專利名稱：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的表面上足糖萼蛋白(足萼蛋白，podocalyxin)樣蛋白(PODXL)的表達(dá)，并且特別(雖然不完全)涉及PODXL作為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的標(biāo)記的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞和其它多能干細(xì)胞在治療中具有很大的潛力。上述細(xì)胞可以用于再生醫(yī)學(xué)來修復(fù)由疾病或受傷所損傷的組織。然而，在醫(yī)學(xué)上，胚胎干細(xì)胞的使用受到限制，這是由于與人類胚胎的使用有關(guān)的重要的倫理問題。最近，Yamanaka Lab2和Thomson Lab3 表明，通過少數(shù)基因的瞬時過度表達(dá)，可以將人成纖維細(xì)胞重新編程成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (IPSC)，其功能和表型上類似hESC。因此，可以獲得多能干細(xì)胞，而無需破壞胚胎。這些IPSC功能和表型上類似胚胎干細(xì)胞(ESC)，并且無需破壞胚胎。一些IPSC， 如hESC，表達(dá)Oct-4和其它細(xì)胞表面標(biāo)記，如1^1-1-60/81和SSEA-3/4。然而，IPSC與ESC 并不相同，如較慢的倍增時間“、全局基因表達(dá)模式的差異2’3以及DNA甲基化狀態(tài)2所表明的。核重編程是否是完全的1(1，因而在分化期間IPSC是否按照與hESC類似的途徑目前仍然不清楚。這種重要突破提供了以下可能性利用患者專用的輸入細(xì)胞的細(xì)胞療法在未來可能成為現(xiàn)實。不同于其中存在倫理問題和可能的免疫排斥問題的hESC，IPSC可以產(chǎn)生自供體，重新編程，分化為適當(dāng)?shù)募?xì)胞類型以及移植回供體。盡管它的潛力，但在分化以后由殘余IPSC引起的畸胎瘤形成問題仍然存在并需要解決。在IPSC已成功產(chǎn)生自人細(xì)胞的報道公開以前，在WO 2007/102787(其內(nèi)容由此結(jié)合于本申請中以供參考)中，我們描述了在未分化人胚胎干細(xì)胞(hESC)1上相對于表面抗原產(chǎn)生一組單克隆抗體(mAb)(還參見此文的圖10)。這些mAb相對于未分化的hESC系呈現(xiàn)強反應(yīng)性，但相對于分化的(胚胎樣體)hESC系則并不呈現(xiàn)反應(yīng)性。上述mAb并不與小鼠成纖維細(xì)胞交叉反應(yīng)，并且相對于人胚胎癌性細(xì)胞呈現(xiàn)弱至沒有反應(yīng)性。因此，這些mAb 呈現(xiàn)結(jié)合于hESC的非常高的特異性，并且隨著hESC分化，這種結(jié)合會失去。值得注意的是，一種抗體(mAb 84)，其結(jié)合足糖萼蛋白樣蛋白-l(PODXL)，以濃度依賴性、補體無關(guān)的方式，對未分化hESC和NCCIT細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。在溫育的30分鐘內(nèi)，mAb 84誘導(dǎo)未分化的hESC的細(xì)胞死亡，但并不誘導(dǎo)分化hESC的細(xì)胞死亡，并且mAb-抗原復(fù)合物的免疫沉淀揭示了，抗原是足糖萼蛋白樣蛋白-1。重要的是，當(dāng)在移植到SCID小鼠中以前用mAb 84 處理hESC時，沒有觀測到腫瘤形成。這種早期數(shù)據(jù)表明mAb84可用于從用于臨床應(yīng)用的分化細(xì)胞群體中消除殘余hESC。雖然未分化多能干細(xì)胞本身可以用于細(xì)胞治療，但認(rèn)為有益的是，使用已開始分化、或被分化的細(xì)胞。促進(jìn)未分化的人多能干細(xì)胞分化成特定細(xì)胞譜系的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。一旦此分化過程已開始或繼續(xù)，有利的是，除去或破壞未分化多能干細(xì)胞，其否則可以形成不良畸胎瘤。
因此，可以看出，有用的是，鑒定或分離未分化人多能干細(xì)胞(因為它們本身可以用于治療或可以被促進(jìn)以分化成可以用于治療的特定細(xì)胞譜系)。還有用的是，從細(xì)胞的混合物除去或破壞未分化人多能干細(xì)胞，其中一些細(xì)胞已開始分化、或被分化，因為這些分化細(xì)胞可用于治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明源于以下發(fā)現(xiàn)足糖萼蛋白樣蛋白-I(PODXL)是未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (IPSC)的標(biāo)記。在本發(fā)明中，已發(fā)現(xiàn)結(jié)合于并表征IPSC的抗體。此外，進(jìn)一步研究了 mAb 84殺傷 IPSC的能力。因此，提供了用來鑒定、分離、分開、純化、富集或除去分化或未分化IPSC的方法。 還提供了破壞未分化IPSC的方法。優(yōu)選地，這些方法涉及能夠結(jié)合PODXL的結(jié)合部分結(jié)合于表達(dá)PODXL的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個方面，提供了在包含一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中鑒定一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括鑒定在樣品中的在它們的表面上表達(dá)足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的一種或多種細(xì)胞。在一些實施方式中，使樣品與結(jié)合部分接觸，所述部分結(jié)合于P0DXL，并且所述一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞借助于被結(jié)合于結(jié)合部分而被鑒定。在一些實施方式中，該方法進(jìn)一步包括分離在它們的表面上表達(dá)PODXL的一種或多種細(xì)胞，其中該方法包括(i)使樣品與能夠結(jié)合PODXL的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在樣品中在細(xì)胞表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸；以及(ii)使結(jié)合于結(jié)合部分的細(xì)胞與未結(jié)合于該部分的細(xì)胞分離。提供了通過該方法獲得的分離的一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個方面，提供了使未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與已經(jīng)歷或正在經(jīng)歷分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分離的方法，其中未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和已經(jīng)歷或正在經(jīng)歷分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞存在于樣品中，該方法包括(i)使樣品與能夠結(jié)合足糖萼蛋白樣蛋白 (PODXL)的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在樣品中在細(xì)胞表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸；以及(ii)使結(jié)合于結(jié)合部分的細(xì)胞與未結(jié)合于該部分的細(xì)胞分離。提供了通過該方法獲得的分離的一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。還提供了通過該方法獲得的分離的一種或多種分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個方面，提供了從包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中分離一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括分離在樣品中的在它們的表面上表達(dá) PODXL的一種或多種細(xì)胞。在一些實施方式中，使樣品與結(jié)合部分接觸，所述部分結(jié)合于P0DXL，并且所述一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞借助于被結(jié)合于結(jié)合部分而從樣品中分離。提供了通過該方法分離的一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。在本發(fā)明的又一個方面，提供了從包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和已經(jīng)歷或正在經(jīng)歷分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的混合物中富集未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括(i) 使混合物與能夠結(jié)合足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在混合物中在細(xì)胞表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸；以及(ii)使結(jié)合于該部分的細(xì)胞與未結(jié)合于該部分的細(xì)胞分離，以便產(chǎn)生富集有未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的細(xì)胞群體。在本發(fā)明的另一個方面，提供了從包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和已經(jīng)歷或正在經(jīng)歷分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的混合物中富集已經(jīng)歷或正在經(jīng)歷分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括(i)使混合物與能夠結(jié)合足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在混合物中在細(xì)胞表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸；以及(ii)使未結(jié)合于該部分的細(xì)胞與結(jié)合于該部分的細(xì)胞分離，以便產(chǎn)生富集有已經(jīng)歷或正在經(jīng)歷分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的細(xì)胞群體。在本發(fā)明的又一個方面，提供了制備包含從未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞的組合物的方法，上述組合物基本上不包含在它們的表面上表達(dá)PODXL的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，該方法包括(i)提供包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和從未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞的細(xì)胞群體；(ii)使該群體與能夠結(jié)合足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在樣品中在細(xì)胞表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸；以及(iii)使未結(jié)合于結(jié)合部分的細(xì)胞與結(jié)合于該部分的細(xì)胞分離。在一些實施方式中，該方法進(jìn)一步包括使分離的未結(jié)合于結(jié)合部分的細(xì)胞與藥用載體、佐劑或稀釋劑混合。在本發(fā)明的另一個方面，提供了制備包含在它們的表面上表達(dá)PODXL的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的組合物的方法，上述組合物基本上不包含從未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞，該方法包括(i)提供包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和從未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞的細(xì)胞群體；(ii)使該群體與能夠結(jié)合足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在樣品中在細(xì)胞表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸；以及(iii)使結(jié)合于結(jié)合部分的細(xì)胞與未結(jié)合于該部分的細(xì)胞分離。在一些實施方式中，該方法進(jìn)一步包括從分離的結(jié)合于結(jié)合部分的細(xì)胞中離解結(jié)合部分。該方法還可以包括使分離的結(jié)合于結(jié)合部分的細(xì)胞與藥用載體、佐劑或稀釋劑混合的步驟。在本發(fā)明的又一個方面，提供了將能夠結(jié)合PODXL的結(jié)合部分結(jié)合于未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括使包含一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品與能夠結(jié)合PODXL的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在樣品中在細(xì)胞表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸。在本發(fā)明的又一個方面，提供了在包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中破壞一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括破壞在樣品中的在它們的表面上表達(dá) PODXL的一種或多種細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個方面，提供了從包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中除去一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括從樣品中除去在它們的表面上表達(dá) PODXL的一種或多種細(xì)胞。在一些實施方式中，使樣品與結(jié)合部分接觸，所述部分結(jié)合于P0DXL，并且所述一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞借助于被結(jié)合于結(jié)合部分而從樣品中除去。在以上描述的本發(fā)明的任何方面，在一些實施方式中，結(jié)合部分是抗體，并且在優(yōu)選的實施方式中為mAb84。
