一種1,3-1,4-β-葡聚糖酶突變體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及一種1，3-1，4-β-葡聚糖酶突變體，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] β-葡聚糖是存在于禾本科植物細胞壁的一種非淀粉性多糖。其是由高達上千個β- D-葡萄糖殘基通過β-1，3或β-1，4糖巧鍵線狀排列而成，具有很高的分子量。其可W溶解于 水中，形成的溶液黏度很高，運給啤酒行業(yè)及飼料行業(yè)帶來了諸多不利。在啤酒工業(yè)的主要 原料麥芽中含有大量β-葡聚糖，在麥汁中β-葡聚糖未能及時降解會導(dǎo)致麥汁黏度過大，造 成過濾困難，延長麥膠過濾時間，降低浸出物含量，對于成品啤酒會影響其非生物穩(wěn)定性。 在純生啤酒的生產(chǎn)過程時，過多β-葡聚糖的存在會造成濾膜的膜孔堵塞，導(dǎo)致過濾能力下 降。在飼料行業(yè)中，大麥和小麥等飼料中含有大量的β-葡聚糖。無論在人的腸道還是動物的 腸道內(nèi)都不能將0-葡聚糖直接消化吸收，其必須經(jīng)過酶降解后才能被利用，且0-葡聚糖會 阻止飼料有效成分在動物腸道中內(nèi)的吸收，降低了飼料中有效成分的轉(zhuǎn)化率，是一種抗營 養(yǎng)因子。與此同時，β-葡聚糖為微生物特別是致病菌的寄居繁殖提供了豐富的營養(yǎng)，造成大 量有害微生物在動物腸道內(nèi)繁殖，引起畜禽腹瀉，同時會競爭性消耗大量物質(zhì)而降低飼料 利用率。
[0003] 來源于特基拉芽抱桿菌(Bacillus terquilensis)CGX 5-1的1,3-1,4-β-葡聚糖 酶，簡稱β-葡聚糖酶。1,3-1，4-β-葡聚糖酶可W在3-0-化喃葡萄糖位點專一性切割β-葡聚 糖，最終產(chǎn)物為Ξ糖和四糖。然而，現(xiàn)有的β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性并不滿足目前的工業(yè)應(yīng) 用。在啤酒行業(yè)麥汁糖化過程中溫度是從48°C提高至78°C，而飼料行業(yè)中烘賠的溫度也在 65°CW上。而目前篩選得到的大部分野生1，3-1，4-β-葡聚糖酶的最適溫度主要集中在45°C 和55°C，而催化活性不高也是其不能推廣使用的重要原因。而目前市場上幾家酶制劑公司 如諾維信、DMS研發(fā)生產(chǎn)的β-葡聚糖酶制劑價格昂貴，而目前國內(nèi)也有部分酶制劑公司生產(chǎn) 0-葡聚糖酶制劑，但其水平遠不及國外酶制劑公司，且0-葡聚糖酶制劑的生產(chǎn)菌種及工藝 都是商業(yè)機密，國內(nèi)研發(fā)速率緩慢，因此國內(nèi)市場在很大程度上依然依賴進口。因此，如果 能夠提高野生型1，3-1，4-β-葡聚糖酶的催化活性及熱穩(wěn)定性，獲得高活性高熱穩(wěn)定的β-葡 聚糖酶，那么就可W降低成本，推廣其在工業(yè)上的應(yīng)用。
[0004] 為了提高1，3-1，4-β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性，國內(nèi)外已經(jīng)對其已經(jīng)進行了一系列研 究。對β-葡聚糖酶的雜交結(jié)果顯示，將浸麻芽抱桿菌(B.macerans)來源的前16個氨基酸替 換為淀粉液化芽抱桿菌(B.amyloliquefaciens)來源的前16個氨基酸得到的雜交酶H(A16- M)和兩者之間前12個氨基酸進行替換及刪除TYR13形成的雜交酶H(A12-M)-Δ13在高溫下 有很好的穩(wěn)定性。GLN1、Τ皿2、SER5和P肥7位點的突變大幅度的降低了 β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定 性。運說明β-葡聚糖酶的Ν端對于該酶的熱穩(wěn)定性有重要的影響。而巧離子對于在高溫下維 持β-葡聚糖酶的穩(wěn)定性也有重要作用。針對β-葡聚糖酶中多個賴氨酸進行定點突變研究發(fā) 現(xiàn)當(dāng)其中3個賴氨酸突變?yōu)榻z氨酸得到的Ξ突變酶(BglTM)的熱穩(wěn)定性和催化活力都有了 一定程度的提升。在β-葡聚糖酶Ξ維結(jié)構(gòu)中添加 N31C-T187C和P102C-N125C兩個二硫鍵也 提高了 e-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性。但是目前得到的改造酶Bg 口 Μ的熱穩(wěn)定性依舊不能適應(yīng)工 業(yè)應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種1，3-1，4-β-葡聚糖酶突變體，尤其是一種具有更高熱穩(wěn) 定性的1，3-1，4-β-葡聚糖酶突變體。
