一種3-羥基丙酸耐受性提高的大腸桿菌及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種3-羥基丙酸耐受性提高的大腸桿菌及其構(gòu)建方法，屬于基因工 程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 3-羥基丙酸（3HP)是一種重要的平臺(tái)化合物，被美國(guó)能源部列為世界上最具開發(fā) 潛力的12種化工產(chǎn)品之一。3HP可用來(lái)合成丙烯酸、丙二醇、丙烯酰胺等，他們當(dāng)前市場(chǎng)價(jià) 值合計(jì)達(dá)到100億美元。3HP可以通過(guò)化學(xué)法和生物法合成，與化學(xué)法相比，生物合成法具 有成本低、操作簡(jiǎn)單、條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)大腸桿菌工程菌株生產(chǎn)3HP已經(jīng)被多次報(bào) 道。盡管有了這些報(bào)道，但是3HP的生物生產(chǎn)仍有很多問(wèn)題。首先3HP的毒性對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的 影響被認(rèn)為是商業(yè)化的一個(gè)關(guān)鍵障礙。一般而言，有機(jī)酸不分解可以直接擴(kuò)散出大腸桿菌 的細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)的pH(大約7. 5)遠(yuǎn)大于大部分有機(jī)酸的pKa值，這時(shí)有機(jī)酸需要分解才 能擴(kuò)散，這會(huì)破壞細(xì)胞質(zhì)的pH值和陰離子池。細(xì)胞內(nèi)部增加酸度會(huì)損害嘌呤堿基的完整性 和使重要酶變性，兩者都會(huì)嚴(yán)重降低細(xì)胞活力。大腸桿菌具有五個(gè)主要耐酸性（AR)系統(tǒng)， 以抵消酸壓力。雖然對(duì)耐酸系統(tǒng)知之甚少，但是ARl系統(tǒng)至少需要信號(hào)因子 〇5PcAMP受 體蛋白（CRP)二者之一才能起作用。AR2-AR5路徑分別依賴于細(xì)胞外谷氨酸，精氨酸，賴氨 酸和鳥氨酸。在每個(gè)系統(tǒng)中，胞質(zhì)脫羧酶催化一個(gè)質(zhì)子依賴的氨基酸脫羧反應(yīng)，膜內(nèi)底物和 膜外產(chǎn)物的交換促進(jìn)反應(yīng)的持續(xù)。
[0003] 醛脫氫酶A(AldA)是一個(gè)代謝過(guò)程的中間酶，ATP依賴的蛋白水解亞單位（ClpP) 催化蛋白或者多肽水解的酶亞單位，琥珀酰轉(zhuǎn)移酶（DapD)參與琥珀酸的合成，伴侶蛋白 (HscA)協(xié)助大分子結(jié)構(gòu)折疊、組裝、解體的蛋白質(zhì)，寡肽透過(guò)酶（OppA)與寡肽結(jié)合，協(xié)助寡 肽穿過(guò)生物膜，羥基丁酮磷酸合酶（RibB)運(yùn)輸輔因子和小分子，超氧化物歧化酶（SodB) 有解毒作用，單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB)是DNA復(fù)制所必須的酶。目前，沒(méi)有相關(guān)報(bào)道表明， AldA、ClpP、DapD、HscA、OppA、RibB、SodB、SSB的過(guò)表達(dá)會(huì)提高大腸桿菌的抗酸性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種3-羥基丙酸耐受性提高的大腸桿菌及其構(gòu) 建方法，所采取的技術(shù)方案如下：
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種3-羥基丙酸耐受性提高的大腸桿菌。該大腸桿菌是 過(guò)表達(dá)以下任一一種或幾種蛋白：醛脫氫酶A、ATP依賴的蛋白水解亞單位、琥珀酰轉(zhuǎn)移酶、 伴侶蛋白、寡肽透過(guò)酶、羥基丁酮磷酸合酶、超氧化物歧化酶或單鏈DNA結(jié)合蛋白。
[0006] 優(yōu)選地，所述過(guò)表達(dá)是將編碼醛脫氫酶A基因、ATP依賴的蛋白水解亞單位基因、 琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因、伴侶蛋白基因、寡肽透過(guò)酶基因、羥基丁酮磷酸合酶基因、超氧化物歧 化酶基因或單鏈DNA結(jié)合蛋白基因中一種或幾種轉(zhuǎn)入到宿主菌中通過(guò)IPTG誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)過(guò)表 達(dá)。
