專利名稱：一種優(yōu)化大腸桿菌脂肪酸合成途徑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種優(yōu)化大腸桿菌脂肪酸合成途徑的方法。
背景技術(shù)：
隨著石油資源的緊缺以及環(huán)境的日益惡化，人們對既環(huán)保又可再生的能源的需求變得越來越迫切，而生物能源應(yīng)此而生。目前，可利用的商業(yè)化生物燃料包括來自于玉米和蔗糖的短鏈的醇類以及來自于油菜和動物油脂的脂肪酸甲酯衍生物，但這些生物燃料卻存在著所需原料與人類本身需求相矛盾的問題。為了克服這些缺陷，最好的方法便是利用發(fā)酵法生產(chǎn)生物燃料，這些生物燃料主要包括短鏈的醇類、類異戊二烯合成途徑中的碳?xì)浠衔镆约拔⑸镏舅嵫苌?。目前為止，能生產(chǎn)生物燃料的微生物主要包括細(xì)菌、真菌、 酵母、微藻，但由于天然菌株不能高效合成脂肪酸，油脂產(chǎn)量有限，且天然脂肪酸多為胞內(nèi)分泌，必須從組織、細(xì)胞中分離后，才能應(yīng)用于生物柴油生產(chǎn)，分離過程關(guān)系到生物柴油的質(zhì)量、成本以及對環(huán)境的污染。而與天然菌株相比，大腸桿菌具有遺傳背景清楚，易于工程調(diào)控，可高密度發(fā)酵，生長速度快等諸多優(yōu)點，已經(jīng)成為微生物催化合成化學(xué)品和燃料的理想受體菌，近年來通過對大腸桿菌的改造生產(chǎn)生物柴油已取得一定的成果。因此本文以大腸桿菌為出發(fā)菌株，利用基因工程手段來提高其胞外脂肪酸的產(chǎn)量。大腸桿菌脂肪酸生物合成與調(diào)控機制已得到廣泛的研究。人們對大腸桿菌的脂肪酸合成途徑已有了深入的研究，往往把大腸桿菌的脂肪酸合成途徑當(dāng)做類型II脂肪酸合成酶系的|吳型。大腸桿菌飽和脂肪酸的合成可分為三步進行。第一步是原料合成，由丙二酸單酰CoA = ACP轉(zhuǎn)酰基酶(FabD)催化，將丙二酸單酰CoA轉(zhuǎn)變成丙二酸單酰ACP。第二步為起始反應(yīng)，由β -酮脂酰ACP合成酶III (FabH)將丙二酸單酰ACP與乙酰CoA縮合成乙酰乙酰ACP。第三步為循環(huán)反應(yīng)，有多種酶催化，依次進行，每一次循環(huán)脂酰碳鏈增加兩個CH2基團，直到形成棕櫚脂酰ACP，循環(huán)反應(yīng)首先由NADPH依賴的β-酮脂酰ACP還原酶(FabG)催化β -酮脂酰ACP還原，生成β -羥脂酰ACP，接著產(chǎn)物脫水，生成反-2-烯酰ACP，這一反應(yīng)由β -羥脂酰ACP脫水酶(FabZ或FabA)催化，循環(huán)反應(yīng)的最后一步是反_2_烯酰ACP還原，由NADPH依賴烯酰ACP還原酶(FabI)催化，生成脂酰ACP，接著開始下一循環(huán)，丙二酸單酰ACP和脂酰ACP在β -酮脂酰ACP合成酶I或II (FabB或FabF)縮合成β -酮脂酰ACP，然后依次被還原(FabG)Jj^jC (FabZ或FabA)和再還原(FabI)。大腸桿菌不飽和脂肪酸的合成是按以下方式進行當(dāng)脂酰鏈延伸至10個碳時，即形成β -羥基癸脂酰ACP時，該產(chǎn)物經(jīng)FabA或FabZ脫水，生成反-2-癸烯酰ACP，由于FabA還具有異構(gòu)酶活性，反-2-癸烯酰ACP同時被異構(gòu)化，產(chǎn)生順-3-癸烯酰ACP，該產(chǎn)物不能被FabI還原，只能作為FabB的底物，與丙二酸單酰ACP縮合成順_5_ β -酮基十二碳烯酰ACP,然后，該產(chǎn)物進入脂肪酸合成的循環(huán)反應(yīng)，最終產(chǎn)生棕櫚油酰ACP。在大腸肝菌脂肪酸合成途徑中，硫酯酶基因(TesA)可催化水解脂酰基ACP生成游離脂肪酸和ACP，解除由脂酰ACP導(dǎo)致的脂肪酸生物合成調(diào)節(jié)機制中的反饋抑制作用，釋放游離脂肪酸。有關(guān)文獻報道在大腸桿菌內(nèi)過表達內(nèi)源或植物硫酯酶基因，可產(chǎn)生游離脂肪酸。TesA’是經(jīng)改造后的TesA片段，通過去除原基因N端的信號序列，使原本分布在周質(zhì)空間的硫酯酶定位在胞質(zhì)內(nèi)，更好地發(fā)揮水解脂酰基ACP的功能。
權(quán)利要求
