一種誘導(dǎo)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化為胰腺細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種誘導(dǎo)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化為胰腺 細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝性疾病，是由胰島素分泌和 (或）胰島素作用缺陷引起的。胰島移植已被認(rèn)為是最有希望治愈糖尿病的方法。但胰島 移植手術(shù)需要2-3個(gè)供體來(lái)滿(mǎn)足一位患者的需求，胰島供體嚴(yán)重不足限制了胰島移植的廣 泛臨床應(yīng)用。因此，尋找胰島細(xì)胞的再生來(lái)源（或替代細(xì)胞）是丞待解決的問(wèn)題。
[0003] 隨著干細(xì)胞與組織工程領(lǐng)域的相關(guān)研宄飛速發(fā)展，人們將尋找胰島細(xì)胞再生來(lái)源 的目光集中在了干細(xì)胞身上。目前，能分化產(chǎn)生胰島素分泌細(xì)胞（IPCS)的干細(xì)胞主要分三 類(lèi)：成體干細(xì)胞（ASCs)，胚胎干細(xì)胞（ESCs)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs)。
[0004] iPSCs來(lái)源的胰島細(xì)胞，目前面臨兩大難題：①形成的效率低；②外源性因子的導(dǎo) 入帶來(lái)致癌性風(fēng)險(xiǎn)，這嚴(yán)重阻礙其深入研宄及后續(xù)應(yīng)用。
[0005] 目前，ESCs與iPSCs主要通過(guò)以下模式：干細(xì)胞一內(nèi)胚層細(xì)胞一胰腺祖細(xì)胞一胰 腺內(nèi)分泌祖細(xì)胞一IPCs，聯(lián)合小分子化合物及細(xì)胞因子可誘導(dǎo)ESCs或ips細(xì)胞向IPCs定 向分化。
[0006] 2006年D'Amour等首先運(yùn)用五步法將人ESCs在體外誘導(dǎo)分化為IPCs，其中胰島 素陽(yáng)性細(xì)胞的平均比率為7. 3%。2007年，Jiang等僅用四種化合物（ActinA，RA，bFGF， Nic)成功將人ESCs誘導(dǎo)分化為Ins7SST7Gluc+的胰腺細(xì)胞群，其中胰島素陽(yáng)性細(xì)胞比率 > 15%。然后，Kunisada等運(yùn)用四步法成功誘導(dǎo)人ips細(xì)胞分化為Ins+/SST+/Gluc+/Ghre + 的胰腺細(xì)胞群，但其分化效率只有16. 9%。自2007年，人ips細(xì)胞的誕生避免了 ESCs應(yīng) 用的倫理學(xué)問(wèn)題，也為IPCs誘導(dǎo)分化研宄提供了新的細(xì)胞來(lái)源。值得注意的是，Deng等人 2009年依據(jù)類(lèi)似于D'Amour等的胰腺發(fā)育模式，采用四步化合物誘導(dǎo)法成功誘導(dǎo)hiPSCs分 化為的胰島素分泌細(xì)胞，其分化效率高達(dá)25%。Deng等的采用的誘導(dǎo)方法是目前分化效率 相對(duì)較高，成熟度相對(duì)較高的（共表達(dá)insulin和Mafa)。
[0007] LSDl (又名 KIAA0601，KDMl，A0F2, BHCl 10)是黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD)依賴(lài)性 的胺氧化酶，屬單胺氧化酶家族的一個(gè)成員，在ESs、iPSCs及多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。
[0008] 起初，人們對(duì)LSDl的研宄主要集中腫瘤領(lǐng)域。2008年，Shao等使用LSDl的抑制 劑bisguanidine Ic抑制小鼠胚胎干細(xì)胞LSDl活性后，細(xì)胞中的0ct4(P0U5Fl)基因表達(dá) 上調(diào)，且發(fā)生不可逆性的發(fā)育阻滯，可見(jiàn)LSDl對(duì)小鼠胚胎發(fā)育是不可或缺的，且在全基因 DNA甲基化修飾過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Zhang等指出LSDl高表達(dá)的腫瘤干細(xì)胞通常伴有 多能性基因中0ct4和Sox2基因的表達(dá)，當(dāng)LSDl失活時(shí)會(huì)抑制這些多能性基因的表達(dá)，這 提示LSDl調(diào)控干細(xì)胞增殖分化的過(guò)程與多能性基因0ct4、Sox2的表達(dá)水平密切相關(guān)。另 外，Whyte等人研宄發(fā)現(xiàn)，LSDl在小鼠 ESCs分化過(guò)程中可能通過(guò)錨定ESCs中多能性基因 0ct4、S〇X2、Nan〇g等的增強(qiáng)子區(qū)域，使多能性基因的增強(qiáng)子失去作用，從而不能正常啟動(dòng)多 能性基因的表達(dá)，促進(jìn)了 ESCs的分化發(fā)育。