[0006] 所述1，3-1，4-β-葡聚糖酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID N0.USEQ ID N0.2、SEQ 10側(cè).3、569 10側(cè).4、沈9 10側(cè).5、沈9 10側(cè).6或沈9 10側(cè).7所示。分別是54(^、5436、 E46P、肥 05P、E46P/S43E、E46P/S43E/H205P、E46P/S43E/H205P/S40E。
[0007] 所述S40E，是在親本BglTM的基礎(chǔ)上，將第40位的絲氨酸突變?yōu)楣劝彼岫玫降摹?[000引所述S43E，是在親本BglTM的基礎(chǔ)上，將第43位的絲氨酸突變?yōu)楣劝彼岫玫降摹?br>[0009] 所述E46P，是在親本BglTM的基礎(chǔ)上，將第46位的谷氨酸突變?yōu)楦彼岫玫降摹?br>[0010] 所述H205P，是在親本BglTM的基礎(chǔ)上，將第205位的組氨酸突變?yōu)楦彼岫玫?的。
[0011] 所述E46P/S43E，是在突變體E46P的基礎(chǔ)上，將第43位的絲氨酸突變?yōu)楣劝彼岫?到的。
[0012] 所述E46P/S43E/H205P，是在突變體E46P/S43E的基礎(chǔ)上，將第205位的組氨酸突變 為脯氨酸而得到的。
[0013] 所述E46P/S43E/H205P/S40E，是在突變體E46P/S43E/H205P的基礎(chǔ)上，將第40位的 絲氨酸突變?yōu)楣劝彼岫玫降摹?br>[0014] 本發(fā)明還要求保護含有編碼所述突變體的基因的載體，W及表達所述突變體的基 因工程菌。
[0015] 所述基因工程菌，在本發(fā)明的一種實施方式中，W祀T28a( + )質(zhì)粒為表達載體，W 大腸桿菌為表達宿主。
[0016] 所述宿主，在本發(fā)明的一種實施方式中，為大腸桿菌化21 (DE3)。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種所述基因工程菌的構(gòu)建方法。
[0018] 本發(fā)明還要求保護所述突變體在食品、飼料領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的突變體命名，是W親本氨基酸序列為基準，采用"原始氨基酸位置替換的 氨基酸"來表示突變體。比如S40E代表將位置40的氨基酸由親本的絲氨酸S替換為谷氨酸E， 又比如E46P/S43E/肥05P/S40E代表第46位、第43位、第205位和第40位的氨基酸同時發(fā)生了 突變，分別從谷氨酸、絲氨酸、組氨酸和絲氨酸突變?yōu)楦彼?、谷氨酸、脯氨酸和谷氨酸?br>[0020] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供的幾株β-葡聚糖酶突變體，與野生酶相比，其熱穩(wěn) 定性有了大幅度提升。突變體 S40E、S43E、E46P、ffi05P、E46P/S43E、E46P/S43E/ffi05P、E46P/ S43E/H205P/S40E在70°C溫浴1小時后剩余酶活力分別為14.8%、21.3%、26.7%、17.9%、 % . 3 %、46.9 %和59.4%，而野生酶經(jīng)過同樣處理后剩余酶活僅為6.3 % (圖1)。突變體 E46P/S43E/H205P/S40E的最適溫度和T5Q值分別為65°C和79.5°C，和野生酶相比分別提高了 5°C和3.5°C。其在60°C和70°C下的半衰期分別達到126.4分鐘和80.4分鐘，分別是野生酶的 2.14倍和2.89倍。突變體E46P/^S43E/H205P/S40E的最適pH為pH6.0，和野生酶相比降低了 0.5個抑，而突變體的催化性質(zhì)和野生酶幾乎相同。本發(fā)明的突變體，在保證催化活性的同 時使得e-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性有所提高，更有利于在工業(yè)上的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0021] 圖1:野生酶與7株β-葡聚糖酶突變體在70°C下處理1小時剩余酶活比較
