活性提高的內(nèi)切葡聚糖酶變體及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及參與木質(zhì)纖維素生物質(zhì)分解的酶的表達(dá)和優(yōu)化。更具體地，本發(fā)明涉及里氏木霉內(nèi)切葡聚酶II的變體，和性能提高的所述變體在分解纖維素和生產(chǎn)生物燃料的方法中的用途。
【專利說明】
活性提高的內(nèi)切葡聚糖酶變體及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 由于大量原料的可利用性W及乙醇作為燃料的價值，由纖維素生產(chǎn)乙醇的可能性 已經(jīng)得到密切關(guān)注。用于此類工藝的基于纖維素的天然原料稱為"生物質(zhì)"。已經(jīng)考慮將許 多類型的生物質(zhì)，例如木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物和城市固體廢物，作為生產(chǎn)生物燃料的 潛在原料。運(yùn)些材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是由0-1，4鍵連接的葡萄糖分子組成的聚合物，其對降解或解聚合非常有 抗性。一旦纖維素被轉(zhuǎn)化為葡萄糖，后者容易用酵母發(fā)酵成生物燃料，如乙醇。
[0003] 研究的用于將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的最古老的方法基于酸水解。該方法可W在濃 酸或稀酸存在下進(jìn)行。然而，一些缺點（例如當(dāng)使用濃酸時酸回收很差，W及使用稀酸情況 下葡萄糖產(chǎn)量低)對酸水解工藝的經(jīng)濟(jì)性是不利的。
[0004] 為了克服酸式水解工藝的缺點，最近的纖維素轉(zhuǎn)化工藝已經(jīng)更多地與酶促水解 (使用纖維素酶類型的酶)相關(guān)。然而，運(yùn)種酶促水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)（例如纖維素）的缺 點是其工業(yè)工藝較為昂貴。因此，有必要使用日益有效的分泌纖維素酶的微生物菌株。在運(yùn) 方面，很多微生物包含水解纖維素的酶，例如真菌木霉（Tri Choderma)、曲霉 (Aspergillus)、腐質(zhì)霉（Humi cola)或鑲刀菌（Fusarium) W及細(xì)菌高溫單抱菌屬 (Thermomonospora)、芽抱桿菌（Baci 1 Ius )、纖維單胞菌（Cel Iulomonas )和鏈霉菌 (Str邱tomyces)。運(yùn)些微生物分泌的酶具有用于將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的S種類型的活 性，且分為=組:隨機(jī)攻擊纖維素纖維內(nèi)部的內(nèi)切葡聚酶，攻擊纖維末端并釋放纖維二糖的 外切葡聚酶，和將運(yùn)種纖維二糖水解為葡萄糖的e-葡萄糖巧酶。其他類型的酶，例如半纖維 素酶或最近發(fā)現(xiàn)的多糖單加氧酶類也可W在水解效率中起作用。
[0005] 降低酶促水解的成本具有強(qiáng)大的產(chǎn)業(yè)利益，運(yùn)種降低設(shè)及使用減少量的酶W及更 有效的酶的混合物（cocktail)。因此，一些專利申請描述能力高于里氏木霉(Trichoderma reesei)的天然酶或通過基因工程改進(jìn)的變體?？蒞提及與外切葡聚酶有關(guān)的專利申請 US2010304464、W0 2010/066411 和WO 2013/029176,與內(nèi)切葡聚酶有關(guān)的申請WO 2007/ 10944UW0 2012/149 192和WO 2010/076388,與0-葡萄糖巧酶有關(guān)的申請WO 2010/ 029259、W0 2010/135836或WO 2010/022518,或與多糖單加氧酶有關(guān)的其他申請 W012135659和W012149344。
[0006] 主要基于結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)，水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶在CAZy系統(tǒng)（Cantarel，B丄.， Coutinho,P.M.,Rancurel,C.,Bernard,!.,Lombard,V.,feHenrissat,B.(2009).The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics.Nucleic acids research,37,0233-8)中分類。內(nèi)切葡聚酶屬于細(xì) 5、6、7、 8、9、12、16、18、19、26、44，、45、48、51、74 和 124 家族。
[0007] 為了使木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的水解有效且經(jīng)濟(jì)適用，酶混合物必須包含比例平衡的 具有各種酶活性的酶(尤其是，但不排除其他，外切葡聚酶、內(nèi)切葡聚酶、木聚糖酶和e-葡萄 糖巧酶類）。例如，一般注意到在里氏木霉的天然混合物中存在60-70%的外切葡聚酶、15-20%的內(nèi)切葡聚酶、少量百分比的半纖維素酶和約5-10%的0-葡萄糖巧酶。該混合物適于 水解大多數(shù)預(yù)處理的底物(例如在酸性條件下汽爆的小麥賴桿)且產(chǎn)量可接受。簡言之，內(nèi) 切葡聚酶活性的增加必須不會損害其他酶的活性。運(yùn)些酶的功能特異性目前仍知之甚少。 里氏木霉基因組包含至少3種主要的酶，其來自家族7化Gl，cel7b)、5化G2，cel5a)和12 化G3，cell2a)"EGl和EG2酶是主要的內(nèi)切葡聚酶，按重量計可W占里氏木霉產(chǎn)生的全部酶 混合物的10-20 %。
[000引內(nèi)切葡聚酶化C3.2.1.4)是作用于纖維素的第一個酶，已知其在水解中具有重要 作用:增加外切葡聚酶可W攻擊的位點數(shù)，同時降低被攻擊的微纖維的聚合度。最近的研究 (Szijarto,N.,Siika-aho,M.,Sontag-Strohm,T.,feViikari,L.(2011).Liquefaction of hydrothermally pretreated wheat straw at high-solids content by purified Trichoderma enzymes .Bioresource technology, 102(2), 1968-74)強(qiáng)調(diào)它們在水解第一 個小時期間降低生物質(zhì)粘性的作用。運(yùn)種粘性的降低對工藝的操作成本具有非常顯著的影 響。
[0009] 粘性問題在需要低溫資源的工藝的情況下加劇，例如同時糖化和發(fā)酵(SSF)，其設(shè) 及水解生物質(zhì)的酶和將糖單體轉(zhuǎn)化為乙醇的微生物兩者。
[0010] 水解和發(fā)酵可W根據(jù)各種方案進(jìn)行。最常見的由獨立的水解和發(fā)酵(SHF)組成。運(yùn) 種方法可W通過維持最佳反應(yīng)條件來優(yōu)化各步驟。發(fā)酵在約28°C至約3(TC的溫度即時進(jìn) 行，而水解一般在至少45°C的溫度進(jìn)行。然而，在甜F中，在反應(yīng)結(jié)束時釋放的糖的濃度非常 高，導(dǎo)致對酶的抑制，降低該方法的效率。為了避免運(yùn)些缺點，可W預(yù)期另一種方法。在SSF 中，兩個步驟(己糖的水解和發(fā)酵)同時進(jìn)行，防止糖積累至抑制酶的濃度。投資成本也因為 使用單個反應(yīng)器而降低。由于沒有抑制，之后的水解程度更高，因為釋放的糖被立即用于發(fā) 酵成乙醇。在該方法中，反應(yīng)器溫度必定構(gòu)成水解和發(fā)酵的最佳溫度之間的平衡，通常在約 30°C至約35°C之間。然而，纖維素酶的活性在該溫度降低約30%。