人胚胎干細(xì)胞中，LSDl通常也維持著相對(duì)較高 的表達(dá)水平，伴隨其分化發(fā)育其表達(dá)水平逐漸下降。2011年，Adamo等利用shRNA敲除人 ESCs的LSDl后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的H3K4me2/me3水平升高，細(xì)胞開(kāi)始分化，進(jìn)一步研宄發(fā)現(xiàn)LSDl 通過(guò)REST結(jié)構(gòu)域銷(xiāo)定在0ct4和Nanog的共價(jià)結(jié)構(gòu)內(nèi)，伴隨LSDl的敲除0ct4和Nanog基 因也被沉默，最終ESCs細(xì)胞自我更新能力降低，細(xì)胞開(kāi)始轉(zhuǎn)向分化。Sun等發(fā)現(xiàn)LSDl對(duì)維 持神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化也具有重要意義。利用LSDl抑制劑反環(huán)苯丙胺（TCP)或RNAi 抑制LSDl基因的表達(dá)，均能下調(diào)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力（后者效果更為顯著）。2013年， Tanabe等人發(fā)現(xiàn)由人角質(zhì)細(xì)胞重編程獲得的iPSCs也高表達(dá)LSD1，抑制LSDl基因表達(dá)后 可促進(jìn)iPSCs向造血譜系細(xì)胞分化。以上研宄結(jié)果表明，LSDl的表達(dá)調(diào)控對(duì)為維持干細(xì)胞 的增殖、分化平衡十分重要，除了對(duì)組蛋白甲基化水平的修飾外，其很可能通過(guò)共價(jià)修飾作 用直接參與基因的表達(dá)調(diào)控，深入研宄其調(diào)控機(jī)制對(duì)干細(xì)胞的相關(guān)研宄均具有指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供抑制LSDl基因表達(dá)的物質(zhì)的用途。
[0010] 本發(fā)明提供了抑制LSDl基因表達(dá)的物質(zhì)在誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為內(nèi)胚層細(xì)胞中 應(yīng)用；
[0011] 或抑制LSDl基因表達(dá)的物質(zhì)在誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為胰腺細(xì)胞中應(yīng)用；
[0012] 或抑制LSDl基因表達(dá)的物質(zhì)在制備誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為內(nèi)胚層細(xì)胞產(chǎn)品中應(yīng) 用；
[0013] 或抑制LSDl基因表達(dá)的物質(zhì)在制備誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為胰腺細(xì)胞產(chǎn)品中應(yīng) 用。
[0014] 上述應(yīng)用中，所述抑制LSDl基因表達(dá)的物質(zhì)為L(zhǎng)SDl基因 shRNA、反環(huán)苯丙胺或硫 酸苯乙肼；
[0015] 所述LSDl基因 shRNA的核苷酸序列為序列表中序列1或序列2或序列3或序列 4〇
[0016] 上述應(yīng)用中，所述干細(xì)胞為離體胚胎干細(xì)胞或離體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；
[0017] 所述離體胚胎干細(xì)胞為離體人胚胎干細(xì)胞；
[0018] 所述離體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞為離體人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
[0019] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化為內(nèi)胚層細(xì)胞的方 法。
[0020] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：抑制離體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞基因組中的LSDl基 因表達(dá)，得到處理后細(xì)胞；誘導(dǎo)培養(yǎng)所述處理后細(xì)胞，得到內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0021] 上述方法中，所述抑制離體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞基因組中的LSDl基因表達(dá)方法為如 下1)或2):
[0022] 1)用上述LSDl基因的shRNA轉(zhuǎn)染離體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，得到處理后細(xì)胞；