在本發(fā)明的又一個方面，提供了包含從未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞的組合物，上述組合物基本上不包含在它們的表面上表達(dá)PODXL的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個方面，提供了包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的組合物，上述組合物基本上不包含從未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞。未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞優(yōu)選在它們的表面上表達(dá)PODXL。在本發(fā)明的又一個方面，提供了治療需要細(xì)胞治療的患者的方法，該方法包括給予患者下述中的一種或多種(i)通過本發(fā)明的方法獲得的分離的一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；(ii)通過本發(fā)明的方法獲得的分離的一種或多種分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；或 (iii)根據(jù)本發(fā)明的組合物。在本發(fā)明的又一個方面，提供了下述中的一種或多種在制備用于治療需要細(xì)胞治療的患者的藥物中的應(yīng)用(i)通過本發(fā)明的方法獲得的分離的一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；(ii)通過本發(fā)明的方法獲得的分離的一種或多種分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；或 (iii)根據(jù)本發(fā)明的組合物。在本發(fā)明的另一個方面，提供了通過本發(fā)明的方法獲得的分離的一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、或通過本發(fā)明的方法獲得的分離的一種或多種分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、 或根據(jù)本發(fā)明的組合物，用于治療需要細(xì)胞治療的患者。在本發(fā)明的又一個方面，提供了一種復(fù)合物，該復(fù)合物包含在它的表面上表達(dá)足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和能夠結(jié)合PODXL的結(jié)合部分，所述結(jié)合部分結(jié)合于在未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的表面上表達(dá)的P0DXL。優(yōu)選通過結(jié)合部分和 P0D)(L的非共價和非離子相互作用來形成復(fù)合物。復(fù)合物可以提供為分離形式、或作為混合物或樣品的一部分，例如，細(xì)胞培養(yǎng)物的一部分。在本發(fā)明的又一個方面，提供了試劑盒(套裝試劑盒，kit of parts)，該試劑盒包括結(jié)合PODXL的結(jié)合部分、以及檢測另一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞標(biāo)記的另外的制劑。在本發(fā)明的又一個方面，提供了用來產(chǎn)生和鑒定誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括(i)將非多能供體細(xì)胞誘導(dǎo)成多能狀態(tài)以產(chǎn)生在它們的表面上表達(dá)PODXL的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；(ii)使誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與能夠結(jié)合PODXL的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸；以及(iii)鑒定由結(jié)合部分結(jié)合的細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個方面，提供了 mAb84在破壞未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的應(yīng)用。 因此，提供了在包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中破壞一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括使樣品中的細(xì)胞與mAb84接觸以使mAb84可以結(jié)合一些細(xì)胞。該方法可以進(jìn)一步包括培養(yǎng)或溫育樣品足夠的時間以便于破壞結(jié)合于mAb84的細(xì)胞。在本發(fā)明的又一個方面，提供了一種復(fù)合物，該復(fù)合物包含結(jié)合于mAb84的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。優(yōu)選通過結(jié)合部分和PODXL的非共價和非離子相互作用來形成復(fù)合物。該復(fù)合物可以提供為分離形式、或作為混合物或樣品的一部分，例如，細(xì)胞培養(yǎng)物的一部分。以下陳述本發(fā)明的另外的方面。
在本發(fā)明的一個方面，提供了在可以包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中鑒定未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括鑒定在樣品中的在它們的表面上表達(dá)足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的一種或多種細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個方面，提供了從包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中分離未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括分離在樣品中的在它們的表面上表達(dá)PODXL的一種或多種細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個方面，提供了從包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中除去未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括從樣品中除去在它們的表面上表達(dá)PODXL的一種或多種細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個方面，提供了在包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中破壞未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括破壞在樣品中的在它們的表面上表達(dá)PODXL的一種或多種細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個方面，提供了通過從包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中分離未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法而分離的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，上述方法包括分離在樣品中的在它們的表面上表達(dá)PODXL的一種或多種細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個方面，提供了在其表面上表達(dá)PODXL的分離的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個方面，提供了包含從未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞的組合物，上述組合物基本上不包含在它們的表面上表達(dá)PODXL的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個方面，提供了治療需要細(xì)胞治療的患者的方法，該方法包括給予患者通過從包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中分離未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法而分離的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、或在其表面上表達(dá)PODXL的分離的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、或包含從未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞的組合物，上述組合物基本上不包含在它們的表面上表達(dá)PODXL的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的上述方面的細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的上述方面的組合物在制備用于治療需要細(xì)胞治療的患者的藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明的另一個方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的上述方面的方法，其中使樣品與結(jié)合部分接觸，所述部分結(jié)合于P0DXL，并且所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞借助于被結(jié)合于結(jié)合部分而在樣品中被鑒定或從樣品中被分離或從樣品中被除去。優(yōu)選地，結(jié)合部分是抗體。在本發(fā)明的另一個方面，提供了試劑盒，該試劑盒包括結(jié)合PODXL的部分，以及檢測另一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞標(biāo)記的另外的制劑。以下編號的段落包含本文披露的本發(fā)明的技術(shù)特征的廣泛組合的陳述。1. 一種在可以包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中鑒定未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括鑒定在樣品中的在它們的表面上表達(dá)足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的一種或多種細(xì)胞。2. 一種從包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中分離未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括分離在樣品中的在它們的表面上表達(dá)PODXL的一種或多種細(xì)胞。3. 一種從包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中除去未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括從樣品中除去在它們的表面上表達(dá)PODXL的一種或多種細(xì)胞。
4. 一種在包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中破壞未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括破壞在樣品中的在它們的表面上表達(dá)PODXL的一種或多種細(xì)胞。5.通過段落2的方法分離的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。6.在其表面上表達(dá)PODXL的分離的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。7. 一種包含從未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞的組合物，上述組合物基本上不包含在它們的表面上表達(dá)PODXL的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。8. 一種治療需要細(xì)胞治療的患者的方法，該方法包括給予患者按照段落5或6所述的細(xì)胞或按照段落7所述的組合物。9.按照段落5或6所述的細(xì)胞或按照段落7所述的組合物在制備用于治療需要細(xì)胞治療的患者的藥物中的應(yīng)用。10.按照段落1至3中任一段落所述的方法，其中使樣品與結(jié)合部分接觸，所述部分結(jié)合于P0DXL，并且所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞借助于被結(jié)合于結(jié)合部分而在樣品中被鑒定或從樣品中被分離或從樣品中被除去。11.按照段落10所述的方法，其中所述結(jié)合部分是抗體。12. 一種試劑盒，包括結(jié)合PODXL的部分，以及檢測另一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞標(biāo)記的另外的制劑。優(yōu)選具體實施方式
的描述 根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選涉及PODXL結(jié)合部分與在它們的表面上表達(dá)PODXL的細(xì)胞
