黃花蒿黃烷酮3-羥化酶基因AaF3HY及其編碼蛋白與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃花蒿黃烷酮3-羥化酶基因 AaF3HY及其編碼蛋白與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃花蒿（Artemisia annua L.)又名臭蒿，為菊科（Asteraceae)蒿屬（Artemisia) 植物，黃花蒿葉、花和莖中含有豐富的黃酮類化合物。黃酮類化合物（flavonoids)是一類 存在于自然界的、具有2-苯基色原酮（flavone)結(jié)構(gòu)的化合物，其中包括黃酮的同分異構(gòu) 體及其氫化的還原產(chǎn)物，也即以C6-C3-C6為基本碳架的一系列化合物。天然黃酮類化合物 母核上常含有羥基、甲氧基、烴氧基、異戊烯氧基等取代基。由于這些助色團(tuán)的存在，使該類 化合物多顯黃色。它們分子中有一個(gè)酮式羰基，第一位上的氧原子具堿性，能與強(qiáng)酸成鹽， 其羥基衍生物多具黃色，故又稱黃堿素或黃酮。根據(jù)三碳鍵（C3)結(jié)構(gòu)的氧化程度和B環(huán)的 連接位置等特點(diǎn)，黃酮類化合物可分為下列幾類：黃酮和黃酮醇；黃烷酮（又稱二氫黃酮） 和黃烷酮醇（又稱二氫黃酮醇）；異黃酮；異黃烷酮（又稱二氫異黃酮）；查耳酮；二氫查耳 酮；橙酮（又稱澳咔）；黃烷和黃烷醇；黃烷二醇（3,4)(又稱白花色苷元）。黃酮類化合物 在植物體中通常與糖結(jié)合成苷類，小部分以游離態(tài)（苷元）的形式存在。
[0003] 絕大多數(shù)植物體內(nèi)都含有黃酮類化合物，它在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、開(kāi)花、結(jié)果以及 抗菌防病等方面起著重要的作用。黃酮類化合物中有藥用價(jià)值的化合物很多，如原珍向天 果、槐米中的蘆丁和陳皮中的陳皮苷，能降低血管的脆性，及改善血管的通透性、降低血脂 和膽固醇，用于防治老年高血壓和腦溢血。由銀杏葉制成的舒血寧片含有黃酮和雙黃酮類， 用于冠心病、心絞痛的治療。全合成的乙氧黃酮又名心脈舒通或立可定，有擴(kuò)張冠狀血管、 增加冠脈流量的作用。許多黃酮類成分具有止咳、祛痰、平喘、抗菌的活性。護(hù)肝，解肝毒、 抗真菌、治療急、慢性肝炎，肝硬化。不少治療冠心病有效的中成藥均含黃酮類化合物，研 究發(fā)現(xiàn)蘆丁、槲皮素、葛根素以及人工合成的立可定等均有明顯的擴(kuò)冠作用；槲皮素、蘆丁、 金絲桃苷、葛根素、燈盞花素、葛根總黃酮、銀杏葉總黃酮對(duì)缺血性腦損傷有保護(hù)作用；金絲 桃苷、水飛薊素、木犀草素、沙棘總黃酮對(duì)心肌缺血性損傷有保護(hù)作用；銀杏葉總黃酮、葛根 素、大豆苷元等對(duì)心肌缺氧性損傷有明顯保護(hù)作用。此外，沙棘總黃酮、苦參總黃酮、甘草黃 酮（主要為甘草素和異甘草素）具有抗心律失常作用。木犀草素、黃岑苷、黃岑素等均有一 定的抗菌作用；槲皮素、二氫槲皮素、桑色素、山柰酚等具有抗病毒作用；從菊花、獐牙菜中 分離得到的黃酮單體對(duì)HIV病毒有較強(qiáng)抑制作用，大豆苷元、染料木素、雞豆黃素 A對(duì)HIV 病毒也有一定抑制作用。
[0004] 黃花蒿中含有豐富的黃酮類化合物，研究表明黃花蒿葉黃花蒿具有抑制多種腫瘤 細(xì)胞的藥理功能，其機(jī)理可能與黃花蒿葉中黃酮類化合物的抗氧化作用、抑制相關(guān)酶的活 性、降低腫瘤細(xì)胞耐藥性、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及雌激素樣作用等有關(guān)。由此可見(jiàn)黃花蒿葉黃 酮類化合物具有重要的開(kāi)發(fā)前景。然而，目前對(duì)黃花蒿黃酮類化合物的生物合成及其調(diào)控 機(jī)理不清楚，尚無(wú)相關(guān)的關(guān)鍵酶基因克隆的報(bào)道。本發(fā)明以花青素含量差異非常顯著的兩 個(gè)黃花蒿為材料，采用cDNAAFLP技術(shù)，從中獲得差異表達(dá)基因，在此基礎(chǔ)之上通過(guò)半定量 RT-PCR、生物信息學(xué)、過(guò)表達(dá)、體外酶反應(yīng)以及基因沉默的方法對(duì)候選基因進(jìn)行功能驗(yàn)證， 最終獲得了一條黃花蒿黃烷酮3-羥化酶基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種黃花蒿黃烷酮3-羥化酶基因 AaF3HY，其核苷酸序列 如 SEQ ID No. 1 所示。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述黃烷酮3-羥化酶基因 AaF3HY編碼的蛋白，該蛋 白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0007] 本發(fā)明的黃燒酮3-輕化酶基因 AaF3HY是從黃花蒿（Artemisia annua L.)中克隆 得到的一種新的黃烷酮3-羥化酶基因（現(xiàn)將該基因命名為AaF3HY)，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，該基因全長(zhǎng)為2136bp，分析表明，該序列包含一個(gè)完整的編碼區(qū)1095bp，5' 非翻譯區(qū)（UTR)563bp，3'非翻譯區(qū)441bp和polyA尾巴37bp，編碼364個(gè)氨基酸組成的蛋 白（黃烷酮3-羥化酶）。由該基因編碼的黃烷酮3-羥化酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示。該蛋白的分子量為41. 18KDa，等電點(diǎn)為5. 67。為便于表述，將該黃烷酮3-羥化酶命 名為 AaF3HY。