[0011] SSF還允許在發(fā)酵糖的生物中分解纖維素的酶的表達(dá)，從而可W將資源限制，或在 極端情況下消除至單獨步驟中產(chǎn)生的酶。然而，用發(fā)酵生物生產(chǎn)大量酶從而獲得高活性證 明是有問題的，限制了運(yùn)些方法的可行性。
[001^ 因此，獲得在水解和發(fā)酵的最佳溫度(例如，在30°C-5(rC之間）下保持有效的內(nèi)切 葡聚酶活性同時保持混合物中所有酶的比例的酶對于將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物燃 料的工藝而言將具有顯著收益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了尤其與序列SEQ ID N0:2的野生型EGl蛋白的內(nèi)切葡聚酶活性 相比，內(nèi)切葡聚酶活性提高的多膚。EGl對應(yīng)于里氏木霉內(nèi)切葡聚酶1。
[0014] 從運(yùn)個角度，
【申請人】很大的功勞在于經(jīng)過大量研究之后，發(fā)現(xiàn)了與EGl參考蛋白 (SEQ ID N0:2)的內(nèi)切葡聚酶活性相比，內(nèi)切葡聚酶活性提高的分離或純化多膚。
[0015] 因此，本發(fā)明設(shè)及選自W下的多膚：
[0016] 1)選自569 10顯：4、沈9 10側(cè)：6、569 10顯：8、沈9 10側(cè)：10、沈9 10側(cè)：12、 沈Q ID NO:14、沈Q ID NO:16、沈Q ID NO:18、沈Q ID NO:20、沈Q ID NO:22、沈Q ID NO:24 和SEQ ID NO :26的氨基酸序列；
[0017] ii)與序列沈Q ID N0:4、SEQ ID N0:6、沈Q ID N0:8、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO: 12、沈Q ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:20、沈Q ID N0:22、SEQ ID N0:24或沈Q ID N0:26具有至少70%，優(yōu)選75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一 性百分比的氨基酸序列。
[0018] 優(yōu)選地，上述多膚的特征在于，其在發(fā)酵生物中的表達(dá)至少等于EGl參考蛋白（SEQ ID NO:2)的表達(dá)。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明，給定序列相對于沈Q ID ^:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26 的同一性百分比對應(yīng)于該給定序列和沈Q ID側(cè):4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26之 間相同的殘基數(shù)除W沈Q ID ^:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的殘基數(shù)。當(dāng)使用 Genome如est數(shù)據(jù)庫時，所述相對于沈Q ID側(cè):4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的同 一性百分比對應(yīng)于Que巧同一性百分比（％id如ery)，其中如e巧對應(yīng)于序列SEQ ID N0:4、 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26。
[0020] 例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠使用底物簇甲基纖維素(CMC)或使用顯色底物(對硝 基苯基巧)來確定酶活性的增加或換言之提高。酶活性將通過還原糖或釋放的硝基苯酪的 比色分析分別掲示。
[0021] 優(yōu)選地，相對于氨基酸序列SEQ ID N0:2的EGl蛋白的內(nèi)切葡聚酶活性，本發(fā)明的 多膚的酶活性提高至少10%，優(yōu)選至少20%，優(yōu)選至少30%。
[0022] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可W用來確定根據(jù)本發(fā)明的多膚的酶活性相對于EGl參考蛋白 (SEQ ID N0:2)是否提高的方案的實例如下：
[0023] -于37°C過夜形成表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多膚的大腸桿菌化.COli)的原種培養(yǎng)物；
[0024] -于37 °C用1 %原種培養(yǎng)物接種LB培養(yǎng)基直至獲得最佳密度0.4;
[0025] -于20°C培養(yǎng)所述細(xì)胞1她；
[0026] -在7900巧m離屯、5分鐘；
[0027] -用含有Img/ml溶菌酶的抑5的IOOmM巧樣酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞沉淀(最終ODsoo為 100);
[002引-在冰上解育重懸細(xì)胞30分鐘；
[0029] -通過3個循環(huán)的冷凍/融化裂解細(xì)胞；
[0030] -通過超聲法使DNA片段化；
[0031] -在13000巧m離屯、30分鐘；
[0032] -于35。(：和5(TC用IOOiil含有1%CMC的抑5的IOOmM巧樣酸鹽緩沖液解育IOOiil分解 上清液化；
[0033] -移除10化1反應(yīng)；
[0034] -加入 1〇化1 DNS 試劑(Miller ,1959);
[0035] -于10(TC解育5分鐘；
[0036] -在冰上解育3分鐘；
[0037] -在3000巧m離屯、10分鐘；
[0038] -在540nm讀取15化1上清液的光密度。
[0039] 本發(fā)明的主題還是編碼至少一個上述多膚的純化或分離的核酸。下表1包含里氏 木霉EGI ("野生型"）、推測的球毛殼菌（Chae^mium shbosum) (C)和煙曲霉 (Aspergillus fumisatus)(A)內(nèi)切葡聚酶的核酸和膚序列W及本發(fā)明的多膚和核巧酸 的鑒定。
[0040] 優(yōu)選地，所述純化或分離的核酸可W選自W下序列：SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、 WQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDN0:11、WQIDN0:13、SEQIDN0:15、WQIDN0:17、 沈Q ID NO: 19、沈Q ID NO:21、沈Q ID NO:23和沈Q ID NO:25。
[0041] 表1 r00421 12345 本發(fā)明還被及包含上述核酸的載體。
2 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"載體"意欲是指在其中有可能插入外源核酸片段的任何DNA序 列，載體能夠?qū)⑼庠碊NA引入宿主細(xì)胞。作為載體，非窮舉地可W提及:質(zhì)粒、黏性質(zhì)粒、酵母 人造染色體(YAC)、細(xì)菌人造染色體(BAC)、P1隧菌體衍生的人造染色體(PAC)或病毒衍生的 載體。 3 根據(jù)本發(fā)明，上述核酸可W與啟動子、終止子或其在宿主細(xì)胞中表達(dá)所需的任何 其他序列功能性連接。 4 根據(jù)本發(fā)明的載體還可W攜帶選擇標(biāo)記。術(shù)語"選擇標(biāo)記"意欲是指其表達(dá)使包含 它的細(xì)胞具有能夠選擇它們的特征。例如，它是耐抗生素的基因。 5 本發(fā)明的主題還是包含至少一種上述多膚、或至少一種上述核酸或至少一種上述 載體的分離的宿主細(xì)胞。