的結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的方法可以包括(a)鑒定未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；(b)分離未分化或分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；(c)使未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與其它細(xì)胞分離，例如與分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分罔；(d)富集未分化或分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；(e)制備分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的組合物，該組合物基本上不具有未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；或(f)制備未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的組合物，該組合物基本上不具有分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的方法可以涉及使樣品與能夠結(jié)合于PODXL的部分(P0DXL結(jié)合部分) 接觸的步驟。這可以在適合于允許結(jié)合部分與PODXL結(jié)合的條件下。上述條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的，例如包括生理PH和生理緩沖液?？梢允箻悠放cPODXL結(jié)合部分接觸足夠的時間以允許結(jié)合部分結(jié)合于P0DXL。足夠的時間可以例如是5分鐘、10分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘或長于2小時。在優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括使樣品與PODXL結(jié)合部分接觸，從而便于PODXL結(jié)合部分結(jié)合于在細(xì)胞表面上的PODXL并確定哪些細(xì)胞具有與其結(jié)合的 PODXL結(jié)合部分。根據(jù)本發(fā)明的方法可以包括鑒定由PODXL結(jié)合部分結(jié)合的細(xì)胞的步驟。根據(jù)本發(fā)明的方法可以包括分離由PODXL結(jié)合部分結(jié)合的細(xì)胞的步驟。根據(jù)本發(fā)明的方法可以包括分配、除去、分離或純化由PODXL結(jié)合部分結(jié)合的細(xì)胞的步驟。根據(jù)本發(fā)明的方法可以包括破壞由PODXL結(jié)合部分結(jié)合的細(xì)胞的步驟。根據(jù)本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括量化已被鑒定、分離、分開、分配、富集、結(jié)合或除去的細(xì)胞的步驟。本文披露的鑒定未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法可用于成像未分化IPSC，尤其是在細(xì)胞標(biāo)記有可檢測標(biāo)記的情況下，以及用于表征IPSC。涉及將PODXL結(jié)合部分結(jié)合于在IPSC表面上表達(dá)的PODXL的方法可用于IPSC的研究、以及IPSC的臨床進(jìn)展。結(jié)合于在細(xì)胞表面上表達(dá)的PODXL的PODXL結(jié)合部分形成結(jié)合部分和PODXL的復(fù)合物。表達(dá)結(jié)合部分結(jié)合的PODXL的細(xì)胞形成復(fù)合物的一部分。本發(fā)明的一些方法包括檢測復(fù)合物的步驟，例如通過檢測結(jié)合部分的存在或通過檢測偶聯(lián)于結(jié)合部分的可檢測標(biāo)記。本發(fā)明的一些方法包括分配那些來自樣品或來自樣品中的其它非復(fù)合細(xì)胞的復(fù)合物的步驟，并且可以進(jìn)一步包括檢測復(fù)合物的步驟，例如通過檢測結(jié)合部分或偶聯(lián)于結(jié)合部分的可檢測標(biāo)記的存在。本發(fā)明的一些方法包括以下步驟使樣品與PODXL結(jié)合部分接觸足夠的時間以便于形成結(jié)合部分和PODXL的復(fù)合物，以及從樣品中除去復(fù)合細(xì)胞。上述方法可用于分化和 /或未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分離和/或純化。在本發(fā)明的方法中，可以將PODXL結(jié)合部分固定于，例如共軛于固體載體，使得可以通過親和結(jié)合來結(jié)合誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。方便地，固體載體包括任何適宜的基質(zhì)如瓊脂糖、 丙烯酰胺、Sepharose 以及kphadex 。固體載體可以是固體基質(zhì)如微量滴定板或片、或柱。在一些實施方式中，磁性標(biāo)記(直接或間接地)結(jié)合部分，使得當(dāng)被結(jié)合時在提供適宜磁場以后可以從樣品的其余部分中分離人胚胎干細(xì)胞。用于磁性細(xì)胞分選的微珠經(jīng)常稱作MACS膠體超順磁性微珠。通過磁性活化細(xì)胞分類法(MACQ可以分選以這種方式標(biāo)記的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。分離包含特定細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞的其它方法在本領(lǐng)域中是已知的并且包括 FACS (熒光激活細(xì)胞分選)，為此用熒光分子標(biāo)記結(jié)合部分。根據(jù)本發(fā)明的方法可以包括培養(yǎng)已被結(jié)合、鑒定、分離、分開、富集或除去的未分化或分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的步驟。這些方法還可以包括分化這樣得到的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的步驟。根據(jù)本發(fā)明的方法可以用來提供分化或未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的富集的或基本上分離的組合物?？梢砸愿鞣N方式來使用這樣的組合物，例如它可以用于細(xì)胞治療或它可以用作細(xì)胞源，然后上述細(xì)胞源被促進(jìn)分化成特定細(xì)胞譜系，其可用于特定治療，或它可以用來研究(體外或體內(nèi))便于使細(xì)胞分化成其它細(xì)胞的因素。通常，誘導(dǎo)多能胚胎干細(xì)胞的富集組合物包含至少50%的細(xì)胞作為分化或未分化人胚胎干細(xì)胞，優(yōu)選至少70%或至少90%或至少95%。優(yōu)選地，在組合物中的所有細(xì)胞是所述分化或未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。用于富集細(xì)胞群體的方法優(yōu)選涉及，絕對地或相對于樣品中其它細(xì)胞的數(shù)目，增加樣品中細(xì)胞的濃度或增加細(xì)胞群體(即給定類型的細(xì)胞的數(shù)目)。本發(fā)明還提供了破壞未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括破壞樣品中的在它們的表面上表達(dá)PODXL的一種或多種細(xì)胞。在一些實施方式中，使細(xì)胞樣品與PODXL結(jié)合部分接觸足夠的時間以便于該部分結(jié)合于那些在它們的表面上表達(dá)PODXL的細(xì)胞。該部分可以包括能夠破壞它已結(jié)合的細(xì)胞的細(xì)胞毒性劑?？商鎿Q地，可以通過結(jié)合部分本身、或由于結(jié)合部分的附著，來破壞細(xì)胞?？商鎿Q地，可以通過結(jié)合部分與細(xì)胞毒性劑的相互作用來破壞細(xì)胞。因此，該方法可以包括添加能夠與結(jié)合部分相互作用的細(xì)胞毒性劑以便破壞結(jié)合于結(jié)合部分的細(xì)胞。在一些方法中，通過細(xì)胞脹亡機制，PODXL結(jié)合部分介導(dǎo)細(xì)胞死亡，上述機制是細(xì)胞死亡的一種形式，其來自膜損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞通透性(如對染料如碘化丙啶/臺盼藍(lán)的通透性所證明的)和細(xì)胞收縮的增加。在通過本發(fā)明的方法誘導(dǎo)細(xì)胞死亡以前可以進(jìn)行細(xì)胞膜的穿孔、起泡和/或細(xì)胞凝集。在破壞未分化IPSC的優(yōu)選方法中，能夠結(jié)合于PODXL 的部分可以是mAb84?？梢赃B接于抗體或其它結(jié)合部分的適宜細(xì)胞毒性部分，包括放射性原子、細(xì)胞毒性藥物、細(xì)胞毒性蛋白以及酶系統(tǒng)，其可以將前藥轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性藥物。這些在本領(lǐng)域是眾所周知的。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明包括在包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中破壞未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟使樣品與對于所述細(xì)胞具有毒性的PODXL結(jié)合部分接觸，使結(jié)合部分結(jié)合于在所述細(xì)胞的表面上的P0DXL，以及使結(jié)合部分殺傷所述細(xì)胞。結(jié)合部分可以是抗體，其本身對于所述細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，或可以包括對于細(xì)胞是毒性的另外部分。在一些實施方式中，與細(xì)胞毒性劑同時或順序地將PODXL結(jié)合部分給予樣品或細(xì)胞?？梢赃B同一種或多種其它制劑一起給予PODXL結(jié)合部分，其中上述制劑能夠結(jié)合于其它干細(xì)胞相關(guān)分子以便確保殘余IPSC的徹底去除。破壞未分化IPSC的方法可以用來從已被誘導(dǎo)以分化的IPSC群體中除去未分化細(xì)胞。在移植組織或器官以前，用于破壞未分化IPSC的方法可以用來消除殘余IPSC，從而增加移植的成功和安全，尤其是通過降低畸胎瘤形成的風(fēng)險。本發(fā)明提供了在其表面上表達(dá)PODXL的分離的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、以及在其結(jié)合于PODXL結(jié)合部分的表面上表達(dá)PODXL的分離的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。本發(fā)明還提供了從樣品中產(chǎn)生和鑒定重新編程的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法。這使得能夠從還未成功重新編程的細(xì)胞中選擇成功重新編程的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。這樣的方法包括將非多能供體細(xì)胞誘導(dǎo)成多能狀態(tài)以產(chǎn)生在它們的表面上表達(dá) PODXL的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，使誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與能夠結(jié)合PODXL的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸，以及鑒定由結(jié)合部分結(jié)合的細(xì)胞。用于將非多能供體細(xì)胞誘導(dǎo)成多能狀態(tài)的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的。例如，那些由 Takahashi et al ((2007)Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell 131 (5) :861-72)and Yu et al ((2007)Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science 318(5858)1917-20)報道的技術(shù)，上述兩者結(jié)合于本文以供參考。上述技術(shù)包括用干細(xì)胞相關(guān)基因和/或轉(zhuǎn)錄因子利用病毒載體來轉(zhuǎn)染供體細(xì)胞。 上述基因和因子可以包括0ct-3/4(Pouf51)Sox2、c_Myc、Klf4、Nonaog以及LI擬8中的一種或多種，如在以下“誘導(dǎo)多能干細(xì)胞”中所說明的。供體細(xì)胞可以包括成年體細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞，如在以下“誘導(dǎo)多能干細(xì)胞”中所描述的。優(yōu)選體外進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法。術(shù)語“體外”用來包括用培養(yǎng)物中的細(xì)胞進(jìn)行的實驗，而術(shù)語“體內(nèi)”用來包括用完整的多細(xì)胞生物體進(jìn)行的實驗。試劑盒根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供了一種試劑盒。在一些實施方式中，標(biāo)記是0ct4、 SSEAUra-HOJra-I-Sl以及GCTM-2中的一種或多種。另外的制劑可以是mAb 5、mAb 8、mAb 14、mAb 63 > mAb 84> mAb 85 > mAb 95 > mAb 375、mAb 432 > mAb 529 中的任{可一種或多種。在一些實施方式中，試劑盒包括相對于PODXL的抗體以及相對于0ct4、SSEA-4、 Tra-1-60,Tra-1-81以及GCTM-2中的一種或多種的抗體。典型地，試劑盒還可以包含下述中的一種或多種用于免疫化學(xué)的制劑；固定于固體載體的抗體；用于標(biāo)記抗體的工具；用來將抗體連接于細(xì)胞毒性部分的工具。MM本發(fā)明的一些方法涉及含有細(xì)胞的樣品。樣品可以是任何數(shù)量的細(xì)胞，其包含、或被懷疑包含一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。樣品可以是體外生長的細(xì)胞的培養(yǎng)物。例如，培養(yǎng)物可以包含細(xì)胞的懸浮液或在培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞。在優(yōu)選的實施方式中，樣品包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。在一些實施方式中，樣品包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和已經(jīng)歷分化或正經(jīng)歷分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。