[0008] 應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛(ài)性，本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。因而，本發(fā)明黃烷酮3-羥化酶基因還包 括由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，得到編碼 AaF3HY的核苷酸序列。
[0009] 此外，應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的黃烷酮3-羥化酶的氨基酸 序列（SEQ ID No. 2)，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸， 得到所述蛋白的突變序列。例如在非活性區(qū)段，將第56位的L替換為I。因此，本發(fā)明黃烷 酮3-羥化酶還包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基 酸，具有與AaF3HY同等活性的由AaF3HY衍生得到的蛋白質(zhì)。
[0010] 本發(fā)明的又一目的是提供含有黃烷酮3-羥化酶基因 AaF3HY的重組表達(dá)載體 pET28a(+)-AaF3HY 和基因沉默載體 pHellsgate8-AaF3HY。
[0011] 將本發(fā)明的AaF3HY基因與表達(dá)載體可操作地連接，得到能夠表達(dá)本發(fā)明蛋白的 重組表達(dá)載體或抑制本發(fā)明基因表達(dá)的基因沉默載體，進(jìn)一步將該重組表達(dá)載體或者基因 沉默載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，獲得表達(dá)本發(fā)明AaF3HY的基因工程菌，或者轉(zhuǎn)基因黃花 蒿或組織。
[0012] 在本發(fā)明實(shí)施例中，根據(jù)AaF3HY編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)包含酶切位點(diǎn)的引物，通過(guò) RT-PCR的方法先克隆到T-easy載體上，測(cè)序正確后將AaF3HY克隆到原核表達(dá)載體pET28 的多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化條件，獲得具有活性的黃烷酮 3-羥化酶。實(shí)驗(yàn)表明，AaF3HY能夠催化黃烷酮形成3-羥基黃烷酮。
[0013] 在本發(fā)明實(shí)施例中，根據(jù)AaF3HY全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增AaF3HY全長(zhǎng)序列中的 300bp-600bp的基因片段，通過(guò)BP反應(yīng)連接到pD0NR221構(gòu)建中間載體，測(cè)序正確后將中間 載體與pHellsgate 8通過(guò)LR反應(yīng)獲得AaF3HY基因沉默載體pHellsgate8-AaF3HY，轉(zhuǎn)化農(nóng) 桿菌農(nóng)桿菌LBA4404,浸染黃花蒿葉片等外植體，獲得轉(zhuǎn)基因黃花蒿或組織，其體內(nèi)AaF3HY 表達(dá)水平得以改變，從而調(diào)控黃烷酮與3-羥基黃烷酮的比例。
[0014] 本發(fā)明首次提供了一種黃烷酮3-羥化酶基因 AaF3HY序列，其編碼蛋白其能夠催 化黃烷酮形成3-羥基黃烷酮，為體外催化黃烷酮生成3-羥基黃烷酮，以及黃花蒿體內(nèi)調(diào)控 兒黃花蒿組分的組成（黃烷酮與3-羥基黃烷酮的比例）提供了一種新的可選擇途徑。此 夕卜，本發(fā)明通過(guò)原核表達(dá)制備重組AaF3HY，克服了直接從黃花蒿中分離該蛋白的困難，降低 了成本。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1是cDNA-ATLP分離花青素含量高和低的黃花蒿葉中差異表達(dá)基因電泳圖。
[0016] 其中：A-花青素含量高的黃花蒿葉；B-花青素含量低的黃花蒿葉；M-Marker。
[0017] 圖2是半定量RT-PCR分析花青素含量高和低的黃花蒿葉中AaF3HY基因表達(dá)水平 電泳圖。
[0018] 其中：A-花青素含量高的黃花蒿葉；B-花青素含量低的黃花蒿葉。
[0019] 圖3是PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖。
[0020] 其中：A :5, -RACE，B :3, -RACE PCR，M :Marker。
[0021] 圖4是SDS-PAGE電泳分析AaF3HY蛋白表達(dá)產(chǎn)物。
[0022] 其中：M為蛋白Marker，CK為未誘導(dǎo)可溶部分，1為未誘導(dǎo)不可可溶部分，2誘導(dǎo)的 不可溶部分，3為誘導(dǎo)可溶部分，4為過(guò)柱純化產(chǎn)物。
[0023] 圖5是HPLC分析AaF3HY蛋白酶反應(yīng)產(chǎn)物。
[0024] 其中：A為對(duì)照柚皮素圖，B為AaF3HY催化柚皮素的產(chǎn)物圖；①為柚皮素；②為二 氫山奈酚。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0026] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0027] 實(shí)施例I AaF3HY基因片段的獲得
[0028] 取高黃酮含量黃花蒿（HF20