C，吸取I yL的 Gelred染料加入瓊脂糖后混勻。選取適當(dāng)?shù)氖嶙硬宓街颇z板上，把融化的瓊脂糖倒入制膠 槽中。待膠完全凝固后，小心拔去梳子，將帶有瓊脂糖凝膠的電泳板放入電泳槽中。
[0054] (2)上樣：取5 yL PCR產(chǎn)物和I yL6XDNA Buffer，混勾，加到點(diǎn)樣孔里。
[0055] (3)電泳：在穩(wěn)定電壓90V條件下電泳30min。
[0056] (4)成像：將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。切下擴(kuò)增目的基因片段 的膠。
[0057] 2.2.4目的基因片段的回收
[0058] 將PCR擴(kuò)增目的基因片段的膠用小量膠回收試劑盒進(jìn)行回收，實(shí)驗(yàn)具體方法參 照試劑盒的說明書。通過1. 〇%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收情況，來估計(jì)DNA濃度
[0059] 2. 2. 5目的基因片段與克隆載體pMD18-T的連接
[0060] 按照TaKaRa (大連）公司的T-A克隆載體連接試劑盒說明書步驟將目的基因片段 與克隆載體PMD18-T連接。
[0061] 連接體系（5 μ L)如下：
[0062] 回收目的基因片段 1?3yL
[0063] pMD18-T IyL
[0064] CldH2O 補(bǔ)足到 5 μ L
[0065] 離心混勻，16°C過夜連接。
[0066] 2. 2. 6大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0067] (1)取_80°C凍存的菌株于固體LB平板上劃線，37°C培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；
[0068] (2)挑取平板上生長良好的單菌落，接種于3mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C， 200r/min振蕩過夜培養(yǎng)；
[0069] (3)取ImL的菌液接種于50mL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200r/m