已經(jīng)歷分化或正經(jīng)歷分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以不再是多能的并且優(yōu)選在它們的表面上并不表達(dá) PODXL。樣品可以是這樣一種樣品，其中未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞已被促進(jìn)(或激勵)以分化成特定細(xì)胞譜系，因而樣品可以包含未分化和分化細(xì)胞的混合物(因為分化并不經(jīng)常是有效過程)。通常，在這樣的樣品中，未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞構(gòu)成細(xì)胞總數(shù)的幾個百分點。 通常，在樣品中的分化細(xì)胞可以是心肌細(xì)胞、胰島、神經(jīng)元祖細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞，其源自 (通過分化)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。在包含分化細(xì)胞的樣品的臨床應(yīng)用以前，從(或在)這樣的樣品中除去(或破壞)未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞會是有用的，因為，潛在地，未分化細(xì)胞可以形成不良畸胎瘤。通常，除去或破壞至少95%的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。優(yōu)選地，除去或破壞所有所述細(xì)胞。在一些實施方式中，樣品并不包含非誘導(dǎo)多能細(xì)胞，例如，胚胎干細(xì)胞(ESC)。在一些優(yōu)選的實施方式中，樣品并不包含人胚胎干細(xì)胞或非誘導(dǎo)人多能細(xì)胞。樣品可以包含在它們的表面上表達(dá)PODXL的未分化IPSC。在一些情況下，樣品源自己被誘導(dǎo)成具有多能性的體細(xì)胞。在其它情況下，樣品可以包含IPSC，其已被誘導(dǎo)以分化成其它細(xì)胞。樣品可以包含其它非多能細(xì)胞，例如飼養(yǎng)細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)
本文中稱作足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的足糖萼蛋白樣蛋白1前體的氨基酸序列給出在圖11中(SEQ ID NO 1)并且還參見通過EntrezPubMed可進(jìn)入的NCBI蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫的登錄號 000592 (還參見 Kershaw et al (1997) J. Biol. Chem. 272，15708-15714)。 它還稱作PCLPl和PODXL。為了方便，此后它將稱作PODXL。PODXL可以具有在圖11中給出的精確序列，或它可以是其自然發(fā)生的變體(例如，參見圖16)。例如，按照000592，R是T 在殘基62處的變體，以及S是L在殘基196處的變體。成熟PODXL是5 個殘基糖基化細(xì)胞表面多肽，其中殘基1_22是信號肽，以及殘基23-5 表示成熟蛋白。殘基23-431被認(rèn)為是蛋白的胞外部分以及殘基432-452是跨膜區(qū)。殘基23-304是義！·/!!!!·豐富區(qū)。優(yōu)選的是，如果結(jié)合于PODXL的結(jié)合部分結(jié)合于PODXL 的胞外區(qū)，例如在Ser/Thr豐富區(qū)內(nèi)、或在此區(qū)的外側(cè)。足糖萼蛋白樣蛋白是唾粘蛋白(唾液黏蛋白)家族的成員。PODXL最初鑒定為腎小球足細(xì)胞的重要成分。足細(xì)胞是高度分化的上皮細(xì)胞，其中交錯足突覆蓋腎小球基底膜的外部方面。PODXL的其它生物活性包括在具有Na+/H+交換調(diào)節(jié)因子的膜蛋白復(fù)合物中結(jié)合于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架元件、在造血細(xì)胞分化中發(fā)揮作用、被表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中以及結(jié)合于L-選擇蛋白。PODXL是屬于唾粘蛋白的⑶34家族的重糖基化I型跨膜蛋白。PODXL起初被描述為在腎小球的足細(xì)胞上的主要唾液蛋白，但后來發(fā)現(xiàn)被表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞和早期造血祖細(xì)胞上。最近，PODXL已涉及作為在乳腺癌、肝癌、以及前列腺癌中的腫瘤攻擊性中的指示劑。人PODXL位于染色體7q32_q33上并編碼5 個氨基酸的蛋白。然而，由于PODXL的胞外域被廣泛糖基化以具有唾液酸化0-連接碳水化合物和用于N-連接糖基化的5個潛在位點，所以PODXL的近似分子量為160-165kDa。功能上，PODXL已報道具有相當(dāng)不同的作用，其取決于細(xì)胞類型。在足細(xì)胞中， PODXL作為抗粘附分子，該抗粘附分子通過電荷排斥保持在足細(xì)胞足突之間的濾過隙打開。 然而，在高內(nèi)皮微靜脈中，PODXL作為粘附分子，該粘附分子結(jié)合于L-選擇蛋白并介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的牽引和滾動。在hESC中，PODXL被轉(zhuǎn)錄鑒定為高度表達(dá)在未分化hESC中5’6。通過表達(dá)的序列標(biāo)記頻率分析，PODXL表達(dá)水平在7-8天胚胎樣體中被下調(diào)幾乎2. 5倍，并在神經(jīng)外胚層樣細(xì)胞和肝細(xì)胞樣細(xì)胞中分別被下調(diào)大約7和12倍5。此結(jié)果得到hESC和8天EB的免疫組織化學(xué)的支持，其中在后者中的染色顯著降低7。在Wei等人的比較hESC和mESC的轉(zhuǎn)錄物組分布的獨立研究中，他們觀測到，與hESC相比，在mESC系E-14中通過MPSS未檢測到PODXL 的表達(dá)8。在蛋白水平，Schopperle和DeWolf9報道，在兩個胚胎性癌系暴露于視黃酸以后， PODXL經(jīng)歷翻譯后糖基化變化(MW從200kDa降低至170kDa)?？筎RA-1-60/81抗體未能結(jié)合于修飾PODXL促使它們提示在胚胎干細(xì)胞上干細(xì)胞PODXL(SC-PODXL)的存在。在一起， 在ESC中PODXL表達(dá)的這些獨立的報告密切對應(yīng)于我們通過流式細(xì)胞術(shù)所獲得的mAb 84 的觀測結(jié)果，其中，與未分化hESC相比，在第8天胚胎樣體中結(jié)合反應(yīng)性降低。伴隨地，分別對FGF2-饑餓的hESC和第22天EB的mAb 84-介導(dǎo)殺傷的降低或喪失可以歸因于在分化以后PODXL表達(dá)的下調(diào)。此外，在胚胎樣體形成期間，結(jié)合于hESC的mAb 84和TRA-1-60 的同時減少可能涉及在分化期間SC-PODXL的喪失。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，PODXL是人P0DXL。人PODXL可以具有SEQ ID NO :1的
14氨基酸序列，或 GenBank 登錄號 000592. 2GI :229462740 (SEQ ID NO :2 ；圖 12)或 GenBank 登錄號AAI43319. IGI :219520307 (SEQ ID NO :3 ；圖13)的氨基酸序列。一些實施方式涉及 PODXL變體如在圖16 (SEQ ID NO 8&9)中所披露的那些變體。在一些實施方式中，相對于SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ IDNO :3、SEQ ID NO: 8 或 SEQ ID NO :9 的氨基酸序列，PODXL 蛋白包括 60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%或100%的序列同一性之一。在一些實施方式中，相對于SEQ ID NO =USEQ ID NO 2,SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :8 或SEQ ID NO :9 的氨基酸序列(不包括氨基酸 1-22)， PODXL 蛋白包括 60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 的序列同一性之一。優(yōu)選的PODXL蛋白是mAb84能夠結(jié)合的那些PODXL蛋白。PODXL結(jié)合部分適宜的結(jié)合部分包括核酸適體(例如由Systematic Evolution of Ligands通過 Exponential富集(SELEX)所獲得的)、抗體(包括多克隆和單克隆抗體以及抗體片段)、配體、酶以及其它生物分子。應(yīng)當(dāng)明了，對于本發(fā)明的所有實施方式，優(yōu)選的是，PODXL結(jié)合部分是選擇性的。因此，優(yōu)選的是，PODXL結(jié)合部分選擇性地結(jié)合P0DXL，S卩，以比其它人蛋白更高親和力，結(jié)合 P0DXL。通常，抗PODXL抗體以選擇性方式基本上不結(jié)合其它人蛋白。方便地，結(jié)合部分是抗體，借助于此術(shù)語，我們包括其片段或衍生物、或合成抗體或合成抗體片段。會結(jié)合于PODXL的抗體已經(jīng)是已知的。例如，對于人足糖萼蛋白具有特異性的山羊IgG，其多克隆抗血清結(jié)合于胞外域，可獲自R&D Systems，hc，目錄號為AF1658。此外， 單克隆抗人足糖萼蛋白抗體(小鼠IgG2A)可獲自R&D Systems, Inc,目錄號為MAB1658。 鑒于與單克隆抗體技術(shù)有關(guān)的今天的技術(shù)，可以相對于大多數(shù)抗原來制備抗體?？乖Y(jié)合部分可以是抗體的一部分(例如Fab片段)或合成抗體片段(例如單鏈Fv片段BcFv])。 相對于所選抗原的適宜的單克隆抗體可以通過已知技術(shù)來制備，例如在"Monoclonal Antibodies :A manual of techniques" , H Zola(CRC Press, 1988)以^ “ Monoclonal Hybridoma Antibodies :Techniques and Applications" ,JGR Hurrell(CRC Press, 1982)中所披露的那些技術(shù)。Neuberger等人討論了嵌合抗體(1988，8th International Biotechnology Symposium Part 2,792-799)。單克隆抗體(mAb)可用于本發(fā)明的方法并且是特異性地靶向抗原上的單表位的抗體的同源群體。因此，結(jié)合PODXL的mAb可以潛在地用來純化或消除呈現(xiàn)抗原庫的活細(xì)胞的子集，其中上述抗原庫表征未分化細(xì)胞或分化成具體譜系的細(xì)胞。多克隆抗體可用于本發(fā)明的方法。單特異性多克隆抗體是優(yōu)選的。可以利用本領(lǐng)域眾所周知的方法來制備適宜的多克隆抗體。還可以使用抗體的片段，如Fab和Fab2片段，如可以使用基因工程抗體和抗體片段。抗體的可變重(Vh)和可變輕域是與抗原識別有關(guān)的，這是通過早期蛋白酶消化實驗首先認(rèn)識到的事實。通過嚙齒動物抗體的“人源化”發(fā)現(xiàn)了進(jìn)一步確認(rèn)。可以將嚙齒動物起源的可變域融合于人類起源的恒定域，使得獲得的抗體保留嚙齒動物親代抗體的抗原特異性(Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 81,6851-6855)。根據(jù)涉及抗體片段(均包含一個或多個可變域)的細(xì)菌表達(dá)的實驗，已知抗原特異性由可變域賦予并獨立于恒定域。這些分子包括Fab樣分子(Better et al (1988) Science 240,1041) ；Fv 分子(Skerra et al (1988) Science240,1038)；單鏈 FvGcFv)分子，其中Vi^PVl配偶體域經(jīng)由柔性寡肽相連(Bird et al (1988) Science 242,423 ；Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 85,5879)；以及單域抗體(dAb)，其包含分離的 V 域 (Ward et al (1989) Nature 341,544)。與抗體片段(其保留它們的特異性結(jié)合位點)的合成有關(guān)的技術(shù)的一般評論可參見 Winter & Milstein (1991)Nature 349,293-299。"ScFv分子”我們是指這樣的分子，其中共價連接V1^n \配偶體域，例如通過柔性寡肽。Fab、Fv, ScFv以及dAb抗體片段均可以表達(dá)在大腸桿菌中和分泌自大腸桿菌，因而允許容易生產(chǎn)大量的所述片段。全抗體、以及F(ab' )2片段是“二價的”。“二價的”我們是指所述抗體和F (ab' )2 片段具有兩個抗原結(jié)合位點。與此相反，F(xiàn)ab、FV、kFV以及dAb片段是單價的，僅具有一個抗原結(jié)合位點。還可以利用如本領(lǐng)域眾所周知的噬菌體顯示技術(shù)來制備結(jié)合于PODXL的合成抗體。在一些方法中，抗體是mAb84。mAb 84的V1^P \鏈的氨基酸序列(以及編碼多核苷酸序列)已被確定，如圖14 (SEQ ID NO 4)和15 (SEQ IDNO 5)所示。在此說明書中，mAb84的參比物包括具有\(zhòng)和/或Vh鏈的抗體，該\和/或Vh鏈相對于SEQ ID NO 4和6具有高百分比序列同一性。mAb84的參比物包括具有Vh鏈的結(jié)合P0DXL(優(yōu)選人P0DXL)的抗體，該Vh鏈相對于SEQ ID NO 6具有至少70%、更優(yōu)選至少 75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性之一。mAb84 的參比物包括具有Vl鏈的結(jié)合PODXL (優(yōu)選人P0DXL)的抗體，該Vl鏈相對于SEQ ID N0:4具有至少 70%，更優(yōu)選至少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%的序列同一性之一。相對于PODXL的其它mAb以及它們的應(yīng)用描述在WO 2007/102787中，其結(jié)合于本
