Q IDN0·6所示，⑶NF-XhoI-mt-(-189)-F序列如SEQIDN0·7所示，⑶NF-XhoI-mt-(-189)-R 序列如 SEQ ID N0.8 所示，⑶NF-BglII-mt-(+45)-F 序列如 SEQ ID N0.9 所示， ⑶NF-BglII-mt-(+45)-R 序列如 SEQ ID NO. 10 所示。
[0023] 本發(fā)明所述的方法在探討同一啟動(dòng)子內(nèi)不同順式作用元件甲基化修飾水平變化 對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性的影響中的應(yīng)用。
[0024] 有益效果：
[0025] 本發(fā)明方法能夠?qū)崿F(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)目的基因啟動(dòng)子上特定順式作用元件甲基化修飾 水平的人為改變，進(jìn)而能夠深入探討同一啟動(dòng)子內(nèi)不同順式作用元件甲基化修飾水平變 化對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性的貢獻(xiàn)份額，為DNA甲基化修飾影響基因轉(zhuǎn)錄方面的研宄提供了新的手 段，提升了 DNA甲基化與基因轉(zhuǎn)錄研宄的精細(xì)化程度。此外，本發(fā)明方法還初步揭示了膠質(zhì) 瘤細(xì)胞中GDNF基因高轉(zhuǎn)錄的原因。
【附圖說明】
[0026] 圖1.⑶NF基因野生型啟動(dòng)子II區(qū)熒光素酶載體的構(gòu)建
[0027] (A)⑶NF基因啟動(dòng)子拼接PCR電泳圖.泳道1-2 :⑶NF基因野生型啟動(dòng)子II區(qū)片 段（目的條帶：1469bp)。（B)pMD19T-GDNF-promoter Il-wt載體的雙酶切鑒定圖。泳道 I- 2 :KpnI和HindIII雙酶切pMD19T-GDNF-promoter Il-wt質(zhì)粒后的電泳片段（目的條 帶：1459bp)。（C)pGL3-GDNF-promoter Il-wt重組載體的雙酶切鑒定圖·泳道1-2ΚρηΙ和 HindIII對(duì)重組載體質(zhì)粒雙酶切后電泳條帶（目的條帶：1486bp) UL5000DNA Marker (從 上到下分別為 5000, 3000, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250, IOObp)
[0028] 圖2.⑶NF基因突變型啟動(dòng)子II區(qū)熒光素酶載體的構(gòu)建
[0029] ⑷突變型⑶NF基因啟動(dòng)子II區(qū)的PCR擴(kuò)增。泳道1-2 :引物⑶NF-Kpn I-wt-Fl 和⑶NF-HindIII-wt-R24 對(duì)目的片段的 PCR 擴(kuò)增。（B)pGL3-GDNF-promoter ΙΙ-mt 重組載 體酶切鑒定。泳道1-2 :限制性內(nèi)切酶KpnI和HindIII對(duì)重組載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切（目的 條帶：1463bp)。Ml :DL2000DNA Marker (從上至下分別為 2000, 1000, 750, 500, 250, IOObp); M:DL5000DNA Marker
[0030] 圖3突變型⑶NF基因啟動(dòng)子II區(qū)能夠分離各順式作用元件且未改變?cè)搯?dòng)子的 啟動(dòng)活性
[0031] (A)人類⑶NF基因結(jié)構(gòu)不意圖。上半部分顯不其啟動(dòng)子、夕卜顯子、內(nèi)含子的相對(duì) 位置及它們的堿基長度（根據(jù)EMBL-bank中數(shù)據(jù)修訂，原圖自Baecker et al，1999);虛線 所示區(qū)域?yàn)镚DNF基因的啟動(dòng)子II區(qū)，包含兩個(gè)增強(qiáng)子、兩個(gè)沉默子、核心啟動(dòng)子及多個(gè)轉(zhuǎn) 錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其DNA刻度線上的刻度線代表CpG二核苷酸，刻度線上方標(biāo)注了突變獲得 的甲基化不敏感的限制性酶切位點(diǎn)所處的位置，本發(fā)明的對(duì)象為-1300bp至+149bp區(qū)域。 (B)pGL3-GDNF-promoterII-mt質(zhì)粒中⑶NF基因啟動(dòng)子II區(qū)不同順式作用元件雙酶切鑒 定圖。泳道I :KpnI和HindIII雙酶切啟動(dòng)子II區(qū)（目的條帶：1463bp)，泳道2 :SacI和 MluI雙酶切增強(qiáng)子II (目的條帶：841bp)，泳道3 :XhoI和BglII雙酶切核心啟動(dòng)子區(qū)（目 的條帶：241bp)，泳道4 :MluI和XhoI雙酶切沉默子II (目的條帶：149bp)。M:DL5000DNA Marker (從上到下分別為 5000, 3000, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250, IOObp) (C)點(diǎn)突變對(duì) ⑶NF基因啟動(dòng)子II區(qū)啟動(dòng)活性的影響。分別將I. 0 μ g pGL3-Basic、pGL3-GDNF-promoter II- wt和pGL3-GDNF-promoter Il-mt超螺旋質(zhì)粒與pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，隨后對(duì) 細(xì)胞裂解液進(jìn)行熒光素酶活性測定，并用海腎螢光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化螢火蟲熒光素酶活性。 數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。
[0032] 圖4. M. SssI能夠高甲基化修飾熒光素酶載體中的突變型⑶NF基因啟動(dòng)子II區(qū)
[0033] (A)pGL3_GDNF-promoter Il-mt 質(zhì)粒 Hha I 酶切電泳圖。泳道 I :M. SssI 孵 育后pGL3-GDNF-promoter Il-mt質(zhì)粒的Hha I酶切圖；泳道2 :未經(jīng)Μ. SssI孵育的 pGL3_GDNF-promoter IIiit 質(zhì)粒 Hha I 酶切圖；M:DL15000DNA marker (從上至下分別為 15000, 10000, 7500, 5000, 3000, 1500, 1000, 500)(B)BSP 檢測 pGL3-GDNF-promoter Il-mt 載體中⑶NF基因啟動(dòng)子II區(qū)（增強(qiáng)子II中48(23+25)個(gè)CpG，沉默子II中11個(gè)CpG) 和熒光素酶基因部分編碼區(qū)序列（14個(gè)CpG)的甲基化情況，其中紅色方框代表增強(qiáng)子II 中的CpG，綠色方框代表沉默子II中的CpG ;黑色圓圈表示發(fā)生甲基化的位點(diǎn)，白色表示 未發(fā)生甲基化的位點(diǎn)；每一行代表該樣本的一個(gè)克隆測序結(jié)果中所有的CpG，所用引物為 ffl)NF-enhancer-F/R(l-2)，a)NF-silencer-F/R*Luc-CDS-F/R。
[0034] 圖5.甲基化的pGL3-GDNF-promoter Il-mt質(zhì)粒能夠在DH5a和HST02菌株中 擴(kuò)繁，但新質(zhì)粒原有甲基化修飾丟失將體外成功甲基化的pGL3-GDNF-promoter Il-mt質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化DH5 a或mrr, hsdRMS, mcrBC, mcrA缺失的HST02菌株，經(jīng)菌株擴(kuò)繁后提取質(zhì)粒，利 用BSP法檢測所得質(zhì)粒的甲基化情況。結(jié)果顯示，DH5a和HST02菌株均能夠擴(kuò)繁甲基化 的pGL3_GDNF-promoter IIiit質(zhì)粒，但是BSP測序結(jié)果表明新產(chǎn)生的pGL3_GDNF-promoter Il-mt質(zhì)粒丟失了原有的甲基化修飾，其中每一個(gè)圓圈代表一個(gè)CpG，黑色圓圈表示發(fā)生甲 基化的位點(diǎn)，白色表示未發(fā)生甲基化的位點(diǎn)；每一行代表該樣本的一個(gè)克隆測序結(jié)果中所 有的 CpG，所用引物為⑶NF-enhancer-F/R(l-2)和⑶NF-silencer-F/R。