[004引本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠通過熟知的常規(guī)方法將上述的多膚之一、核酸之一或載體 之一引入宿主細(xì)胞。例如，可W提及用氯化巧處理、電穿孔或使用基因槍。
[0049]根據(jù)一個實施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠通過常規(guī)方法將編碼內(nèi)切葡聚酶活性 提高的根據(jù)本發(fā)明的多膚的幾個拷貝的核酸引入宿主細(xì)胞。
[0050]根據(jù)一個實施方案，上述分離的宿主細(xì)胞選自木霉、曲霉、鏈抱霉(Neurospora)、 腐質(zhì)霉、毀絲霉(Myceliophthora)、金抱霉(Qiiysosporium)、青霉(Penicilli皿）、鑲刀菌、 高溫單抱菌、芽抱桿菌、假單胞菌（Pseudomonas)、埃希氏菌（Escherichia)、梭菌 (Clostridium)、纖維單胞菌、鏈霉菌、耶氏酵母（Yarrowia)、畢赤醇母（Pichia)和酵母 (Saccharomyces)〇
[0051] 根據(jù)一個實施方案，上述分離的宿主細(xì)胞選自里氏木霉、綠色木霉(Trichoderma viridae)、康氏木霉（Trichoderma koningii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、構(gòu)巢曲霉 (Aspergillus nidulans)、文氏曲霉（Aspergi 1 Ius wentii )、米曲霉（Aspergi 1 Ius oryzae)、海要曲霉（Aspergillus phoenicis)、嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermopila)、Chrysosporium Iucknowense、粗糖脈抱菌（Neurospora crassa)、灰腐質(zhì)霉 (Humicola grisae)、嗜松青霉（PeniciIlium pinophiIum)、草酉《青霉（PeniciIlium oxalicum)、大腸桿菌（Escherichia coli)、丙酬下醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)、糖解梭菌（Clostridium saccharoIyticum)、拜氏梭菌（Clostridium benjerinckii)、下酸梭菌（Clostridium butylicum)、畢赤酵母(Pichia pastoris)、解脂 耶氏酵母(化rrowia Iipolityca)和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。
[0052] 根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，上述分離的宿主細(xì)胞選自里氏木霉和釀酒酵母。
[0053] 本發(fā)明的主題還是上述任何一種多膚用于水解纖維素的用途。
[0054] 本發(fā)明的主題還是上述任何一種多膚用于生產(chǎn)生物燃料的用途。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"生物燃料"可W定義為來自生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化且可用于能源目的的 任何產(chǎn)物。并且，不希望被限制且通過舉例的方式可W提到的，可W納入燃料的產(chǎn)物-生物 氣(任選地在隨后的轉(zhuǎn)化之后)或其本身可W作為燃料，例如醇(根據(jù)使用的發(fā)酵生物的類 型，乙醇、下醇和/或異丙醇）、溶劑(丙酬）、酸(下酸）、脂質(zhì)及其衍生物(短鏈或長鏈脂肪酸、 脂肪酸醋)和氨氣。
[0056] 優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的生物燃料是醇，例如乙醇、下醇和/或異丙醇。更優(yōu)選的，根 據(jù)本發(fā)明的生物燃料是乙醇。
[0057] 在另外一個實施方案中，生物燃料是生物氣。
[0058] 在另外一個實施方案中，產(chǎn)物是在化學(xué)工業(yè)中感興趣的分子，例如另一種醇(如1， 2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,4-下二醇、2,3-下二醇）、有機(jī)酸(如乙酸、丙酸、丙締酸、下酸、班 巧酸、蘋果酸、富馬酸、巧樣酸、或衣康酸），或徑基酸(如乙醇酸、徑基丙酸或乳酸）。
[0059] W下描述用于水解木質(zhì)纖維素的酶混合物的生產(chǎn)的實施方案。將能夠表達(dá)根據(jù)本 發(fā)明多膚的絲狀真菌菌株，優(yōu)選木霉，更優(yōu)選里氏木霉，在選擇用于微生物生長的碳基底物 (如乳糖或葡萄糖）的存在下在發(fā)酵罐中培養(yǎng)。在一個實施方案中，將該碳基底物根據(jù)其性 質(zhì)在滅菌前引入發(fā)酵罐或單獨滅菌后再引入滅菌后的發(fā)酵罐W獲得20-35g^的初始濃度。
[0060] 然后加入選擇用于生產(chǎn)酶的含有底物的水性溶液。最后通過過濾培養(yǎng)基回收真菌 產(chǎn)生的作用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶組合物。在該組合物中，尤其有e-葡萄糖巧酶、外切葡 聚糖酶和根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶。在一個實施方案中，該選擇用于生產(chǎn)酶的含有底物 的水性溶液W 200-250g/1的濃度制備。該溶液還優(yōu)選包含誘導(dǎo)底物例如乳糖。在初始的碳 基底物耗盡后加入該水性溶液W提供35-45mg/g的最佳細(xì)胞量（"補(bǔ)料分批"）。在該"補(bǔ)料分 批"階段，培養(yǎng)基中糖的殘留濃度少于lg/1，且作用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶由真菌分泌。 后者可W通過過濾培養(yǎng)基回收。
[0061] 本發(fā)明的主題是能夠作用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶組合物，所述酶組合物由絲狀 真菌產(chǎn)生，且包含至少一種相對于EGl參考蛋白的內(nèi)切葡聚酶活性，其內(nèi)切葡聚酶活性提高 的多膚。術(shù)語"絲狀真菌"意欲尤其是指木霉，更優(yōu)選里氏木霉。
[0062] 最后，本發(fā)明的主題是從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的方法，包含W下連續(xù)步驟：
[0063] -將待水解的生物質(zhì)懸浮于水相；
[0064] -如上所述在酶組合物存在下水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)W產(chǎn)生含有葡萄糖的水解 物；
[0065] -發(fā)酵水解物中的葡萄糖W產(chǎn)生發(fā)酵液；
[0066] -從發(fā)酵液中分離生物燃料。