文以供參考。mAb 84可以用來在分化以后和可選地在動物移植試驗以前消除殘余未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞以測試它們的分化細(xì)胞的功能。mAb 84 (可選地連同其它mAb—起，如在WO 2007/102787中所描述的或如圖10中所示)可以在移植以前潛在地用來消除殘余未分化hESC或未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，從而增加在再生臨床應(yīng)用中移植的成功和安全。本申請的PODXL結(jié)合部分可以潛在地用來純化或消除呈現(xiàn)抗原庫的活細(xì)胞的子集，上述抗原庫表征未分化細(xì)胞或分化成具體譜系的細(xì)胞。適宜的結(jié)合部分能夠結(jié)合于多肽，該多肽相對于SEQ ID NO :1至3、8或9之一具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99% 或100%的序列同一性之一。在一些優(yōu)選的實施方式中，結(jié)合部分被可檢測地標(biāo)記，或至少能夠檢測。例如，結(jié)合部分可以標(biāo)記有放射性原子或有色分子或熒光分子或可以以任何其它方式容易檢測的分子。適宜的可檢測分子包括熒光蛋白、熒光素酶、酶底物、以及放射性示蹤標(biāo)記。結(jié)合部分可以直接標(biāo)記有可檢測標(biāo)記或可以被間接標(biāo)記。例如，結(jié)合部分可以是未標(biāo)記抗體，該未標(biāo)記抗體可以通過本身被標(biāo)記的另一種抗體來檢測?？商鎿Q地，可以使二抗已結(jié)合于生物素，并且經(jīng)標(biāo)記的鏈霉親和素與生物素的結(jié)合用來間接標(biāo)記一抗。干細(xì)胞術(shù)語“干細(xì)胞”通常是指這樣的細(xì)胞，該細(xì)胞在分裂時面臨兩個發(fā)育選項子細(xì)胞可以與原始細(xì)胞(自我更新)相同或它們可以是更專門細(xì)胞類型(分化)的祖細(xì)胞。因而干細(xì)胞能夠采用一種或其它途徑(存在另外的途徑，其中可以形成每一種細(xì)胞類型之一)。 因而，干細(xì)胞是這樣的細(xì)胞，其并不是終末分化的而是能夠產(chǎn)生其它類型的細(xì)胞。如在本文中所使用的，術(shù)語“干細(xì)胞”尤其是指誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞(ESC)可以從胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)中分離，其中胚泡是當(dāng)發(fā)生移植時胚胎發(fā)育的時期。多能干細(xì)胞多能干細(xì)胞是具有在體內(nèi)獲得任何分化細(xì)胞的潛力的真正干細(xì)胞。然而，它們不能有助于獲得源自滋養(yǎng)層的胚外膜。已發(fā)現(xiàn)多種類型的多能干細(xì)胞。多能性干細(xì)胞多能性干細(xì)胞是真正的干細(xì)胞但僅能分化成有限數(shù)目的類型。例如，骨髓包含多能性干細(xì)胞，該多潛能干細(xì)胞產(chǎn)生血液的所有細(xì)胞但并不產(chǎn)生其它類型的細(xì)胞。多能性干細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)于成年動物中。認(rèn)為，體內(nèi)的每個器官包含它們，其中它們可以更換死亡或受損的細(xì)胞。表征干細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域是已知的，并且包括使用標(biāo)準(zhǔn)分析方法如克隆試驗、 流式細(xì)胞術(shù)、長期培養(yǎng)以及分子生物學(xué)技術(shù)，例如PCR、RT-PCR以及DNA印跡法。成年干細(xì)胞成年干細(xì)胞包括各種各樣的類型，包括神經(jīng)元、皮膚以及造血干細(xì)胞，其是骨髓移植中的活性成分。這些后面的干細(xì)胞類型還是臍帶源干細(xì)胞的主要特點。成年干細(xì)胞可以在實驗室中和在體內(nèi)均成熟變成功能性、更專門的細(xì)胞類型，雖然細(xì)胞類型的確切數(shù)目受限于所選干細(xì)胞的類型。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，通?？s寫為iPS細(xì)胞或iPSC，是一種類型的多能干細(xì)胞，該多能干細(xì)胞通過插入一些基因人工來自非多能細(xì)胞，通常成年體細(xì)胞。在Takahashi，K. & Yamanaka (2006) ,Yamanaka S等人 Q007)、Wernig M等人 Q007)、Maherali N等人 Q007)、 Yu J等人Q007)以及Takahashi等人O007)(均結(jié)合于本文以供參考)中述評和討論了 iPS細(xì)胞。通常通過將一些干細(xì)胞相關(guān)基因轉(zhuǎn)染成非多能細(xì)胞，如成年成纖維細(xì)胞，來獲得 iPS細(xì)胞。通常通過病毒載體，例如通過逆轉(zhuǎn)錄病毒重新編程，來實現(xiàn)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染基因包括主轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子0ct-3/4(POUf51)和Sox2，雖然教導(dǎo)了其它基因會增強誘導(dǎo)的效率。在3_4 周以后，少量轉(zhuǎn)染細(xì)胞開始變得形態(tài)和生化上類似于多能干細(xì)胞，并且通常通過形態(tài)選擇、 倍增時間、或通過報道基因和抗生素感染，來加以分離。通過用一種或多種轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)染，可以從從體細(xì)胞如成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)IPSC。在
17一些情況下，用0ct3/4、Sox2、c-Myc以及Klf4來轉(zhuǎn)化細(xì)胞。可以用其它基因另外轉(zhuǎn)染細(xì)胞，包括轉(zhuǎn)錄因子和/或標(biāo)記基因?？梢岳棉D(zhuǎn)座子系統(tǒng)如Cre/loxP重組系統(tǒng)、或利用非整合載體，來引入基因，以便產(chǎn)生沒有外源性重新編程基因的iPSC?？梢岳貌《据d體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒，來實現(xiàn)轉(zhuǎn)染。病毒可以是雙嗜性病毒。在細(xì)胞已被轉(zhuǎn)染以后，在轉(zhuǎn)移到ESC培養(yǎng)基以前，它們可以生長在飼養(yǎng)細(xì)胞上。IPSC可以源自兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它嚙齒動物、貓、狗、豬、羊、山羊、牛、馬、非人靈長類動物或其它非人脊椎動物生物。在優(yōu)選的實施方式中，IPSC源自人細(xì)胞?？捎糜诒景l(fā)明的iPS細(xì)胞可以源自任何適宜的細(xì)胞類型，包括肺細(xì)胞、包皮成纖維細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、血祖細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、肝細(xì)胞、胃上皮細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、 神經(jīng)干細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、ES源體細(xì)胞以及胚胎成纖維細(xì)胞。iPS細(xì)胞可以源自人、小鼠或其它哺乳動物。優(yōu)選地，iPS細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些情況下，細(xì)胞不是人皮膚成纖維細(xì)胞。 IPSC可以呈現(xiàn)與ESC類似的基因表達(dá)模式和表型。在本發(fā)明中，未分化IPSC在它們的表面上表達(dá)PODXL。與ESC —樣，通過污染殘余的未分化IPSC，分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的未來的治療應(yīng)用帶有畸胎瘤形成的危險。盡管存在這個問題，但目前并沒有開發(fā)許多策略來分開這些細(xì)胞群體。本發(fā)明特別涉及在細(xì)胞表面上表達(dá)PODXL的IPSC，即，在它們的表面上具有PODXL 的IPSC，其可用于結(jié)合于PODXL結(jié)合部分。本發(fā)明還特別涉及源自人細(xì)胞的IPSC。干細(xì)胞的培養(yǎng)培養(yǎng)干細(xì)胞的任何適宜方法可以用于本文描述的方法和組合物。根據(jù)本文描述的方法和組合物，任何適宜的容器可以用來增殖干細(xì)胞。適宜的容器包括在美國專利公開US2007/(^64713 (Terstegge)中所描述的那些容器。容器可以包括例如生物反應(yīng)器和旋轉(zhuǎn)器?！吧锓磻?yīng)器”，當(dāng)該術(shù)語用于本文中時， 是適合于如大規(guī)模培養(yǎng)真核細(xì)胞，例如動物細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞的容器。受調(diào)節(jié)的生物反應(yīng)器的典型培養(yǎng)容積為20ml至500ml之間。生物反應(yīng)器可以包括受調(diào)節(jié)的生物反應(yīng)器，其中可以控制或監(jiān)測一種或多種條件，例如，氧分壓。用于測量和調(diào)節(jié)這些條件的裝置在本領(lǐng)域是已知的。例如，氧電極可以用于氧分壓。可以經(jīng)由所選擇氣體混合物(例如，空氣或空氣和/或氧氣和/或氮氣和/或二氧化碳的混合物)的量和組成來調(diào)節(jié)氧分壓。由Bailey，J Ε. (Bailey, J Ε. , Biochemical Engineering Fundamentals, second edition, McGraw-Hill, Inc. ISBN 0-07-003212-2Higher Education, (1986)) ■ Jackson A T.Jackson A Τ., Verfahrenstechnik in der Biotechnologie, Springer, ISBN 3540561900 (1993))描述了用于測量和調(diào)節(jié)氧分壓的適宜裝置。其它適宜的容器包括旋轉(zhuǎn)器。旋轉(zhuǎn)器是受調(diào)節(jié)的或未受調(diào)節(jié)的生物反應(yīng)器，其可以利用各種攪拌器裝置如玻璃球攪拌器、葉輪式攪拌器、以及其它適宜的攪拌器進(jìn)行攪拌。 旋轉(zhuǎn)器的培養(yǎng)容積通常為20ml至500ml之間。滾瓶是具有400至2000cm2之間培養(yǎng)面積的由塑料或玻璃制成的圓形細(xì)胞培養(yǎng)瓶。沿著這些瓶的整個內(nèi)表面培養(yǎng)細(xì)胞；通過“滾動” 運動，即圍繞它們的各自的軸旋轉(zhuǎn)瓶，來實現(xiàn)用培養(yǎng)基涂布細(xì)胞?？商鎿Q地，培養(yǎng)可以是靜態(tài)的，即，其中并不采用培養(yǎng)物/培養(yǎng)基的主動攪拌。通過減少培養(yǎng)物的攪拌，可以便于形成細(xì)胞的聚集體。雖然一定的攪拌可以用來促進(jìn)培養(yǎng)基在培養(yǎng)細(xì)胞上的分布和流動，但這可以被使用以便不會顯著擾亂聚集體形成。例如，可以采用低rpm攪拌，例如小于30rpm或小于20rpm。利用傳代的增殖本文描述的方法和組合物可以包括在培養(yǎng)期間的傳代、或分裂。該方法可以涉及連續(xù)或持續(xù)傳代?！俺掷m(xù)的”或“連續(xù)的”我們是指，我們的方法能夠以一定方式來生長干細(xì)胞，上述方式使得它們能夠被傳代，例如，取走它們在其上生長的平板或微載體，并轉(zhuǎn)移到其它平板、微載體或顆粒，并且此過程可以重復(fù)至少一次，例如兩次、三次、四次、五次等。在一些情況下，這可以重復(fù)任何數(shù)目的次數(shù)，例如不確定或無限次數(shù)。在培養(yǎng)物中的細(xì)胞可以從底物或燒瓶中離解，以及通過稀釋到組織培養(yǎng)基中并再平板接種，被“分裂”、繼代培養(yǎng)或傳代?？梢詫⑸L在顆粒上的細(xì)胞傳代回到顆粒培養(yǎng)物中?？商鎿Q地，可以將它們傳代回到常規(guī)OD)培養(yǎng)物上?？梢詫⑸L在平板上的組織培養(yǎng)細(xì)胞傳代到顆粒培養(yǎng)物上。術(shù)語“傳代” 一般可以指以下過程獲取等分部分的細(xì)胞培養(yǎng)物，完全或部分地離解(或分離)細(xì)胞，稀釋并接種到培養(yǎng)基中。傳代可以重復(fù)一次或多次。等分部分可以包括全部或部分的細(xì)胞培養(yǎng)物。等分部分的細(xì)胞可以是完全、部分或不匯合的。傳代可以包括至少一些以下的步驟順序吸入、沖洗、胰蛋白酶消化、溫育、移去、猝滅、重接種以及等分?？梢允褂糜?Hedrick Lab,UC San Diego 公開的規(guī)程(http://hedricklab.ucsd.edu/ Protocol/COSCell. html)?？梢酝ㄟ^任何適宜的方式，如本領(lǐng)域已知的機械或酶方式，來離解細(xì)胞?？梢酝ㄟ^機械離解，例如利用細(xì)胞刮棒或移液管，來破碎細(xì)胞?？梢酝ㄟ^篩分通過適宜的篩孔尺寸， 如通過100微米或500微米篩，來離解細(xì)胞?？梢酝ㄟ^酶離解，例如通過用收獲的膠原酶或 trypLE的處理，來分裂細(xì)胞。離解可以是完全或部分的。稀釋可以具有任何適宜的稀釋度?？梢砸匀魏芜m宜的比率來分裂在細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞。例如，可以以1 2或更大、1 3或更大、1 4或更大或1 5或更大的比率來分裂細(xì)胞。因此，干細(xì)胞可以被傳代1個傳代或更多。例如，干細(xì)胞可以被傳代2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 次傳代或更多。傳代可以表示為細(xì)胞生長的產(chǎn)生。我們的方法和組合物使干細(xì)胞可以增殖1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 代或更多。傳代還可以表示為細(xì)胞倍增的數(shù)目。我們的方法和組合物使干細(xì)胞可以增殖1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 個細(xì)胞倍增或更尚。干細(xì)胞特征的維持增殖的干細(xì)胞可以保留靈長類或人干細(xì)胞的至少一種特征。在一次或多次傳代以后，干細(xì)胞可以保留上述特征。在多次傳代以后，它們可以如此。如上所述，在所述數(shù)目的傳代以后，它們可以如此。上述特征可以包括形態(tài)特征、免疫組織化學(xué)特征、分子生物學(xué)特征等。上述特征可以包括生物活性。
