臍帶來源間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種臍帶來源間充質(zhì)干細胞的原代提取方法及在此基礎(chǔ)上可獲得大量的不涉及動物成分的間充質(zhì)干細胞的傳代培養(yǎng)操作方法，以及所述獲得的間充質(zhì)干細胞在自身免疫性疾病中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細胞的自我更新及多項分化潛能，在組織損傷與修復(fù)中的應(yīng)用越來越廣泛。另外，其分泌的多種細胞因子，對人體的內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)有重要的調(diào)節(jié)作用。間充質(zhì)干細胞的來源從最初發(fā)現(xiàn)的骨髓，發(fā)展到臍帶、臍帶血、牙齒、胎盤、胚胎肝、脂肪等多種組織。但這些來源中，骨髓和脂肪來源取材給患者帶來痛苦，而且骨髓中間充質(zhì)含量小，骨髓源MSC細胞數(shù)量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，所以不適合廣泛應(yīng)用。胚胎來源的存在倫理問題。因而，經(jīng)過多年實踐，人們普遍認為臍帶仍是間充質(zhì)干細胞的最佳來源。取材方便，不給患者帶來痛苦，沒有倫理限制。而其他來源或多或少存在一些不盡人意的問題。
[0003]臍帶間充質(zhì)干細胞的基礎(chǔ)和應(yīng)用研宄越來越受到研宄者的青睞。臍帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)方法已有報道，包括組織貼壁法、酶消化法及兩種細胞聯(lián)合的方法。而每種方法的框架下，又有不同的操作細節(jié)。而且不同方法得到的干細胞的數(shù)量和質(zhì)量也大不相同。如酶消化法:使用的酶包括膠原酶、胰酶等。消化液的濃度及消化時間對細胞的得率影響很大。此種方法操作步驟繁瑣、時間長、污染幾率大。組織貼壁法又有不同的方式及操作細節(jié)，對細胞的原代提取質(zhì)量和數(shù)量及后續(xù)的傳代效果都有一定的影響。再生醫(yī)學(xué)的研宄和臨床實踐需大量的種子細胞，目前，大部分的細胞培養(yǎng)均添加胎牛血清，增加了動物成分的影響及各種動物病毒感染的危險。因此，尋找一種不含動物成分、易操作的、能普遍應(yīng)用的、成本較低的、可安全應(yīng)用于臨床試驗治療的臍帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)方法具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種不含動物成分、易操作的、能普遍應(yīng)用的、成本較低的可用于臨床試驗治療的臍帶源間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)方法。另一方面，由于臍帶源間充質(zhì)干細胞具有免疫調(diào)節(jié)能力，本發(fā)明提供了臍帶源間充質(zhì)干細胞在血小板減少性紫癜(一種免疫性疾病)中的用途。
[0005]本發(fā)明的第一方面涉及一種無動物成分的臍帶源間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)方法，其包括如下步驟:
[0006]I)獲得臍帶組織，洗凈，并剝離臍動脈和臍靜脈；
[0007]2)在小燒杯中將來自步驟I)的臍帶組織剪細成泥狀；
[0008]3)用含血清替代物的培養(yǎng)基懸浮剪碎的臍帶組織，離心后去上清；
[0009]4)使用不銹鋼攪拌棒將剪碎的臍帶組織混合均勻；
[0010]5)用塑料巴氏吸管將步驟4)中混合均勻的臍帶組織吸取至細胞培養(yǎng)瓶中；
[0011]6)用不銹鋼攪拌棒的平頭一側(cè)，力度較輕地將臍帶組織擺成芯片點陣形狀；
[0012]7)加入含血清替代物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)；
[0013]8)用TrypLE解離酶消化細胞、傳代到T182的培養(yǎng)瓶中，獲得Pl代臍帶源間充質(zhì)干細胞。
[0014]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中步驟2)的小燒杯是1mL燒杯。
[0015]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中不銹鋼攪拌棒一側(cè)為圓柱狀、另一側(cè)制成扁平狀，優(yōu)選其長度為20-30cm。
[0016]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述塑料巴氏吸管的開口直徑為3_5mm。
[0017]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其進一步包括傳代所獲得的Pl代臍帶源間充質(zhì)干細胞的步驟。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的臍帶源間充質(zhì)干細胞在制備用于治療過敏性紫癜的藥物中的用途。
[0019]根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中所述臍帶源間充質(zhì)干細胞是P4代臍帶源間充質(zhì)干細胞。
[0020]一種用于從臍帶組織分離臍帶源間充質(zhì)干細胞的裝置，其包括1mL燒杯、不銹鋼攪拌棒和塑料巴氏吸管，其中所述不銹鋼攪拌棒一側(cè)為圓柱狀、另一側(cè)制成扁平狀，其長度為20-30cm ;所述塑料巴氏吸管的開口直徑為3-5mm。
【附圖說明】
[0021]圖1:顯示臍帶組織剝離出2根臍動脈和I根臍靜脈。
[0022]圖2:顯示在1ml小燒杯中剪碎臍帶組織。
[0023]圖3:顯示用剪去尖嘴的巴氏吸管吸取臍帶組織。
[0024]圖4:顯示用自制的不銹鋼棒均勻分布臍帶組織為點陣狀。
[0025]圖5:顯示將培養(yǎng)瓶倒置，使臍帶組織倒貼壁并加入培養(yǎng)基。
[0026]圖6:顯示原代培養(yǎng)8天時，觀察組織周圍有細胞爬出。
[0027]圖7:顯示細胞擴增生長布滿整個瓶底。
[0028]圖8A-8H:顯示臍帶源間充質(zhì)干細胞流式細胞術(shù)檢測鑒定的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0029]下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。
[0030]下述實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均可容易地從商業(yè)公司獲取。
[0031]實施例1臍帶源間充質(zhì)干細胞的制備方法
[0032]1、主要試劑與耗材:
[0033]a-MEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，血清替代物(達科為公司，Hel1s UltraGROTM)。細胞解離酶TrypLETMSelect (Life公司)，生理鹽水(巨能藥業(yè))，T75的細胞培養(yǎng)瓶(NEST公司，聚苯乙烯材質(zhì))，T182的細胞培養(yǎng)瓶(JET公司)，流式細胞術(shù)檢測用抗體CD14、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR 及其同型對照購自美國 eb1science 公司。1ml小燒杯，自制不銹鋼攪拌棒:制成細的、一定長度，其中，其直徑為3-5mm，長度20_30cm，且能探入到培養(yǎng)瓶的底部角落；所述不銹鋼攪拌棒一側(cè)為圓柱狀、另一側(cè)制成扁平狀，方便推動泥狀的臍帶組織，并將其均勻分布成點陣狀，有利于細胞之間相互促進生長。本不銹鋼棒能高壓滅菌，方便操作，節(jié)約成本。塑料巴氏吸管(JET公司)，由于在吸取臍帶剪后泥狀組織時，用尖嘴無菌的槍頭或吸管容易堵，所以，所述塑料巴氏吸管的尖嘴剪掉，使其開口為3-5mm，吸取方便，是比較簡便的一次性無菌工具。
[0034]2、設(shè)備:
[0035]二氧化碳培養(yǎng)箱(美國THERMO公司371型)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司CKX41型)，大容量低速離心機(美國THERMO公司Multifuge 4KR)，