1.一種優(yōu)化大腸桿菌脂肪酸合成途徑的方法，其特征在于，在過表達大腸桿菌脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵基因FabG、FabZ, Fab1、TesAj的步驟中，將不同數(shù)量的大腸桿菌稀有密碼子AGG分別插入所述大腸桿菌脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵基因FabG、FabZ、Fab1、TesA’中，所述AGG為編碼精氨酸的密碼子。
2.如權(quán)利要求1所述的優(yōu)化大腸桿菌脂肪酸合成途徑的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)構(gòu)建精氨酸氨酰tRNA合成酶tRNAtog； 構(gòu)建插入大腸桿菌稀有密碼子AGG的大腸桿菌脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵基因分別在大腸桿菌脂肪酸代謝途徑的關(guān)鍵基因FabG、FabZ、Fab1、TesA’的起始密碼子之后插入不同數(shù)量的大腸桿菌稀有密碼子AGG ； (2)用上述制備的大腸桿菌脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵基因進行質(zhì)粒的構(gòu)建； (3)將上述構(gòu)建的質(zhì)粒進行表達，得到表達菌株，從而構(gòu)建出大腸桿菌生產(chǎn)脂肪酸系統(tǒng)。
3.如權(quán)利要求2所述的優(yōu)化大腸桿菌脂肪酸合成途徑的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，在制備所述大腸桿菌脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵基因FabG、FabZ、Fab1、TesA’的引物中加入相應(yīng)數(shù)量的大腸桿菌稀有密碼子AGG，直接PCR擴增，獲得在FabG、FabZ、Fab1、TesA ’基因的起始密碼子之后插入了大腸桿菌稀有密碼子AGG的大腸桿菌脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵基因。
4.如權(quán)利要求2或3所述的優(yōu)化大腸桿菌脂肪酸合成途徑的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，在FabG、FabZ、Fab1、TesA’中分別插入8、4、4、I個大腸桿菌稀有密碼子AGG。
5.—種根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法構(gòu)建的大腸桿菌生產(chǎn)脂肪酸系統(tǒng)。
6.一種權(quán)利要求5所述的大腸桿菌生產(chǎn)脂肪酸系統(tǒng)在大腸桿菌合成脂肪酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種優(yōu)化大腸桿菌脂肪酸合成途徑的方法，在構(gòu)建大腸桿菌脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵蛋白FabG、FabZ、FabI、TesA’的步驟中，將不同數(shù)量的大腸桿菌稀有密碼子AGG分別插入所述大腸桿菌脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵基因FabG、FabZ、FabI和TesA’中。本發(fā)明的方法可以在生物體內(nèi)對基因表達進行精確地調(diào)控，進而優(yōu)化相應(yīng)代謝途徑，采用本發(fā)明方法構(gòu)建的大腸桿菌生產(chǎn)脂肪酸系統(tǒng)可以高效地生產(chǎn)胞外脂肪酸，其脂肪酸產(chǎn)量約為無稀有密碼子AGG的非調(diào)控系統(tǒng)的兩倍。
文檔編號C12N15/70GK103014027SQ20121048935
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月26日
發(fā)明者馬鋼, 賀林, 王右, 王毓舒 申請人:上海交通大學(xué)