干細(xì)胞特征通過我們的方法增殖的干細(xì)胞可以呈現(xiàn)以下干細(xì)胞特征中的任何一種。干細(xì)胞可以呈現(xiàn)0ct4和/或SSEA-I和/或TRA-1-60的增加的表達(dá)。與并不自我更新的干細(xì)胞相比，自我更新的干細(xì)胞可以呈現(xiàn)縮短的細(xì)胞周期。干細(xì)胞可以呈現(xiàn)確定的形態(tài)。例如，在二維標(biāo)準(zhǔn)顯微圖像中，人胚胎干細(xì)胞在圖像平面中呈現(xiàn)高核/質(zhì)比、突出的核仁、以及緊湊的集落形成(具有不好分辨的細(xì)胞連接)。如下文進(jìn)一步詳細(xì)描述的，還可以通過表達(dá)的細(xì)胞標(biāo)記物來表征干細(xì)胞。多能標(biāo)記的表汰保留的生物活性可以包括一種或多種多能標(biāo)記的表達(dá)。階段特異性胚胎抗原(SSEA)是一些胚胎細(xì)胞類型的特征。用于SSEA標(biāo)記的抗體可獲自 Developmental Studies Hybridoma Bank(Bethesda Md.)。利用抗體指定的 Tra-1-60 和 Tra-1-81，其它有用的標(biāo)記是可檢測的(Andrews et al.，Cell Lines from Human Germ Cell Tumors, in E. J. Robertson，1987，上文)。人胚胎干細(xì)胞通常是 SSEA-1 陰性的以及SSEA-4陽性的。hEG細(xì)胞通常是SSEA-I陽性的。靈長類多能干細(xì)胞(pPS)的體外分化導(dǎo)致SSEA-4、Tra-1-60、以及 ει-1-81表達(dá)的喪失，以及SSEA-1的表達(dá)增加。還可以通過堿性磷酸酶活性的存在來表征PPS細(xì)胞，其中上述堿性磷酸酶活性可以通過用 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后用Vector Red作為底物進(jìn)行顯影，來檢測，如制造商所描述的 (Vector Laboratories, Burlingame Calif·)。胚胎干細(xì)胞還通常是端粒末端轉(zhuǎn)移酶陽性的和0CT-4陽性的?？梢岳肨RAP活性測定來確定端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性(Kim et al. ,Science 266 :2011，1997)，其中利用商用試劑盒(TRAPeze. RTM. XK Telomerase Detection Kit, Cat. s7707 ；Intergen Co. , Purchase N. Y.；或iTeloTAGGG. TM. Telomerase PCR ELISA plus, Cat. 2, 013, 89 ；Roche Diagnostics, Indianapolis) 還可以通過RT-PCR在mRNA水平下來評價hTERT表達(dá)。LightCycler TeloTAGGG hTERT 量化試劑盒(Cat. 3，012, 344 ；Roche Diagnostics)在商業(yè)上可獲得，用于研究目的。增殖的干細(xì)胞可以保留這些多能標(biāo)記中的任何一種或多種，包括F0XD3、P0DXL、堿性磷酸酶、OCT-4、SSEA-4、TRA-1-60 以及 Mab84 等?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方式例如免疫學(xué)方式來實現(xiàn)標(biāo)記的檢測?？梢允褂媒M織化學(xué)染色、流式細(xì)胞術(shù)(FACS)、蛋白質(zhì)印跡、酶聯(lián)免疫測定(ELISA)等。流式免疫細(xì)胞化學(xué)可以用來檢測細(xì)胞表面標(biāo)記。免疫組織化學(xué)(例如，固定細(xì)胞或組織切片的)可以用于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面標(biāo)記?？梢詫?xì)胞提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。酶聯(lián)免疫測定可以用于細(xì)胞提取物或分泌進(jìn)入培養(yǎng)基的產(chǎn)物。為此目的，可以使用相對于多能標(biāo)記(如可獲自商業(yè)來源)的抗體?？梢陨虡I(yè)上，例如從 Chemicon International, Inc (Temecula，CA，USA)，獲得用于鑒定干細(xì)胞標(biāo)記的抗體，上述干細(xì)胞標(biāo)記包括階段特異性胚胎抗原1和4(SSEA-1 和SSEA-4)以及腫瘤排斥抗原1-60和1-81 (TRA-1-60、TRA-1-81)。利用單克隆抗體進(jìn)行的這些抗原的免疫檢測已廣泛用來表征多能干細(xì)胞(Shamblott M.J. et.al. (1998) PNAS 95 :13726-13731 ；Schuldiner M. et. al. (2000) · PNAS 97 :11307-11312 ；Thomson J. A. et. al. (1998). Science 282 :1145-1147 ；Reubinoff B. Ε. et. al. (2000). NatureBiotechnology 18 :399-404 ；Henderson J. K. et. al. (2002) · Stem Cells20 :329-337 ；Pera Μ. et. al. (2000). J. Cell Science 113:5—10)。還可以在mRNA水平下通過RNA印跡分析、斑點雜交分析，或通過逆轉(zhuǎn)錄酶引發(fā)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)并利用標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增方法中的序列特異性引物，來檢測組織特異性基因產(chǎn)物的表達(dá)。列在本文披露內(nèi)容中的特定標(biāo)記的序列數(shù)據(jù)可以獲自公共數(shù)據(jù)庫如 GenBank (URL www, ncbi. nlm. nih. gov :80/entrez)。關(guān)于進(jìn)一步詳情，參見美國專利號 5，843，780?；旧纤械脑鲋车募?xì)胞、或它們的大部分，可以表達(dá)標(biāo)記。例如，表達(dá)一種或多種標(biāo)記的細(xì)胞的百分比可以是50%或更高、60%或更高、70%或更高、80%或更高、90%或更高、93%或更高、95%或更高、97%或更高、98%或更高、99%或更高、或基本上100%。細(xì)胞牛存力生物活性可以包括在所陳述數(shù)目的傳代以后的細(xì)胞生存力?？梢杂酶鞣N方式，例如通過臺盼藍(lán)排除，來測定細(xì)胞生存力。活體染色的規(guī)程如下。將適宜體積的細(xì)胞懸液(20-200 μ L)放置在適當(dāng)?shù)墓苤校?添加等體積的0. 4%臺盼藍(lán)并輕輕地混合，在室溫下靜置5分鐘。將10 μ 1染色細(xì)胞放置在血細(xì)胞計數(shù)器中并計數(shù)活(未染色)和死(染色)細(xì)胞的數(shù)目。計算在每個象限中未染色細(xì)胞的平均數(shù)，并乘以2Χ IO4以得到細(xì)胞/ml?；罴?xì)胞的百分比是活細(xì)胞的數(shù)目除以死亡和活細(xì)胞的數(shù)目。細(xì)胞生存力可以是50%或更高、60%或更高、70%或更高、80%或更高、90%或更高、93%或更高、95%或更高、97%或更高、98%或更高、99%或更高、或基本上100%。HM在增殖期間或以后，增殖的干細(xì)胞可以保留正常核型?！罢！焙诵褪沁@樣的核型， 其與干細(xì)胞所源自的親代干細(xì)胞的核型相同、類似或基本上類似，或其不同于但并不以任何顯著方式不同于上述親代干細(xì)胞的核型。例如，不應(yīng)存在任何嚴(yán)重異常如易位、染色體的喪失、缺失等。可以通過許多方法來評估核型，例如光學(xué)顯微鏡下目測。可以制備和分析核型，如在 McWhir et al. (2006),Hewitt et al. (2007)、以及 Gallimore 和 Richardson (1973)中所描述的。還可以利用標(biāo)準(zhǔn)G顯帶技術(shù)(可獲自許多臨床診斷實驗室，其提供常規(guī)核型分析服務(wù)，如Cytogenetics Lab,Oakland Calif.)對細(xì)胞進(jìn)行核型分析并與發(fā)表的干細(xì)胞核型進(jìn)行比較。所有或大部分的增殖細(xì)胞可以保留正常核型。此比例可以是50%或更高、60%或更高、70%或更高、80%或更高、90%或更高、93%或更高、95%或更高、97%或更高、98%或更高、99%或更高、或基本上100%。多能性增殖的干細(xì)胞可以保留分化成所有三種細(xì)胞譜系即內(nèi)胚層、外胚層以及中胚層的能力。誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成這些譜系中的每一種的方法在本領(lǐng)域是已知的并且可以用來測定增殖的干細(xì)胞的能力。所有或大部分的增殖細(xì)胞可以保留這種能力。此可以是50%或更高、60%或更高、70%或更高、80%或更高、90%或更高、93%或更高、95%或更高、97%或更高、98%或更高、99%或更高、或基本上100%的增殖干細(xì)胞。
可以通過利用適宜的測定來確定所產(chǎn)生的干細(xì)胞的多能性。上述測定可以包括 通過觀測在SCID小鼠中畸胎瘤形成的程度或胚胎樣體的形成，檢測多能性的一種或多種標(biāo)記，例如SSEA-I抗原、堿性磷酸酶活性，檢測Oct-4基因和/或蛋白表達(dá)?？梢酝ㄟ^一種或多種標(biāo)記如Oct-4 ,SSEAUra-l-eOJra-l-SLSOXj以及GCTM-2的表達(dá)，來定義hESC 的多能性。共培養(yǎng)物和飼養(yǎng)物方法可以包括在有或沒有共培養(yǎng)物存在的情況下培養(yǎng)干細(xì)胞。術(shù)語“共培養(yǎng)物”是指生長在一起的兩種或更多種不同種類的細(xì)胞的混合物，例如，基質(zhì)飼養(yǎng)細(xì)胞。兩種或更多種不同種類的細(xì)胞可以生長在相同表面上，如顆粒或細(xì)胞容器表面，或不同表面上。不同種類的細(xì)胞可以生長在不同顆粒上。飼養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)該術(shù)語在本文中使用時，可以是指這樣的細(xì)胞，其用于或需要用于培養(yǎng)不同類型的細(xì)胞。在干細(xì)胞培養(yǎng)的情況下，飼養(yǎng)細(xì)胞具有以下功能確保生存、增殖、以及維持細(xì)胞多能性?？梢酝ㄟ^直接共培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞來實現(xiàn)細(xì)胞多能性。可替換地、或另外，可以在培養(yǎng)基中培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞以對其進(jìn)行調(diào)節(jié)。受調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基可以用來培養(yǎng)干細(xì)胞。容器如培養(yǎng)皿的內(nèi)表面可以涂布有小鼠胚胎皮膚細(xì)胞的飼養(yǎng)層，其中上述小鼠胚胎皮膚細(xì)胞已被處理使得它們不會分裂。飼養(yǎng)細(xì)胞將營養(yǎng)物釋放到培養(yǎng)基中，其是ES細(xì)胞生長所需要的。因而，生長在顆粒上的干細(xì)胞可以生長在上述經(jīng)涂布的容器中。其中沒有或不需要飼養(yǎng)細(xì)胞的安排也是可能的。例如，可以使細(xì)胞生長在通過飼養(yǎng)細(xì)胞或干細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基和飼養(yǎng)細(xì)胞用于分離和增殖多能干細(xì)胞的培養(yǎng)基可以具有許多不同配方中的任何一種，只要獲得的細(xì)胞具有所期望的特征，并且可以進(jìn)一步增殖。適宜的來源如下Dulbecco改良的 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM)，Gibco#l 1965-092 ； Knockout Dulbecco 改良的 Eagle 培養(yǎng)基(K0 DMEM)，Gibco#10829-018 ；200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027 ；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050 ； β -巰基乙醇，Sigma#M7522 ； 人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，Gibco#13256-(^9。典型的含血清胚胎干(ES) 培養(yǎng)基用80% DMEM(通常為KO DMEM)、未熱滅活的20%限定的胎牛血清(FBS)、0. ImM非必需氨基酸、ImM L-谷氨酰胺、以及0. ΙπιΜβ-巰基乙醇制成。過濾培養(yǎng)基并在4攝氏度下存儲不長于2周。無血清胚胎干(ES)培養(yǎng)基用80% KO DMEM、20%血清替代品、0. ImM 非必需氨基酸、ImML-谷氨酰胺、以及0. ImM β-巰基乙醇制成。一種有效的血清替代品是Gibco#10828-028。過濾培養(yǎng)基并在4攝氏度下存儲不長于2周。剛好在使用之前， 添力口人 bFGF 至最終濃度為 4ng/mL (Bodnar et al. , Geron Corp, International Patent Publication WO 99/20741)。培養(yǎng)基可以包含Knockout DMEM 培養(yǎng)基(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York)，補充有 10%血清替代品培養(yǎng)基(Invitrogen-Gibco,Grand Island,New York)、5ng/ ml FGF2 (Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York)以及 5ng/ml PDGF AB (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey)?？梢栽趍EF培養(yǎng)基中增殖飼養(yǎng)細(xì)胞(在使用的情況下)，其中上述mEF培養(yǎng)基包含 90% DMEM(Gibco#l 1965-092)、10% FBS (Hyclone#30071_03)、以及 2mM 谷氨酰胺。在 T150