[0067] 在一個實施方案中，將待水解的生物質(zhì)W6%-40%的固體，優(yōu)選20%-30%的比例 懸浮于水相。調(diào)節(jié)抑至4-5.5，優(yōu)選4.8-5.2，并且調(diào)節(jié)溫度至40-60°C，優(yōu)選45-50°C。通過加 入作用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶組合物啟動水解反應(yīng)，通常用量是每克預(yù)處理的底物10-SOmg分泌的蛋白或更少。反應(yīng)一般持續(xù)15-48小時。通過分析釋放的糖，尤其是葡萄糖監(jiān)測 反應(yīng)。通過過濾或離屯、從非水解固體級分中分離主要由木質(zhì)素組成的糖溶液，隨后在發(fā)酵 單元中處理。
[0068] 發(fā)酵步驟后，例如通過蒸饋從發(fā)酵液中分離生物燃料。
[0069] 本發(fā)明的另一個主題是從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的方法，其特征在于它包含W下連 續(xù)步驟：
[0070] -將待水解的生物質(zhì)懸浮于水相；
[0071] -同時添加上述酶組合物和發(fā)酵生物W產(chǎn)生發(fā)酵液；
[0072] -從發(fā)酵液中分離生物燃料。
[0073] 優(yōu)選地，同時添加酶組合物和發(fā)酵生物，然后在30°C-35°C的溫度解育W產(chǎn)生發(fā)酵 液。
[0074] 根據(jù)運(yùn)個實施方案，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的SSF(同時糖化和發(fā)酵)方法，將生 物質(zhì)中存在的纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，同時在同一反應(yīng)器中，發(fā)酵微生物(例如酵母)將葡萄 糖轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物。取決于發(fā)酵生物的代謝和水解能力，正確進(jìn)行該操作可能需要添加或 多或少量的外源分解纖維素的混合物。
[0075] 在另一個實施方案中，發(fā)酵生物通過分泌或在其細(xì)胞表面產(chǎn)生作為本發(fā)明主題的 多膚，任選地與作用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的其他酶一起，從而限制或消除對由絲狀真菌產(chǎn) 生的酶的需求。優(yōu)選地，發(fā)酵生物是上述宿主細(xì)胞。
[0076] 因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的主題是從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的方法，包含W下連續(xù)步 驟：
[0077] -將待水解的生物質(zhì)懸浮于水相；
[0078] -添加一種或多種上述宿主細(xì)胞W及上述發(fā)酵生物和/或酶組合物W產(chǎn)生發(fā)酵液；
[0079] -從發(fā)酵液中分離生物燃料。
[0080] 優(yōu)選地，添加宿主細(xì)胞W及酶組合物和/或發(fā)酵生物，然后在30°C-35 °C的溫度解 育W產(chǎn)生發(fā)酵液。
[0081] 因此，使用根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)切葡聚酶活性提高的多膚具有獲得更好葡萄糖生產(chǎn)產(chǎn) 量、同時使用比之前更少的酶的優(yōu)勢，運(yùn)具有經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢。
[0082] 本發(fā)明的其他方面、主題、優(yōu)勢和特征將通過閱讀W實施例和圖的方式給出的W 下描述本發(fā)明優(yōu)選實施方案的非限制性描述展示。
【附圖說明】
[0083] 圖1是表示分別由菌株Sca-EGl和154E4分泌到培養(yǎng)基的參考內(nèi)切葡聚酶化Gl)及 其突變體(154E4)水解1%CMC的圖。
[0084] 圖2是表示^下混合物的甜。結(jié)果的圖：衍生自菌株15464/8(569 10^:10)的混 合物、由添加有e-葡萄糖巧酶的菌株化847 A EGU A EGl)產(chǎn)生的參考混合物、W及由添加有 e-葡萄糖巧酶的菌株并用EGl參考基因再轉(zhuǎn)化的化847 A EGl ( A EGIcEGI )產(chǎn)生的另一種參 考混合物。
[0085] 圖3是表示W(wǎng)下混合物的SHF結(jié)果的圖：衍生自菌株11G8/10(SEQ ID N0:22)的混 合物、由補(bǔ)充有e-葡萄糖巧酶的菌株化847 A EG1( A EG1)產(chǎn)生的參考混合物、W及由補(bǔ)充有 e-葡萄糖巧酶的菌株并用EGl參考基因再轉(zhuǎn)化的化847 A EGl ( A EGIcEGI )產(chǎn)生的另一種參 考混合物。
[0086] 圖4是表示W(wǎng)下混合物的SSF結(jié)果的圖：衍生自菌株154E4/2和154E4/8(SEQ ID NO: 10)的兩種混合物、由補(bǔ)充有(6-葡萄糖巧酶的菌株化847 A EGl ( A EGl)產(chǎn)生的參考混合 物、W及由補(bǔ)充有e-葡萄糖巧酶的菌株并用EGl參考基因再轉(zhuǎn)化的化847 A EGU A EGIcEGI ) 產(chǎn)生的另一種參考混合物。
[0087] 圖5是表示W(wǎng)下混合物的SSF結(jié)果的圖：衍生自菌株11G8/10、11G8/12和11G8/13 (SEQ ID NO:22)的巧巾混合物、衍生自菌株225C7/7(SEQ ID NO:26)的混合物、由補(bǔ)充有0-葡萄糖巧酶的菌株化847 A EGU AEGl)產(chǎn)生的參考混合物、W及由補(bǔ)充有0-葡萄糖巧酶的 菌株并用EGl參考基因再轉(zhuǎn)化的化847 A EGU A EGIcEGI )產(chǎn)生的另一種參考混合物。
【具體實施方式】
[008引實施例1:第一輪k洗牌
[0089] 將里氏木霉EGl參考基因 （SEQ ID NI0:1)用各自與參考基因 SEQ ID NO: 1具有約 60%同一性的推測的球毛殼菌內(nèi)切葡聚酶(SEQ ID NO: 29)和煙曲霉內(nèi)切葡聚酶（SEQ ID NO: 27)的基因根據(jù)EPl 104457B11中所述的方法進(jìn)行第一輪k洗牌。
[0090] 1-高通量篩選
[0091] 開發(fā)高通量篩選試驗W選擇由レ洗牌產(chǎn)生的最佳克隆，例如，相對于參考酶SEQ ID NO:2其內(nèi)切葡聚酶活性顯示至少20%提高的那些。
[0092] 高通量篩選試驗根據(jù)W下步驟進(jìn)行：
[0093] -在瓊脂上分離表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的重組酶的レ洗牌變體的大腸桿菌克隆，并將所 述克隆于37 °C在LB培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)過夜；
[0094] -用所述預(yù)培養(yǎng)接種6%的LB培養(yǎng)基，然后于37°C解育5小時，然后于20°C解育17小 時；
[00巧]-在3000巧m下離屯、10分鐘；
[0096]-添加 SOiil P冊含有Img/ml溶菌酶的0.1 M巧樣酸鹽緩沖液溶液裂解細(xì)胞；
[0097] -在室溫下解育4小時；
[0098] -添加 SOiil P冊含有1%簇甲基纖維素的0.IM巧樣酸鹽緩沖液；
[0099] -于35°C解育17小時；
[0100] -在3000巧m下離屯、10分鐘；
[0101] -移除IOOiil上清液；
[0102] -添加10化1 DNS試劑；
[0103] -于100°C解育10分鐘，然后在冰上解育5分鐘；