[0035] 圖6.環(huán)形質(zhì)粒中⑶NF基因啟動(dòng)子II區(qū)的啟動(dòng)子活性檢測（A)連接產(chǎn)物的電泳 圖。單端連接成功的線性質(zhì)粒DNA用細(xì)箭頭表示，連接成功的環(huán)形質(zhì)粒DNA用粗箭頭表示， 線性骨架質(zhì)粒DNA用彎箭頭表示，泳道最下方條帶為未連接的啟動(dòng)子區(qū)DNA小片段。（B) 利用限制性內(nèi)切酶KpnI和HindIII大量酶切pGL-GDNF-promoter Il-mt質(zhì)粒，凝膠回收對(duì) 應(yīng)的⑶NF基因啟動(dòng)子后重新連至熒光素酶載體骨架上，并將I. 0 μ g連接產(chǎn)物（LP)、純化 后的環(huán)形質(zhì)粒（LPpur)和超螺旋質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，48h后進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢 測。結(jié)果顯示：連接產(chǎn)物中的啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)下游熒光素酶基因的表達(dá)，但啟動(dòng)效率僅為 相同質(zhì)量原始超螺旋質(zhì)粒的10%左右（P〈〇. 001);純化的環(huán)形質(zhì)粒的啟動(dòng)子效率顯著上升 (Ρ〈0· 01)，達(dá)到相同質(zhì)量原超螺旋質(zhì)粒的50%左右。**表示Ρ〈0· 01，林*表示P〈0. OOlvs pGL-GDNF-PII-mt 組；## 表示 Ρ〈0· Olvs ⑶NF-PII-mt-LP 組
[0036] 圖7.各環(huán)形質(zhì)粒中⑶NF基因啟動(dòng)子II區(qū)不同順式作用元件的甲基化水平BSP 結(jié)果顯示：各環(huán)形質(zhì)粒中M. SssI處理的順式作用元件甲基化程度均大于90%，未處理區(qū)域 未發(fā)生甲基化修飾。其中，黑色圓圈表示發(fā)生甲基化的位點(diǎn)，白色表示未發(fā)生甲基化的位 點(diǎn)；每一行代表該樣本的一個(gè)克隆測序結(jié)果中所有的CpG，所用引物為⑶NF-enhancer-F/ R(l-2)和⑶NF-silencer/core P-F/R。
[0037] 圖8.⑶NF基因啟動(dòng)子II區(qū)不同順式作用元件甲基化修飾改變對(duì)該啟動(dòng)子啟動(dòng)活 性的影響將帶有不同甲基化模式的GDNF基因啟動(dòng)子II區(qū)環(huán)形質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞， 48h后進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測，分析各順式作用元件甲基化修飾改變對(duì)⑶NF基因啟動(dòng) 子II區(qū)啟動(dòng)活性的影響。以未甲基化的⑶NF基因啟動(dòng)子II區(qū)環(huán)形質(zhì)粒作為對(duì)照組。*表 示P〈0. 05, **表示P〈0. Olvs⑶NF-PII-mt組。數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù) 3次，每次3個(gè)復(fù)孔。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 實(shí)施例1野生型⑶NF基因啟動(dòng)子II區(qū)的分子克隆和載體構(gòu)建
[0039] 按照GenBank提供的人類⑶NF基因啟動(dòng)子II區(qū)序列（序列號(hào)AF053749)，設(shè)計(jì)合 成帶有重復(fù)序列的49條寡聚核苷酸片段（見表1)，并在啟動(dòng)子II區(qū)的5'端添加 Kpn I酶 切位點(diǎn)，3'端添加 Hind III酶切位點(diǎn)。利用三輪拼接PCR獲得了與預(yù)