22燒瓶(Coming#430825)中增殖mEF，每隔一天用胰蛋白酶分裂細(xì)胞1 2，保持細(xì)胞為亞匯合的。為了制備飼養(yǎng)細(xì)胞層，以一定劑量照射細(xì)胞以抑制增殖但允許支持人胚胎干細(xì)胞的重要因子的合成(約4000拉德γ照射)。通過在37攝氏度下用ImL 0.5%明膠/孔溫育過夜來涂布6孔培養(yǎng)平板(如FalCOn#304)，然后平板接種有375，000個經(jīng)照射的mEF/孔。 通常在平板接種以后5小時至4天使用飼養(yǎng)細(xì)胞層。用于培養(yǎng)其它干細(xì)胞的條件是已知的，并且按照細(xì)胞類型可以適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行優(yōu)化。 用于先前部分提及的特定細(xì)胞類型的培養(yǎng)基和培養(yǎng)技術(shù)提供在引用的參考文獻(xiàn)中。無血清培養(yǎng)基本文描述的方法和組合物可以包括在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞。術(shù)語“無血清培養(yǎng)基”可以包含沒有血清蛋白，例如胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基在本領(lǐng)域是已知的，并且描述于例如美國專利5，631，159和5，661，034中。無血清培養(yǎng)基可商業(yè)上獲自，例如，Gibco-BRL(Invitrogen)。無血清培養(yǎng)基可以是無蛋白的，因為它可以缺乏蛋白、水解產(chǎn)物、以及未知組成的成分。無血清培養(yǎng)基可以包括化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，其中所有成分具有已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)。 化學(xué)成分確定的無血清培養(yǎng)基是有利的，因為它提供完全確定的體系，其可以消除可變性并提供提高的再現(xiàn)性和更加一致的性能，以及降低不定制劑污染的可能性。無血清培養(yǎng)基可以包括Knockout DMEM 培養(yǎng)基(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York)。無血清培養(yǎng)基可以補充有一種或多種成分，如血清替代品培養(yǎng)基，濃度為例如， 5%、10%、15%等。無血清培養(yǎng)基可以補充有來自hvitrogen-Gibco (Grand Island, New York)的10%血清替代品培養(yǎng)基。其中培養(yǎng)離解或解聚的胚胎干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，可以包含一種或多種生長因子。許多生長因子在本領(lǐng)域中是已知的，包括FGF2、IGF-2、頭蛋白、活化素A、TGF β 1、 HRGl β、LIF、SIP、PDGF、BAFF、April、SCF、Flt-3 配體、Wnt3A 以及其它生長因子?？梢砸匀魏芜m宜濃度如在lpg/ml至500ng/ml之間來使用生長因子。培養(yǎng)基補充物培養(yǎng)基可以補充有一種或多種添加劑。例如，這些添加劑可以選自脂質(zhì)混合物、牛血清白蛋白(例如0. 1% BSA)、大豆蛋白的水解產(chǎn)物中的一種或多種。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的來源現(xiàn)已提供了用于分離多能干細(xì)胞的多種方法，其并不導(dǎo)致胚胎的破壞，例如通過轉(zhuǎn)化(誘導(dǎo))成年體細(xì)胞或生殖細(xì)胞。這些方法包括1.通過細(xì)胞核移植的再編程。此技術(shù)涉及細(xì)胞核從體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞或合子中。在一些情況下，這可以導(dǎo)致產(chǎn)生動物-人雜交細(xì)胞。例如，可以通過人體細(xì)胞與動物卵母細(xì)胞或合子的融合或人卵母細(xì)胞或合子與動物體細(xì)胞的融合來產(chǎn)生細(xì)胞。2.通過與胚胎干細(xì)胞的融合進(jìn)行再編程。此技術(shù)涉及體細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞的融合。如在上述1中，此技術(shù)也可以導(dǎo)致產(chǎn)生動物-人雜交細(xì)胞。3.通過培養(yǎng)自發(fā)再編程。此技術(shù)涉及在長期培養(yǎng)以后從非多能細(xì)胞產(chǎn)生多能細(xì)胞。例如，通過原始生殖細(xì)胞(PGC)的長期培養(yǎng)，已產(chǎn)生多能胚胎生殖(EG)細(xì)胞(Matsui et al. ，Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordialgerm cells in culture. Cell 70，841-847，1992，其結(jié)合于本文以供參考)。還已報道， 在源自骨髓的細(xì)胞的長期培養(yǎng)以后，多能干細(xì)胞的發(fā)育(Jiang et al. , Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 418,41-49,2002,其結(jié)合于本文以供參考)。他們指定這些細(xì)胞為多能成年祖細(xì)胞(MAPC)。Siinohara等人還表明， 在來自新生小鼠睪丸的生殖干(GQ細(xì)胞的培養(yǎng)期間，可以產(chǎn)生多能干細(xì)胞，他們將其指定為多會邑生殖干(mGS)細(xì)胞(Kanatsu—Shinohara et al. ,Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis.Cell 119，1001-1012，2004)。4.通過確定因子的再編程。例如，通過將轉(zhuǎn)錄因子(如0ct-3/4、Sox2、c_Myc、以及KLF4)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)引入小鼠胚胎或成年成纖維細(xì)胞來產(chǎn)生iPS細(xì)胞，例如，如上所述。Kaji 等人(Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. Online publication IMarch 2009)還描述了單一多蛋白表達(dá)載體的非病毒轉(zhuǎn)染，上述單一多蛋白表達(dá)載體包括用2A肽連接的C-MyC、Klf4、0Ct4 以及Sox2的編碼序列，其可以再編程小鼠和人成纖維細(xì)胞兩者。借助于這種非病毒載體產(chǎn)生的iPS細(xì)胞顯示多能標(biāo)記的強勁表達(dá)，這表明功能上通過體外分化測定和成年嵌合小鼠的形成所證實的重新編程狀態(tài)。他們從具有多能標(biāo)記的強勁表達(dá)的胚胎成纖維細(xì)胞成功建立了重新編程的人細(xì)胞系。Shinya Yamanaka 在 Strategies and New Developments in the Generation of Patient-Specific Pluripotent Stem Cells (Cell Stem Cell 1， July 2007a2007Elsevier he)(其結(jié)合于本文以供參考)中描述和討論了方法1_4。5.從單個卵裂球或活檢卵裂球衍生hESC系。參見Klimanskaya I，Chung Y， Becker S，Lu SJ, Lanza R. Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres. Nature 2006 ；444 :512, Lei et al Xeno-free derivation and culture of human embryonic stem cells :current status，problems and challenges. Cell Research (2007) 17 :682-688, Chung Y，Klimanskaya I，Becker S，et al. Embryonic and extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres. Nature. 2006 ；439 :216-219. Klimanskaya I，Chung Y，Becker S，et al. Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres. Nature. 2006 ；444 :481-485. Chung Y，Klimanskaya I，Becker S，et al. Human embryonic stem cell lines generated without embryo destruction. Cell Stem Cell. 2008 ；2 :113-117 以及 Dusko Ilic et al (Derivation of human embryonic stem cell lines from biopsied blastomeres on human feeders with a minimal exposure to xenomaterials. Stem Cells And Development-出版前的論文)，均結(jié)合于本文以供參考。6. hESC系獲自靜止的胚胎，其體外停止分裂并且未能發(fā)育成桑葚胚和胚泡。參見 Zhang X,Stojkovic P,Przyborski S,et al. Derivation of human embryonic stem cells from developing and arrested embryos. Stem Cells 2006 ;24 :2669-2676 以及Lei et al Xeno-free derivation and culture of human embryonic stem cells current status, problems and challenges. Cell ResearchQ007) 17 :682_688，兩者結(jié)合于本文以供參考。7.單性生殖(或孤雌生殖)。此技術(shù)涉及未受精卵的化學(xué)或電刺激以便引起它發(fā)育成卵裂球，從該卵裂球可以衍生胚胎干細(xì)胞。例如，參見Lin et al. Multilineagepotential of homozygous stem cells derived from metaphase II oocytes. Stem Cells. 2003 ；21 (2) :152_61，其采用非受精中期II卵母細(xì)胞的化學(xué)活化以產(chǎn)生干細(xì)胞。8.胎兒起源的干細(xì)胞。就潛力而言，這些細(xì)胞位于胚胎和成年干細(xì)胞之間并且可以用來衍生多能或多能性細(xì)胞。Chris H. Jo等人(Fetal mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord sustain primitive characteristics during extensive expansion. Cell Tissue Res (2008) 3；34 :423_433，其結(jié)合于本文以供參考)已成功衍生表達(dá)多能標(biāo)記(包括 Nanog、0ct-4、Sox-2、Rex-l、SSEA-3、SSEA-4、Tra-l-60、以及 Tra_l_81， 如β -半乳糖苷酶染色、以及端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性的一致表達(dá)所表明的衰老的最小證據(jù)) 的人臍源性胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞(UC fMSC)。Winston Costa Pereira等人(Reproducible methodology for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord and its potential for cardiomyocyte generation J Tissue Eng Regen Med 2008 ；2 :394-399,其結(jié)合于本文以供參考)從人臍帶的沃頓氏膠分離了間充質(zhì)干細(xì)胞的純?nèi)后w。在 Troyer & Weiss (Concise Review :Wharton’ s Jelly-Derived Cells Are a primitive Stromal Cell Population. Stem Cells 2008 26 :591-599)中還綜述了源自沃頓氏膠的間充質(zhì)干細(xì)胞。Kim等人(Ex vivo characteristics of human amniotic membrane-derived stem cells. Cloning Stem Cells 2007Winter ；9 (4) :581_94，其結(jié)合于本文以供參考)成功從人羊膜分離了人羊膜源性間充質(zhì)細(xì)胞。臍帶是通常丟棄的組織， 并且從此組織衍生的干細(xì)胞往往不會引起道德或倫理的反對。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有以下優(yōu)點它們可以通過并不引起胚胎破壞的方法來獲得， 更特別地通過并不引起人或哺乳動物胚胎破壞的方法獲得。因此，通過使用并不專門通過必然涉及人或動物胚胎破壞(從其可以衍生那些細(xì)胞)的方法制備的細(xì)胞，可以進(jìn)行或?qū)嵤┍景l(fā)明的方面。這種可選的限制具體用來考慮到歐洲專利局?jǐn)U大上訴委員會的2008年 11月25日的決定G0002/06。未分化細(xì)胞的分化IPSC可以被誘導(dǎo)以分化成各種不同的細(xì)胞類型。例如，IPSC可以被誘導(dǎo)以分化成心臟細(xì)胞(心肌細(xì)胞)、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、軟骨(軟骨細(xì)胞)、肌肉、脂肪(脂肪細(xì)胞)、骨 (骨細(xì)胞)或其它細(xì)胞。IPSC可以被誘導(dǎo)以形成組織如上皮組織、中胚層、內(nèi)胚層、外胚層或表皮。分化干細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域是已知的并且描述在例如Itskovitz-EldorOOOO) 和Graichen等人Q007)中并且可以與IPSC—起使用。培養(yǎng)的干細(xì)胞還可以用于胚胎樣體的形成。胚胎樣體、以及用于制備它們的方法在本領(lǐng)域是已知的。術(shù)語“胚胎樣體”是指在培養(yǎng)物中看到的球狀集落，其可以通過在懸浮液中的胚胎干細(xì)胞的生長來產(chǎn)生。胚胎樣體具有混合細(xì)胞類型，并且特定細(xì)胞類型的出現(xiàn)的分布和定時對應(yīng)于在胚胎中所觀測到的分布和定時。可以通過將胚胎干細(xì)胞平板接種到培養(yǎng)基如半固體培養(yǎng)基上來產(chǎn)生胚胎樣體。 如在Lim et al，Blood. 1997 ；90 :1291-1299中所描述的，可以使用甲基纖維素培養(yǎng)基。胚胎干細(xì)胞可以被誘導(dǎo)以形成胚胎樣體，例如利用在Itskovitz-EldorOOOO)中所描述的方法。胚胎樣體包含所有三種胚層(內(nèi)胚層、外胚層、中胚層)的細(xì)胞。胚胎樣體可以進(jìn)一步被誘導(dǎo)以分化成不同譜系，例如通過暴露于適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)因子或環(huán)境變化。