[0104] -在 540nm 讀取 12化1 的 0D。
[0105] 在運(yùn)些高通量篩選條件下，在幾個克隆中發(fā)現(xiàn)其內(nèi)切葡聚酶活性相對于EGl參考 酶（SEQ ID N0:2)提高（在540nm的OD增加），尤其包括克隆76B4、105F11、107H12、154E4、 202(：12、27249、278尸10、29382和309八11。
[0酒]2-測定內(nèi)切葡聚酶活性的提高 [0…7] 2-1/在簇甲基纖維素(CMC)底物上
[0108] 為了評估在第一輪k洗牌中選擇的變體與參考酶(SEQ ID N0:2)相比的Kcat,進(jìn) 行W下過程：
[0109] -于37°C過夜制備表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的重組酶的大腸桿菌的原種培養(yǎng)液；
[0110] -于37 °C用1 %原種培養(yǎng)物接種LB培養(yǎng)基直至獲得600nm的光學(xué)密度為0.4;
[0111] -于20°C培養(yǎng)所述細(xì)胞1她；
[0112] -在7900巧m離屯、5分鐘；
[0113] -用pH5含有Img/ml溶菌酶的0.1 M巧樣酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞沉淀（最終ODsoo為 100);
[0114] -在冰上解育重懸細(xì)胞30分鐘；
[0115] -通過3個循環(huán)的冷凍/融化裂解細(xì)胞；
[0116] -通過在能量5超聲3秒使DNA片段化；
[0117] -在13000巧m離屯、30分鐘；
[011引-于35°C和50°C用10化1含有1%CMC的P冊的0.1M巧樣酸鹽緩沖液解育10化1分解 上清液6小時；
[0119] -移除10化1反應(yīng)；
[0120] -添加10化1 DNS試劑；
[0121] -于100°C解育5分鐘；
[0122] -在冰上解育3分鐘；
[0123] -在3000巧m離屯、10分鐘；
[0124] -在540nm讀取15化1的光密度。
[0125] 根據(jù)本發(fā)明，按照W下方式計算Kcat值：
[0126] -將540nm的OD表達(dá)為目標(biāo)蛋白量（WnM表示)的函數(shù)；
[0127] -減去陰性對照的值；
[0128] -除W葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)范圍的系數(shù)(用DNS掲示各種葡萄糖含量）；
[0129] -除W反應(yīng)時間（360分鐘）。
[0130] 表2表示在CMC上的活性試驗的實驗條件下，克隆76B4、105F11、107H12、154E4、 202(：12、27249、278。10、29382和309411相對于661參考蛋白（569 10側(cè):2)的1(。曰1值^及提 高倍數(shù)。
[0131] 表2:在CMC上的內(nèi)切葡聚酶活性
[0132]
[i
[0134] 結(jié)果表明運(yùn)些克隆的酶活性相對于參考酶SEQ ID N0:2顯著提高。
[0。引 2-2/在憐酸溶脹纖維素(PASC)底物上
[0136] 然后在第二種底物：憐酸溶脹纖維素（PASC)上確認(rèn)克隆76B4、105F11、107H12、 15464、202(：12、27249、278尸10、29382和309411活性的提高。
[0137] 根據(jù)上述相同的方案進(jìn)行該底物上的Kcat測定。用相同濃度的PASC底物替換CMC 底物。
[0138] 表3表示在PASC上的活性試驗的實驗條件下，克隆76B4、
[0139] 105。11、107刖2、15464、202(：12、27249、278。10、29382和309411相對于661參考蛋 白（SEQ ID NO:2)的Kcat值W及提高倍數(shù)。
[0140] 表3:在PASC上的內(nèi)切葡聚酶活性
[0141]
[
[0143] 結(jié)果表明酶活性相對于EGl參考酶(SEQ ID N0:2)提高。
[0144] 實施例2:第二輪k洗牌
[0145] 在第一輪進(jìn)化中獲得的改進(jìn)基因105。11、15464、202(：12、27249、278。10和309八10 (分別為沈Q ID ^:5、9、11、13、15、19)隨后進(jìn)行第二輪心洗牌(仍然根據(jù)6?110445781所述 的專利方法）。為了促進(jìn)木霉序列骨架的重構(gòu)，在第二輪心洗牌中將EGl參考基因 （SEQ ID N0:1)作為親本基因再次引入。
[014引 1-高通量篩選
[0147] 對該第二輪レ洗牌后所得的克隆進(jìn)行如上所述的高通量篩選試驗W選擇最佳克 隆?；钚栽囼灴s短到2小時（與篩選來自第一輪進(jìn)化的克隆的17個小時相比）W將第一輪心 洗牌所得的提高考慮在內(nèi)。
[0148] 將制備的克隆的活性與克隆154E4所得的活性相比。由第一輪洗牌產(chǎn)生的該克隆 能夠獲得活性的最大提高。
[0149] 在運(yùn)些篩選條件下，在幾個克隆中發(fā)現(xiàn)其內(nèi)切葡聚酶活性相對于154E4參考克隆 (沈Q ID ^:10)提高，尤其包括克隆1168和240化2。
[01加]2-測定內(nèi)切葡聚酶活性的提高 [0巧1] 2-1/在簇甲基纖維素(CMC)底物上
[0152] 為了測定Kcat,用如上所述的活性試驗測量克隆11G8、92A12和240H12的活性?；?性試驗的持續(xù)時間縮短到用底物解育1小時W將運(yùn)些克隆的提高考慮在內(nèi)。
[0153] 表4表示在運(yùn)些實驗條件下，克隆11G8、92A12和240H12相對于154E4克?。⊿EQ ID NO: 10)的Kcat值W及提高倍數(shù)。
[0154] 表4:在CMC上的內(nèi)切葡聚酶活性
[0155]
[
[0157] 結(jié)果表明，克隆11G8和240H12的活性相對于154E4參考克隆提高。
[015引 2-2/在憐酸溶脹纖維素(PASC)底物上
[0159] 然后在第二種底物:憐酸溶脹纖維素(PASC)上確認(rèn)克隆11G8、92A12和240H12活性 的提局。
[0160] 為了測定Kcat,用PASC作為底物通過如上所述的活性試驗測量運(yùn)些克隆在35和50 °C的活性。
[0161] 表5表示在運(yùn)些實驗條件下，克隆11G8、92A12和240H12相對于154E4克?。⊿EQ ID NO: 10)的Kcat值W及提高倍數(shù)。
[0162] 表5:在PASC上的內(nèi)切葡聚酶活性
[0163]
[0164] 在該底物上，克隆11G8的活性在35°C相對于參考克隆154E4沒有提高。另一方面， 克隆11G8的活性在50°C提高?？寺?40H12的活性在35 °C和50°C提高。
[01化]實施例3:在里氏木霉菌株化847 A EGl中克隆由第一輪心洗牌產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚酶1 變體
[0166] 通過PCR融合構(gòu)建待插入里氏木霉的DNA片段，所述片段包含由第一輪心洗牌產(chǎn)生 的克隆154E4。該片段長度為約5.4kb，由腐草霉素耐藥基因和在Cbhl啟動子W及之后的 Cbhl終止子控制下的克隆154E4的編碼序列組成。W相同的方式，擴(kuò)增里氏木霉EGl參考基 因 （SEQ ID N0:1)并將其融合至Cbhl啟動子和終止子之間，形成第二個構(gòu)建體。