[0007] 優(yōu)選地，所述醛脫氫酶A基因，是醛脫氫酶A基因 aldA ;所述ATP依賴的蛋白水解 亞單位基因，是ATP依賴的蛋白水解亞單位基因 clpP ;所述琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因，是琥珀酰轉(zhuǎn) 移酶基因 dapD ;所述伴侶蛋白基因，是伴侶蛋白基因 hscA ;所述寡肽透過(guò)酶基因，是寡肽透 過(guò)酶基因 oppA ;所述羥基丁酮磷酸合酶基因，是羥基丁酮磷酸合酶基因 ribB ;所述超氧化 物歧化酶基因，是超氧化物歧化酶基因 sodB ;所述單鏈DNA結(jié)合蛋白基因，是單鏈DNA結(jié)合 蛋白基因 ssb。
[0008] 優(yōu)選地，所述所有基因均來(lái)源于E. coli BL21(DE3)。
[0009] 優(yōu)選地，所述醛脫氫酶A，NCBI的蛋白編號(hào)為EHY09191 ;所述ATP依賴的ATP依賴 的蛋白水解亞單位，NCBI的蛋白編號(hào)為EHY12102 ;所述琥珀酰轉(zhuǎn)移酶，NCBI的蛋白編號(hào)為 EHY12268 ;所述伴侶蛋白，NCBI的蛋白編號(hào)為EHY07424 ;所述寡肽透過(guò)酶，NCBI的蛋白編 號(hào)為EHY09046 ;所述羥基丁酮磷酸合酶，NCBI的蛋白編號(hào)為EHY05769 ;所述超氧化物歧化 酶，NCBI的蛋白編號(hào)為EHY07747 ;所述單鏈DNA結(jié)合蛋白，NCBI的蛋白編號(hào)為EHY07615。 [0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述大腸桿菌的構(gòu)建方法，該方法是以大腸桿菌 BL21 (DE3)的基因組為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增醛脫氫酶A基因 aldA、ATP依賴的蛋白水解亞單 位基因〇]^?、琥泊酰轉(zhuǎn)移酶基因 dapD、伴侶蛋白基因 hscA、寡肽透過(guò)酶基因 oppA、羥基丁酮 磷酸合酶基因 ribB、超氧化物歧化酶基因 sodB、單鏈DNA結(jié)合蛋白基因 ssb中任--種或 幾種基因，擴(kuò)增結(jié)束后回收目的片段，利用目的片段分別構(gòu)建表達(dá)載體，再將構(gòu)建好的表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，獲得重組菌，培養(yǎng)并利用IPTG誘導(dǎo)重組菌過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)入基因編碼的 蛋白。
[0011] 優(yōu)選地，所述方法的步驟如下：
[0012] 1)以大腸桿菌BL21(DE3)的基因組為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增結(jié)束后獲 得擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0013] 所述目的基因?yàn)槿┟摎涿窤基因 aldA、ATP依賴的蛋白水解亞單位基因 clpP、琥 珀酰轉(zhuǎn)移酶基因 dapD、伴侶蛋白基因 hscA、寡肽透過(guò)酶基因 oppA、羥基丁酮磷酸合酶基因 ribB、超氧化物歧化酶基因 sodB、單鏈DNA結(jié)合蛋白基因 ssb中任--種或幾種基因
[0014] 2)回收步驟1)所述擴(kuò)增產(chǎn)物中的目的片段，分別與質(zhì)粒載體pTrcHis2B構(gòu)建表達(dá) 載體；
[0015] 3)將步驟2)所得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，獲得重組菌；
[0016] 4)培養(yǎng)步驟3)所得重組菌，培養(yǎng)并利用IPTG誘導(dǎo)重組菌過(guò)表達(dá)目的基因編碼的 蛋白。
[0017] 優(yōu)選地，步驟1)所述PCR擴(kuò)增，醛脫氫酶A基因 aldA所用引物的序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 23-SEQ ID NO. 24所示；ATP依賴的蛋白水解亞單位基因 clpP 所用引物的序列如 SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 25-SEQ ID NO. 26 所示； 琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因 dapD所用引物的序列如SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 6所示；伴侶蛋白基因 hscA所用引物的序列如SEQ ID NO. 7-SEQ ID勵(lì).8所示；寡肽透過(guò)酶基因叩?4所用引物 的序列如 SEQ ID NO. 9-SEQ ID NO. 10 或 SEQ ID NO. 17-SEQ ID NO. 18 所示；羥基丁酮磷酸 合酶基因 ribB所用引物的序列如SEQ ID NO. Il-SEQ ID NO. 12所示；超氧化物歧化酶基因 sodB 所用引物的序列如 SEQ ID NO. 13-SEQ ID NO. 14 或 SEQ ID NO. 19-SEQ ID NO. 20 所 示；單鏈DNA結(jié)合蛋白基因 ssb的引物序列如SEQ ID NO. 15-SEQ ID NO. 16所示或SEQ ID NO. 21-SEQ ID NO. 22 所示。