[0023] 2)將所述離體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在含有上述反環(huán)苯丙胺或硫酸苯乙肼的培養(yǎng)基中 孵育，得到處理后細(xì)胞。
[0024] 上述方法中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)為將所述處理后細(xì)胞在含有ActivinA (激活素 A)和 Wortmannin的DMEM/F12培養(yǎng)基中孵育；
[0025] 所述含有ActivinA和Wortmannin的培養(yǎng)基中的ActivinA的濃度為lOOng/mL ; Wortmannin 的濃度為 1 μ Μ。
[0026] 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為4天。
[0027] 本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種使誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化為胰腺細(xì)胞的方法。
[0028] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：
[0029] 1)將上述方法制備的內(nèi)胚層細(xì)胞在含有FGF7(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7)、RA(維生 素 A酸）和Noggin的DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)（誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為4天），將得到的 細(xì)胞稱(chēng)為第二次誘導(dǎo)后細(xì)胞；
[0030] 所述含有FGF7、RA和Noggin的培養(yǎng)基中的RA的濃度為2 μ M、FGF7的濃度為20ng/ mL，Noggin 的濃度為 50ng/mL ;
[0031] 2)將所述第二次誘導(dǎo)后細(xì)胞在含有EGF (表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子）的DMEM/H培養(yǎng)基中 進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)（誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為5天），將得到的細(xì)胞稱(chēng)為第三次誘導(dǎo)后細(xì)胞；
[0032] 所述含有EGF的培養(yǎng)基中EGF的濃度為50ng/mL ;
[0033] 3)將所述第三次誘導(dǎo)后細(xì)胞在含有bFGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子）、Exendin-4、 BMP4和尼克酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)（誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為7-9天），得到胰 腺細(xì)胞；
[0034] 所述含有bFGF、Exendin-4、BMP4和尼克酰胺的培養(yǎng)基中的bFGF的濃度為IOng/ mL，Exendin-4的濃度為50ng/mL，BMP4的濃度為10ng/mL，尼克酰胺的濃度為10mM。
[0035] 本發(fā)明第四個(gè)目的是提供一種使誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化為內(nèi)胚層細(xì)胞的試劑 盒。
[0036] 本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述抑制LSDl基因表達(dá)的物質(zhì)。
[0037] 上述試劑盒還包括上述含有ActivinA和Wortmannin的培養(yǎng)基。
[0038] 本發(fā)明第五個(gè)目的是提供一種使誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化為胰腺細(xì)胞的試劑盒。
[0039] 本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述抑制LSDl基因表達(dá)的物質(zhì)；
[0040] 所述試劑盒還具體包括上述方法中的所述含有ActivinA和Wortmannin的培養(yǎng) 基、上述的含有FGF7、RA和Noggin的培養(yǎng)基、含有EGF的培養(yǎng)基和含有bFGF、Exendin-4、 BMP4和尼克酰胺的培養(yǎng)基。
[0041] 上述含有ActivinA和Wortmannin的培養(yǎng)基為第一階段誘導(dǎo)液，其按照如下方法 制備：將 BSA、N2_supplement、B27_supplement、ActivinA、Wortmannin 添加至 DMEM/F12 液 體培養(yǎng)基中混合均勻，得到第一階段誘導(dǎo)液，且BSA的終濃度為0. 2% (質(zhì)量百分含量）