[0167] 用扣g的各構(gòu)建體（即包含154E4基因或EGl基因的DNA片段)通過巧和陽G沖擊按照 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法轉(zhuǎn)化里氏木霉菌株化847 A EGl的原生質(zhì)體。在含有30yg^ 腐草霉素的PDA/薦糖選擇培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。將每次轉(zhuǎn)化的14個克隆繼代培養(yǎng)。在為獲 得分離的純克隆的=次繼代培養(yǎng)后，最終獲得7個整合天然基因的克隆和5個整合154E4變 體且分泌的蛋白水平與菌株化847相當(dāng)?shù)目寺　?br>[01側(cè) 1-在簇甲基纖維素(CMC)上用活性試驗篩選
[0169] 在含有W下培養(yǎng)基的24孔板中培養(yǎng)11個克?。好可囵B(yǎng)基中SOOiil 85%出P〇4、 4.2g(NH4)2S〇4、0.3g MgS〇4.7出0、1.5g玉米漿、Iml Oligo Ferment、11.6g馬來酸、IOg So化a-Floc和20g乳糖。將抑調(diào)節(jié)至5.8-6.0。于30°C培養(yǎng)5天后，移除上清液，將1〇111肖八蛋白 當(dāng)量（用Lowry方法測量）用于CMC上的活性試驗。將15化1在抑4.8、50mM巧樣酸緩沖液中的 2 % CMC溶液與15化1含有l(wèi)Omg/1蛋白的巧樣酸緩沖液混合。于50°C或35 °C解育反應(yīng)10分鐘， 然后在沸水浴中失活。離屯、5分鐘后，移除20iU上清液W用3,5-二硝基水楊酸(DNS)分析還 原糖。通過在540nm讀取吸光度來監(jiān)測DNS的還原和3-氨基-5-硝基水楊酸的形成，用葡萄糖 范圍定量還原糖。
[0170] 表6總結(jié)了與參考菌株化847、菌株化847 A EGl和用EGl參考基因再轉(zhuǎn)化的菌株 CL847 A EGl ( A EGIcEGI，用最佳的4個轉(zhuǎn)化體獲得平均值)相比，含有154E4變體的克隆的活 性。
[0171] 表6:在CMC上的內(nèi)切葡聚酶活性
[0172]
[
1234 結(jié)果表明，154E4變體的活性比用EGl參考基因 （SEQ ID NO: 1)再轉(zhuǎn)化的克隆高 1.2-1.4倍?？稍?5 °C和50 °C觀察到提高。 2
[01巧]2-在里氏木霉菌株化847 A EGl中克隆第二輪k洗牌后所得的11G8變體并篩選轉(zhuǎn) 化體： 3 通過BamHl/趾Ol雙消化，將11G8變體克隆入含有腐草霉素耐藥基因作為標(biāo)記的 PUT1040質(zhì)粒的Cbhl啟動子和終止子之間。用扣g的該載體轉(zhuǎn)化里氏木霉菌株化847 AEGl。 在于154E4變體相同的條件下進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化方法和目的是獲得純克隆的S次 連續(xù)繼代培養(yǎng)結(jié)束時，獲得蛋白產(chǎn)量與化847菌株相似的13個克隆，并通過測量CMCase活性 進(jìn)行篩選?；钚栽囼炁c篩選來自第一輪心洗牌的含有154E4變體的克隆相同。表達(dá)11G8變體 的6個克隆顯示高于A EGlcEG菌株的CMCase活性。最佳的兩個轉(zhuǎn)化體的活性與表達(dá)EGl參考 基因 （SEQ ID NO: 1)的菌株相比增加70%。 4 表7總結(jié)了與化847參考菌株、化847 A EGl菌株和用EGl參考基因再轉(zhuǎn)化的化847 A EGl菌株（AEGlcEGl，用最佳的4個轉(zhuǎn)化體獲得平均值)相比，含有l(wèi)lG8變體的克隆的活性。
[017引表7:在CMC上的內(nèi)切葡聚酶活性
[0179]
[0180] 結(jié)果表明，11G8變體的活性比用參考基因 SEQ ID NO: 1再轉(zhuǎn)化的克隆高1.1-1.7 倍?？稍?5 °C和50°C觀察到提高。
[0181] 實施例4: EGl參考內(nèi)切葡聚酶W及154E4改進(jìn)變體在釀酒酵母中的重組表達(dá) [01劇 1-在胞外培養(yǎng)基中參考EGl和154E4蛋白的產(chǎn)生
[0183] 將里氏木霉的內(nèi)切葡聚酶基因化Gl)和154E4變體的內(nèi)切葡聚酶基因不存在其信 號膚的情況下克隆入祀SC-Leua A myc載體(CNRS-CERMAV)。該構(gòu)建體允許在釀酒酵母菌株 EBYlOO的培養(yǎng)基中表達(dá)蛋白質(zhì)，所述菌株是亮氨酸和色氨酸營養(yǎng)缺陷型（Boder ET和 Withup KD,Biotechnol Prog, 1998,14:55-62)。該質(zhì)粒能夠?qū)⒒虮磉_(dá)置于半乳糖誘導(dǎo) 的GALl啟動子的控制下，且具有允許轉(zhuǎn)化體選擇的營養(yǎng)缺陷型可選自標(biāo)記基因化eu2)。
[0184] 根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法(通過熱休克和乙酸裡轉(zhuǎn)化酵母)進(jìn)行釀酒 酵母邸Y100的轉(zhuǎn)化。在0.67%YNB-2%Glc-0.01%T巧培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。
[0185] 用每個基因的一個轉(zhuǎn)化體（Sca-EGl 和 Sca-154E4)接種15ml0.67%YNB-2%Glc-SD-O.Ol%T巧的基本培養(yǎng)基。SD是氨基酸的混合物(40mg/l硫酸腺嚷嶺、20mg/l心精氨酸、 lOOmg/1天冬氨酸、lOOmg/1心谷氨酸、20mg/l心組氨酸、30mg/l心賴氨酸、20mg/l心甲 硫氨酸、50mg/lレ苯丙氨酸、375mg/lレ絲氨酸、200mg/lレ蘇氨酸、30mg/l心酪氨酸、 ISOmg^心鄉(xiāng)氨酸和20mg^尿喀晚）。于30°C W22化pm振搖預(yù)培養(yǎng)24小時后，用兩個菌株Sc Q-EGl和Sca-154E4接種（00600 = 0.5) 150ml 0.67%YNB-2%Gal-SD-0.0 l %!'巧培養(yǎng)基。于 25°C W22化pm振搖解育該培養(yǎng)物。解育8小時后，向各培養(yǎng)物中添加6ml P冊.6的巧樣酸鋼 W將抑穩(wěn)定在5。
[0186] 解育4天后，移除20ml培養(yǎng)物。于4°C在3000g離屯、5分鐘獲得培養(yǎng)物上清液。
[0187] 2-在對硝基苯基-0-乳糖巧上測定內(nèi)切葡聚酶活性
[018引通過在W下條件下，在70化1體積中水解對硝基苯基-0-乳糖巧(pNPL)底物測量培 養(yǎng)物上清液的內(nèi)切葡聚酶活性：
[0189] -P冊的50mM巧樣酸緩沖液；
[0190] -2mM pNPL
[0191] -來自Sca-154E4菌株的60化I和90iil培養(yǎng)物上清液；
[0192] -將Sca-EGl菌株于35°C或50°C解育30分鐘。
[0193] 向10化1反應(yīng)基質(zhì)中添加10化1 IM碳酸鋼停止反應(yīng)。通過測量415nm的吸光度并與 對硝基苯酪的標(biāo)準(zhǔn)范圍（0.36-360咖是線性)進(jìn)行比較來測定由pN化水解釋放的對硝基苯 酪(pNP)的濃度。
[0194] 表8表示Sca-EG巧日Sca-154E4菌株的培養(yǎng)基在35°C和50°C在pNPL上的內(nèi)切葡聚酶 活性結(jié)果（Wnmol .min-i .mL-i培養(yǎng)物表示EA)。
[01巧]表8:5。日-661和5。日-15464菌株的培養(yǎng)基在35°(：和50°(：在9肥1上的內(nèi)切葡聚酶活 性
[0196]
Lmw」所得結(jié)呆表明，相對十表皮里氏木霉EGl參考生日（SEQ ID N0:2)的面巧，Sca-154E4菌株在35°C的酶活性提高接近40倍。與大腸桿菌和里氏木霉相比注意到的活性提高 的量級表明，所述酶不僅提高特定活性，還過表達(dá)和/或更好地分泌。
[0刪 3-在簇甲基纖維素上測定內(nèi)切葡聚酶活性