[0022] 圖2:野生酶與β-葡聚糖酶突變體E46P/S43E/肥05P/S40E的最適溫度曲線
[0023] 圖3:野生酶與β-葡聚糖酶突變體E46P/S43E/肥05P/S40E在60°C的半衰期比較
[0024] 圖4:野生酶與β-葡聚糖酶突變體E46P/S43E/肥05P/S40E在70°C的半衰期比較 [00巧]圖5:野生酶與β-葡聚糖酶突變體E46P/S43E/肥05P/S40E的T50值曲線比較
【具體實施方式】
[0026] 實施例1β-葡聚糖酶的迭代飽和突變
[0027] 在40、43、46和205四個位點進行迭代飽和突變并測定了突變體的熱穩(wěn)定性參數(shù)。 W質(zhì)粒祀T28a( + )-BglTM(Niu C，Zhu L，Zhu Ρ,Li Q.2015丄ysine-Based Site-Directed Mutagenesis Increased RigidP-Sheet Structure and Thermostability ofMesophilic 1,3-1,4-0-Glucanase.Journal ofAgri州Itural and Food Chemistry 63:5249-5256)為 模板，在40位、43位、46位和205位通過Qui ckchange的方法引入NNK簡并密碼子(N: Ade/切t/ Gua/Thy;K:Gua/Thy)來替代目的氨基酸。
[0028] 在40位引入NNK簡并密碼子的定點突變引物為：
[00巧]正向引物：5'-cgtggcgggctaataacgtaNNKatgacgtcattgggtgaaatgc-3'，大寫字母 為突變堿基，
[0030]反向引物：5 '-gcatttcacccaatgacgtcatMNNtacgttattagcccgccacg-3 '，大寫字母 為突變堿基；
[0031 ]在43位引入NNK簡并密碼子的定點突變引物為：
[0032] jES 引串勿：5 ' 一邑ctaataac邑tatcaat邑ac邑NNKtt邑邑邑t邑aaat邑C邑ttta邑C邑ctaa-3 '， 字母為突變堿基，
[0033] 反向引物：5 '-ttagcgctaaacgcatttcacccaaMNNcgtcattga1:acgttat1:agc-3'，大寫 字母為突變堿基；
[0034] 在46位引入NNK簡并密碼子的定點突變引物為：
[00：35]正向引物：5 '-gtatcaatgacgtcattgggtNNKatgcgtt1:agcgctaacaagc-3 '，大寫字母 為突變堿基，
[0036] 反向引物：5 '-gcttgttagcgc1:aaacgcatMNNacccaatgacgtcattgatac-3 '，大寫字母 為突變堿基；
[0037] 在205位引入NNK簡并密碼子的定點突變引物為：
[0038] 正向引物：5 ' -ggtgtaaatccgctatacgctNNKtatgactgggtgcgctatacaa-3 '，大寫字 母為突變堿基，
[0039] 反向引物：5 ' -ttgtatagcgcacccagtca1:aMNNagcgtatagcggatttacacc-3 '，大寫字 母為突變堿基；
[0040] 如ickchange法重疊延伸PCR具體實施條件如下：
[0041 ] PCR反應(yīng)體系均為：2XI%an化Max Buffer 2扣L，dNTP Mix化L，10yM正向引物化 L，ΙΟμΜ反向引物化L，模板DM化L，P虹anta?Max聚合酶化L，雙蒸水補齊至50化；
[0042] PCR反應(yīng)擴增條件:94°C預(yù)變性5min;隨后進行94°C Imin，56 °C 50s，72 °C 50s 30個 循環(huán);最后保存在4°C。
[0043] 在上述通過PCR擴增得到的