[0018] 優(yōu)選地，步驟3)所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0019] 優(yōu)選地，步驟4)所述培養(yǎng)并利用IPTG誘導(dǎo)重組菌過(guò)表達(dá)目的基因編碼的蛋白，是 將重組菌與M9培養(yǎng)基以1:100的比例接種后，培養(yǎng)至OD 6c?為0. 5,加入IPTG至終濃度為 0. 5mM，37°C 下過(guò)表達(dá) 2h。
[0020] 通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴(kuò)增醛脫氫酶A基因（aldA)，用膠回收試劑盒回收目 的片段，然后分別雙酶切目的片段和質(zhì)粒pTrcHi S2B，酶切產(chǎn)物回收后，將載體和基因按摩 爾比1:1的比例混合，加入T4DNA連接酶后在16°C下連接6-12小時(shí)，連接產(chǎn)物42°C下熱激 轉(zhuǎn)化E. coliDH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐青霉素抗性平板培養(yǎng)，PCR篩選陽(yáng)性克隆；陽(yáng)性克 隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定后，轉(zhuǎn)化宿主Ε. coli BL21 (DE3)，得到目的菌株。
[0021] 其它目的菌株分別攜帶clpP，dapD，hscA，oppA，ribB，sodB，ssb基因中的一種兩 種或三種，構(gòu)建方法同上；還有一個(gè)攜帶空載體pTrcHis2B作為對(duì)照菌。
[0022] 所述 aldA，clpP，dapD，hscA，oppA，ribB，sodB，ssb 基因皆來(lái)源于 E. coli BL21(DE3) 〇
[0023] 本發(fā)明提供的提高大腸桿菌在3HP脅迫下存活率的方法，是將構(gòu)建好的大腸桿菌 和攜帶空載體的對(duì)照菌在適宜的培養(yǎng)基中進(jìn)行活化種子液，將種子液以1:100的比例接入 含有氨芐青霉素的基本培養(yǎng)基中，37°c，180rpm/min的條件下培養(yǎng)至0D_在0. 5左右時(shí)，加 入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0. 5mM，誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)2小時(shí)，加入5g/L的3HP。37°C，半個(gè)小 時(shí)后，對(duì)菌液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋到1〇_5,每個(gè)梯度取3 μ L點(diǎn)到含有氨芐青霉素的板子上。 37°C，過(guò)夜培養(yǎng)，進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算存活率。與對(duì)照菌相比，過(guò)表達(dá)AldA，ClpP，DapD，HscA， OppA，RibB，SodB，SSB的菌株存活率都顯著提高。說(shuō)明過(guò)表達(dá)上述蛋白可以提高大腸桿菌 在3HP脅迫下的存活率。
[0024] 培養(yǎng)基配方：
[0025] 1)LB培養(yǎng)基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化鈉。接種時(shí)補(bǔ)加 100yg/mL氨芐青霉素。
[0026] 2)M9 基本培養(yǎng)基配方：47. 7mM Na2HPO4, 22mM KH2PO4,18. 7mM NH4Cl, 8. 6mMNaCl， 2mM MgS04,0.1 mM CaCl，0. 4%葡萄糖。接種時(shí)補(bǔ)加100yg/mL氨節(jié)青霉素。
[0027] 其中 Na2HP04，KH2P04，NH4Cl，NaCl 混合后調(diào)至 pH 7. 0,121°C，20min 高壓蒸氣滅菌。 葡萄糖儲(chǔ)液為500g/L，115°C，20min單獨(dú)滅菌；CaCl儲(chǔ)液為1M，MgSO4 · 7H20儲(chǔ)液為200g/ L，121 °C，20min分別單獨(dú)滅菌，抗生素配成10%的溶液，用0. 22 μ m濾菌膜過(guò)