[0199] 通過在W下條件下，在70化1體積中水解簇甲基纖維素 (CMC)測量培養(yǎng)物上清液的 內(nèi)切葡聚酶活性：
[0200] -P冊的50mM巧樣酸緩沖液；
[0201] -1%CMC;
[0202] -Sca-EGl和Sca-154E4菌株的21化1培養(yǎng)物上清液，所述上清液分別在IOkDa膜上 用P冊的50mM巧樣酸緩沖液透析并濃縮兩倍；
[0203] -于35°C解育48小時。
[0204] 向10化1反應(yīng)介質(zhì)中添加15化1 DNS試劑停止反應(yīng)。于100°C加熱5分鐘并在并上冷 卻后，通過測量550nm的吸光度并與用葡萄糖制備的標(biāo)準(zhǔn)范圍進(jìn)行比較來測定釋放的還原 糖的量。
[02化]圖1表示分別由Sca-EGl和Sca-154E4菌株分泌到培養(yǎng)基的EGl參考內(nèi)切葡聚酶 (沈Q ID N0:2)及其突變體154E4(沈Q ID N0:10)水解1%CMC的結(jié)果。
[0206] 圖1的結(jié)果表明，在反應(yīng)的第一個小時內(nèi)，每1ml Sca-154E4菌株的培養(yǎng)物釋放的 還原糖的量比Iml Sca-EGl高約10倍。與大腸桿菌和里氏木霉相比注意到的活性提高的量 級表明，所述酶不僅提高特定活性，還過表達(dá)和/或更好地分泌。
[0207] 實施例5:在補(bǔ)料瓶中通過里氏木霉生產(chǎn)酶
[020引在250ml化Ienmeyer瓶中培養(yǎng)參考菌株和在CMC上具有最佳活性的那些（CL847、 AEG1、A EGIcEGI、154E4/2、154E4/8、11G8/10、11G8/12、11G8/13)。接種55ml F45培養(yǎng)基 (lOg/1 鄰苯二甲酸鐘緩沖液、pH 6,4.2g/l(NH4)2S04、300mg/l MgS04.7H20、150mg/l CaCl2.2此0、1.5g/l玉米漿、0.07%正憐酸、5mg/l FeS04、1.4mg/l MnS04、1.4mg/l ZnS04、 3.7mg/l CoCb和12.5g/l葡萄糖），于30°CW15化pm振搖。酶的生產(chǎn)在兩個階段進(jìn)行:在葡 萄糖上的分批階段和在乳糖上的補(bǔ)料-分批階段。規(guī)律取樣可W測定葡萄糖濃度低于3g/l 的時刻。在運(yùn)個階段，開始使用注射累(6路）的補(bǔ)料-分批進(jìn)料。W40mg糖/g生物質(zhì)/小時的 流速用50g/l乳糖和0.3%N出為培養(yǎng)進(jìn)料。每天取樣W測定pH、干重和上清液中的蛋白濃 度。補(bǔ)料-分批培養(yǎng)5天后，用0.45WI1過濾器過濾培養(yǎng)物并將上清液冷凍。
[0209] 最終的蛋白濃度為約3-4g/l。如果濃度低于3g/l，在柱（Vivaspin MWC05, Sador ius)上濃縮上清液。
[0210] 實施例6:k洗牌產(chǎn)生的酶根據(jù)SHF方法水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的效率
[0211] 所使用的參考底物是小麥賴桿，所述小麥賴桿用0.0 l %出S化酸浸潰10小時，洗涂， 在P冊中和，壓制并干燥后，進(jìn)行汽爆預(yù)處理（19己-3分鐘）。表9表示參考底物的組成。 rn9i9i
[0213]表9:用于水解試驗的賴桿組成
[0214] 水解在10 %固體w/w進(jìn)行，即相當(dāng)于5.4 %纖維素 w/w。
[0215]將蛋白含量固定在lOmg/g固體，即約19mg/g纖維素。用BSA作為參考用Low巧方法 巧慢酶混合物的濃度。通過添加 SP1880-葡萄糖巧酶(Novozymes)向各混合物Wl20±2IU/g 纖維素的量補(bǔ)充e-葡萄糖巧酶活性。
[0216]在具有2ml工作量(Ig反應(yīng)量)的含有W下的Elppendorf管中進(jìn)行試驗：
[0217] -0.11 ±0.0 Olg洗涂的賴桿底物；
[0218] -0.9±0.02ml由PH4.8的50mM醋酸鹽緩沖液和氯霉素(0.05g/l)組成的水解反應(yīng) 基質(zhì)；
[0219] -取決于其蛋白含量，0.1-0.2 ±0.02g的酶混合物。
[0220] 在Elppendorf Thermomixer Comfort中，于45±2°C W900轉(zhuǎn)/分鐘的滿流攬拌進(jìn)行 酶促水解。
[0221] 所有試驗重復(fù)進(jìn)行，取樣時間固定在t24/48和96小時，一些在t72小時取樣。
[0222] 在各取樣時間，在滅菌的化pendorf管里將水解物煮沸5分鐘。然后冷卻并離屯、運(yùn) 些管。用HPLC進(jìn)行葡萄糖分析。平行地，將各化pendorf管中的固體殘留物洗涂，離屯、3次，并 于105 °C干燥24小時，從而評估WIS(水溶性固體）。將WIS考慮在內(nèi)計算水解產(chǎn)量。
[0223] 評估由實施例5產(chǎn)生的混合物。用同樣添加有0-葡萄糖巧酶的參考混合物進(jìn)行對 照試驗用于比較：由菌株化847 AEGU AEGl)產(chǎn)生的混合物，和由用EGl參考基因再轉(zhuǎn)化的 菌株化847 A EGl ( A EGIcEGI )產(chǎn)生的混合物。
[0224] 圖2表示由表達(dá)154E4變體(SEQ ID NO: 10)的菌株154/8產(chǎn)生的混合物的SHF結(jié)果。 [02巧]圖2的結(jié)果表明，154E4變體產(chǎn)生的混合物的初始水解速率高于A EGl和A EGIcEGI 參考混合物。其最終水解產(chǎn)量也高于A EGl和A EGlCEGl參考混合物。
[0226] 圖3表示由表達(dá)11G8變體的菌株11G8/10(SEQ ID N0:22)產(chǎn)生的混合物的細(xì)F結(jié) 果。
[0227] 圖3所示的結(jié)果表明，11G8變體產(chǎn)生的混合物的初始水解速率高于A EGl和A EGlCEGl參考混合物。其最終水解產(chǎn)量也高于A EGl和A EGlCEGl參考混合物。 帷引實施例7:酶根據(jù)SSF方法水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的效率
[0229] 使用的底物與表9所述的底物(實施例6)相同。
[0230] 在實驗室反應(yīng)器中進(jìn)行=次SSF。所述反應(yīng)器由W下元件組成：
[0231] -具有30ml工作量的玻璃瓶；
[0232] -聚酸酸酬(陽邸)安全塞；
[0233] -通過塞相連的Vaplock公司出售的DV-118單向閥。當(dāng)瓶中的相對壓力高于70m己 時，該閥設(shè)置為在出口打開；
[0234] -中空的聚丙締管，在一秒中固定，其通過所述塞，且用隔板將其配備于所述管的 下端；
[0235] -置于瓶頸和塞之間的平面密封。
[0236] 操作生物反應(yīng)器的原理如下：在乙醇發(fā)酵期間產(chǎn)生的C〇2積聚在位于反應(yīng)基質(zhì)上 方的頂部空間，通過積累造成生物反應(yīng)器內(nèi)壓力增加(Pc)。當(dāng)Pc高于打開單向閥的壓力(Ps) 時，所述閥打開W允許一定量的氣體排出，所述量例如通過稱重測定。當(dāng)化<Ps，閥再次關(guān)閉 直至化大于Ps。因此，運(yùn)行中的生物反應(yīng)器總是在壓力下，從而確保發(fā)酵的穩(wěn)定厭氧培養(yǎng)基。 通過C〇2的產(chǎn)生評估產(chǎn)生的乙醇量，所述C〇2的產(chǎn)生基于W下用于將葡萄糖發(fā)酵成乙醇的化 學(xué)計量方程通過重量損失來估計：
[0237] 仿化2〇6(葡萄糖）一 2C02巧C出C出OH(乙醇）+能量
[0238] 用于SSF的培養(yǎng)基是包含W下的水性培養(yǎng)基：
[0239] -P冊的50mM醋酸鹽緩沖液；
[0240] -O.lg/1 的氯霉素；
[0241] -含有3旨/11(此?〇4、2旨/1(畑4)25〇4、0.4旨/11旨5〇4.7出0和1旨/1酵母提取物的營養(yǎng) 培養(yǎng)基。
[0242] SSF在10±0.0 l %w/w固體進(jìn)行，即相當(dāng)于15±0.003g的總反應(yīng)質(zhì)量使用5.4%纖 維素 w/w。將蛋白含量固定在10±0.01mg纖維素酶/g固體，即約19mg/g纖維素。用BSA(牛血 清白蛋白）作為參考用Low巧方法測量酶混合物的濃度。通過添加 SP1880-葡萄糖巧酶 (Novozymes)向各混合物W120 ± 2IU/g纖維素的量補(bǔ)充0-葡萄糖巧酶活性。
[0243] 向培養(yǎng)基中添加糖發(fā)酵酵母(釀酒酵母，Ethano 1 Red菌株，F(xiàn)erment i S, France) W 獲得2 + 0.1 g/kg的含量。
[0244] 將已經(jīng)于35°C用緩沖液、氯霉素和培養(yǎng)基預(yù)處理過的小麥賴桿調(diào)節(jié)(condition)l 小時后，向生物反應(yīng)器中添加酶和酵母。
[0245] 在約35°C的溫度，通過將實驗室生物反應(yīng)器置于軌道旋轉(zhuǎn)速度為150轉(zhuǎn)/分鐘的 Infors HT Multitron標(biāo)準(zhǔn)解育器中進(jìn)行SSF反應(yīng)。
[0246] 通過稱重生物反應(yīng)器監(jiān)測重量隨時間的損失。在反應(yīng)結(jié)束時，將發(fā)酵液于IOCTC加 熱5分鐘，冷卻并離屯、W分離未水解固體和發(fā)酵液體。然后用氣相色譜分析后者W測定其乙 醇濃度。
[0247] 評估由實施例5產(chǎn)生的混合物。用同樣添加有(6-葡萄糖巧酶的參考混合物進(jìn)行對 照試驗用于比較：由菌株化847 AEGU AEGl)產(chǎn)生的混合物，和由用EGl參考基因再轉(zhuǎn)化的 菌株化847 A EGl ( A EGIcEGI )產(chǎn)生的混合物。
[0248] 圖4表示表達(dá)154E4內(nèi)切葡聚酶的兩種混合物的SSF結(jié)果（用2個變體獲得平均結(jié) 果)。
[0249] 圖4所示的結(jié)果表明，在100小時的過程中，表達(dá)154E4內(nèi)切葡聚酶的兩種混合物的 SSF進(jìn)展(相同劑量的酶的乙醇產(chǎn)量)高于A EGl和A EGlCEGl參考混合物。
[0250] 圖5表示表達(dá)11G8內(nèi)切葡聚酶的巧巾混合物的SSF結(jié)果（用兩個變體獲得的平均結(jié) 果)。
[0251] 圖5的結(jié)果表明，在100小時的過程中，表達(dá)11G8內(nèi)切葡聚酶的S種混合物的SSF進(jìn) 展(平均)高于A EG1和A EG1 cEG 1參考混合物。
【主權(quán)項】
1. 一種分離或純化的多肽，其特征在于，與EG1參考蛋白的內(nèi)切葡聚酶活性相比它的內(nèi) 切葡聚酶活性提高，所述多肽選自： i) 選自 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:24和 SEQ ID NO :26的氨基酸序列； ii) 與序列SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:12、 SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:22和SEQ ID NO: 24或SEQ ID N0:26具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同 一性百分比的氨基酸序列。2. -種純化或分離的核酸，其特征在于，它編碼至少一種如權(quán)利要求1所述的多肽。3. 如權(quán)利要求2所述的純化或分離的核酸，選自SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25。4. 一種載體，其特征在于它包含如權(quán)利要求2或3所述的核酸。5. -種分離的宿主細(xì)胞，其特征在于它包含如權(quán)利要求2或3所述的核酸或如權(quán)利要求 4所述的載體。6. 如權(quán)利要求5所述的分離的宿主細(xì)胞，其特征在于，它選自木霉、曲霉、鏈孢霉、腐質(zhì) 霉、毀絲霉、金孢霉、青霉、鐮刀菌、高溫單孢菌、芽孢桿菌、假單胞菌、埃希氏菌、梭菌、纖維 單胞菌、鏈霉菌、耶氏酵母、畢赤醇母和酵母。7. 如權(quán)利要求5或6所述的分離的宿主細(xì)胞，其特征在于，它選自里氏木霉、綠色木霉、 康氏木霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、文氏曲霉、米曲霉、海棗曲霉、嗜熱毀絲霉、Chrysosporium lucknowense、粗糙脈孢菌、灰腐質(zhì)霉、嗜松青霉、草酸青霉、大腸桿菌、丙酮丁醇梭菌、糖解 梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、畢赤酵母、解脂耶氏酵母和釀酒酵母。8. 如權(quán)利要求1所述的多肽用于水解纖維素的用途。9. 如權(quán)利要求1所述的多肽用于生產(chǎn)生物燃料的用途。10. -種能夠作用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶組合物，所述酶組合物由絲狀真菌產(chǎn)生且 包含至少一種如權(quán)利要求1所述的多肽。11. 一種用于從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的方法，其特征在于包含以下連續(xù)步驟： -將待水解的生物質(zhì)懸浮于水相； -在如權(quán)利要求10所述的酶組合物存在下水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)以產(chǎn)生含有葡萄糖的 水解物； -發(fā)酵水解物中的葡萄糖以產(chǎn)生發(fā)酵液； -從發(fā)酵液中分離生物燃料。12. -種用于從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的方法，其特征在于包含以下連續(xù)步驟： -將待水解的生物質(zhì)懸浮于水相； -同時加入如權(quán)利要求10所述的酶組合物和發(fā)酵生物以產(chǎn)生發(fā)酵液； -從發(fā)酵液中分離生物燃料。13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中發(fā)酵生物選自如權(quán)利要求5或6所述的宿主細(xì)胞。14. 一種用于從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的方法，其特征在于包含以下連續(xù)步驟： -將待水解的生物質(zhì)懸浮于水相； -加入一種或多種如權(quán)利要求5-7任一項所述的宿主細(xì)胞以及發(fā)酵生物和/或如權(quán)利要 求10所述的酶組合物以產(chǎn)生發(fā)酵液； -從發(fā)酵液中分離生物燃料。
【文檔編號】C12N15/56GK105874065SQ201480063413
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年11月21日
【發(fā)明人】A·馬爾若, Y·貝諾伊特, C·佩爾西永, C·艾林哈克, C·于爾曼, O·邦宗, S·福爾, S·阿爾芒, M·佩蒂, M·勒農(nóng)
【申請人】Ifp新能源公司, 普魯泰斯公司, 國家科學(xué)研究中心