Graichen等人Q007)描述了通過操作p38MAP激酶途徑而從人胚胎干細(xì)胞形成心肌細(xì)胞。Graichen證實了，通過暴露于p38MAP激酶的特異性抑制劑如SB203580(小于 IOym)來誘導(dǎo)從干細(xì)胞形成心肌細(xì)胞。分化細(xì)胞可以用于任何適宜目的，如再生療法和細(xì)胞移植(如本領(lǐng)域已知的)。治療用涂通過本發(fā)明的方法鑒定和/或分離的分化和未分化IPSC在醫(yī)學(xué)上例如在細(xì)胞治療中具有各種用途。細(xì)胞治療可以包括細(xì)胞的植入或移植，或者作為單個細(xì)胞的群體、或以細(xì)胞凝集體或組織的形式，和/或再生療法，例如組織再生、替代和/或修復(fù)。可以在體外培養(yǎng)物中擴(kuò)增分化和未分化IPSC并直接給予患者。在創(chuàng)傷以后，它們可以用于損傷組織的種群恢復(fù)和/或修復(fù)。IPSC可以直接使用，或用來產(chǎn)生外胚層、中胚層或內(nèi)胚層祖細(xì)胞群體，用于再生療法?？梢酝ㄟ^離體擴(kuò)增來制造祖細(xì)胞或?qū)⒆婕?xì)胞直接給予患者。它們還可以在創(chuàng)傷以后用于損傷組織的種群恢復(fù)和/或修復(fù)。因此，造血祖細(xì)胞可以用于骨髓替代，而心臟祖細(xì)胞可以用于心力衰竭患者。皮膚祖細(xì)胞可以用于生長患者的皮膚移植物以及內(nèi)皮祖細(xì)胞用于人工假體如支架或人工心臟的內(nèi)皮化。IPSC可以用作外胚層、中胚層或內(nèi)胚層祖細(xì)胞的來源，上述細(xì)胞用于治療變性疾病如糖尿病、亨廷頓病、阿爾茨海默病以及帕金森病。IPSC可以用作中胚層或內(nèi)胚層祖細(xì)胞 (用于NK)或樹突狀細(xì)胞(用于癌癥的免疫治療)的來源。本文描述的方法和組合物使得能夠產(chǎn)生外胚層、中胚層或內(nèi)胚層祖細(xì)胞，當(dāng)然可以利用本領(lǐng)域已知的方法制造上述細(xì)胞以進(jìn)一步分化成終末分化的細(xì)胞類型。因此，終末分化的細(xì)胞的任何應(yīng)用同樣歸因于作為它們的來源的那些外胚層、中胚層或內(nèi)胚層祖細(xì)胞 (或干細(xì)胞)。通過本文描述的方法和組合物所產(chǎn)生的IPSC、外胚層、中胚層或內(nèi)胚層祖細(xì)胞以及分化細(xì)胞可以用于治療疾病，或用來制備用于治療疾病的藥物組合物。上述疾病可以包括通過再生療法可治療的疾病，包括心力衰竭、骨髓疾病、皮膚病、燒傷、變性疾病如糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森病以及癌癥。按照本文描述的方法和組合物增殖的干細(xì)胞(以及從其衍生的分化細(xì)胞)可以用于治療，例如在需要其的個別患者中的組織再構(gòu)成或再生?？梢砸砸欢ǚ绞浇o予細(xì)胞，以致允許它們移植到所期望的組織部位并再構(gòu)成或再生功能缺乏區(qū)域。增殖的干細(xì)胞或從其衍生的分化細(xì)胞可以用于組織工程學(xué)，如用于皮膚移植物的生長。它們可以用于人造器官或組織的生物工程，或用于假體，如支架。分化細(xì)胞還可以在需要其的人患者中用于組織再構(gòu)成或再生。以這樣的方式給予細(xì)胞，即，允許它們移植到所期望的組織部位和再構(gòu)成或再生功能缺乏區(qū)域。例如，本文描述的方法和組合物可以用來調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分化。分化細(xì)胞可以用于組織工程學(xué)，如用于皮膚移植物的生長。干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)可以用于人造器官或組織的生物工程，或用于假體，如支架。在另一個實例中，根據(jù)待治療的疾病，將神經(jīng)干細(xì)胞直接移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的實質(zhì)或鞘內(nèi)部位中。利用密度為25，000-500, 000個細(xì)胞/ μ L的單細(xì)胞懸液或小聚集體來進(jìn)行移植(美國專利號5，968，829)。可以用急性損傷脊髓的大鼠模型來評估神經(jīng)細(xì)胞移植物的功效，如McDonald等人(Nat. Med. 5 :1410,1999)所描述的。成功的移植物將在2-5周以后在病變處顯示存在移植物源性細(xì)胞，分化成星形細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、和/或神經(jīng)元， 并沿著來自病變端的脊髓進(jìn)行遷移，以及在通道、協(xié)調(diào)、以及負(fù)重方面的改善。一些神經(jīng)祖細(xì)胞被設(shè)計用于治療對神經(jīng)系統(tǒng)的急性或慢性損傷。例如，興奮性中毒已涉及各種病癥，包括癲癇、卒中、缺血、亨廷頓病、帕金森病以及阿爾茨海默病。如按照本文描述的方法制造的一些分化細(xì)胞還可以適用于治療髓鞘形成障礙，如佩-梅病、多發(fā)性硬化、腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、神經(jīng)炎以及神經(jīng)病。適用于這些目的的是富集有用來促進(jìn)再髓鞘化的少突膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞前體的細(xì)胞培養(yǎng)物?？梢杂脛游锬Ｐ蛠碓u估利用我們的方法制備的肝細(xì)胞和肝細(xì)胞前體修復(fù)肝損傷的能力。一個這樣的實例是通過腹腔內(nèi)注射D-半乳糖胺引起的損傷(Dabeva et al., Am. J. Pathol. 143 :1606，1993)?？梢酝ㄟ^肝細(xì)胞標(biāo)記的免疫組織化學(xué)染色、顯微鏡測定是否小管結(jié)構(gòu)形成在生長組織中、以及治療恢復(fù)肝特異性蛋白的合成的能力，來確定治療功效。肝細(xì)胞可以通過直接給予來用于治療，或作為生物輔助裝置的一部分，當(dāng)在暴發(fā)性肝功能衰竭以后主體的肝組織再生自身的同時，上述裝置提供臨時肝功能。通過例如用SB203580 (一種特異性p38MAP激酶抑制劑)調(diào)節(jié)MAP激酶途徑通過誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化，可以制備心肌細(xì)胞，如在Graichen等人Q007)中所描述的。可以用心臟凍傷的動物模型來評估上述心肌細(xì)胞的功效，上述心臟凍傷在沒有進(jìn)行治療的情況下會引起 55%的左心室壁組織變成瘢痕組織(Li et al. ,Ann. Thorac. Surg. 62 :654,1996 ；Sakai et al. ,Ann. Thorac. Surg. 8 :2074,1999, Sakai et al. , J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 118 715，1999)。成功的治療會減少瘢痕面積，限制瘢痕擴(kuò)張，以及改善心臟功能，如通過收縮壓、舒張壓、以及擴(kuò)展壓力所確定的。還可以利用在左前降支動脈的遠(yuǎn)端部分中的栓子形成旋管來建立心臟損傷的模型(Watanabe et al. ,Cell Transplant. 7 :239，1998)，并且可以通過組織學(xué)和心臟功能來評價治療的功效。心肌細(xì)胞制劑可以用于治療以再生心肌以及治療心臟功能不足(美國專利號5，919，449和WO 99/03973)?？梢砸龑?dǎo)IPSC分化成各種細(xì)胞類型，并提供了可更新來源的置換細(xì)胞和組織治療各種疾病和病癥的可能性。這些疾病和病癥包括亨廷頓病、帕金森病、阿爾茨海默病、脊髓損傷、骨損傷(例如骨折)、卒中、燒傷、心臟病、糖尿病、骨關(guān)節(jié)炎、以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。 可以治療需要可移植組織和器官的疾病和病癥，并且尤其是在以下情況下有用的是，在移植以前破壞未分化細(xì)胞，例如防止畸胎瘤的形成。本發(fā)明提供了可以包含通過本發(fā)明的任何方法分離的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的藥物和藥物組合物。如上所述，可以提供上述藥物和藥物組合物用于醫(yī)療方法。適宜的藥物組合物可以進(jìn)一步包含藥用載體、佐劑或稀釋劑。因此，本發(fā)明還提供了包含利用本發(fā)明的方法已被處理以破壞未分化IPSC的細(xì)胞的藥物組合物和藥物。通過PODXL的細(xì)胞表面表達(dá)來鑒定和選擇未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的能力使得能夠提供這樣的組合物和藥物，其包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和基本上沒有分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，或可替換地，分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和基本上沒有未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。術(shù)語“基本上沒有”包括這樣的組合物，其中指定細(xì)胞的數(shù)目小于組合物中細(xì)胞的總數(shù)的約10%。更優(yōu)選，其小于約9%、小于約8 %、小于約7%、小于約6%、小于約5 %、小于約4%、小于約
273%、小于約2%、或小于約1%。在一些實施方式中，指定細(xì)胞可以不存在，或以足夠低的量存在，以致在檢測限度以外，即，組合物具有基本上為0%的指定細(xì)胞。通過根據(jù)本發(fā)明的方法分離的分化和未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以用于醫(yī)療方法。 醫(yī)療方法可以包括給予需要治療的個體治療有效量的所述藥物或藥物組合物。通過根據(jù)本發(fā)明的方法和技術(shù)獲得的分化和未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以用來分化成用于醫(yī)療方法的另一種細(xì)胞類型。因此，分化的細(xì)胞類型可以來源于通過所描述的方法和技術(shù)所獲得的干細(xì)胞，以及可以看作是通過所描述的方法和技術(shù)所獲得的干細(xì)胞的產(chǎn)物，其中上述干細(xì)胞已隨后被允許分化?？梢蕴峁┌鲜龇只?xì)胞的藥物組合物，可選地連同藥用載體、佐劑或稀釋劑。這樣的藥物組合物可以用于醫(yī)療方法。待治療的主體可以是任何動物或人。主體優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選人。主體可以是雄性或雌性。主體可以是患者。治療用途可以是用于人或動物(獸醫(yī)使用)?？梢耘渲聘鶕?jù)本發(fā)明的方面的藥物和藥物組合物，用于通過許多途徑來給予，包括但不限于胃腸道外途徑、靜脈內(nèi)途徑、動脈內(nèi)途徑、肌肉途徑、腫瘤內(nèi)途徑、口服以及鼻途徑?？梢耘渲扑幬锖徒M合物，用于注射。優(yōu)選以“治療有效量”給予，其足以顯示對個體的益處。給予的實際量、以及給予的速率和時程，將取決于待治療疾病的特性和嚴(yán)重性。治療處方，例如劑量確定等，在全科醫(yī)生和其它醫(yī)生的責(zé)任范圍內(nèi)，并且通常考慮到待治療的疾病、個別患者的狀態(tài)、遞送部位、給予方法以及從業(yè)者已知的其它因素。上述技術(shù)和規(guī)程的實例可以參見Remington’ s Pharmaceutical Sciences,20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams &Wilkins。配制藥用組合物和藥物根據(jù)本發(fā)明，還提供了用于生產(chǎn)藥用組合物的方法，其可以基于如此鑒定的一種或多種細(xì)胞。除了本文描述的方法的步驟之外，上述生產(chǎn)方法可以進(jìn)一步包括選自下述的一個或多個步驟(a)鑒定一種或多種未分化或分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；(b)分離和/或獲得一種或多種未分化或分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；(c)使一種或多種未分化或分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與藥用載體、佐劑或稀釋劑混合。步驟(c)優(yōu)選產(chǎn)生適用于治療用途的藥物組合物或藥物的配方/制劑。序列同一性序列同一性百分比(％ )定義為，在對比序列和引入間隙(如果有必要)(以獲得最大序列同一性)以后，在候選序列中與給定列出序列(稱作SEQ ID NO)中的殘基相同的氨基酸殘基的百分比，并且不考慮任何保守替代作為序列同一性的一部分。優(yōu)選在相應(yīng)序列的整個長度范圍內(nèi)計算序列同一性。在對比序列具有不同長度的情況下，可以相對于更長給定序列的整個長度來確定更短比較序列的序列同一性，或在比較序列比給定序列更長的情況下，可以相對于更短給定序列的整個長度來確定比較序列的序列同一性。用于確定氨基酸序列同一性百分比目的的序列對比可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方式來實現(xiàn)，例如，利用可公開獲得的計算機軟件如ClustalW 1. 82. T-coffee或 Megalign(DNASTAR)軟件。當(dāng)使用上述軟件時，優(yōu)選使用默認(rèn)參數(shù)，例如用于空位罰分和擴(kuò)展罰分。ClustalW 1.82的默認(rèn)參數(shù)是蛋白間隙開放罰分=10.0，蛋白間隙擴(kuò)展罰分=0. 2，蛋白基質(zhì)=Gonnet，蛋白 /DNA ENDGAP = -1，蛋白 /DNA GAPDIST = 4。本發(fā)明包括所描述的方面和優(yōu)選特點的組合，除非這樣的組合明顯不允許或要明確避免。本文使用的節(jié)標(biāo)題僅出于組織目的而不應(yīng)看作限制所描述的主題?，F(xiàn)將參照附圖通過實例來描述本發(fā)明的方面和實施方式。另外的方面和實施方式對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說會是顯而易見的。本文提及的所有文獻(xiàn)均結(jié)合于本文以供參考。


現(xiàn)將參照附圖來論述說明本發(fā)明原理的實施方式和實驗，在附圖中圖 1-6 示出了結(jié)合于 hESC(HES-3)、IPSC(ES4SKIN、ESIMR90)以及成纖維細(xì)胞系 (BJU IMR90)的 mAb 的分析。用不同 mAb 克隆(mAb 5、8、14、63、84、85、329、432 以及 529) 染色細(xì)胞，上述克隆是相對于在hESC上的細(xì)胞表面抗原、mAb至TRA-1-60或mAb至0ct_4 培養(yǎng)的。用FITC-共軛抗小鼠抗體來檢測結(jié)合于細(xì)胞的抗體。紅色直方圖表示用陰性對照的染色以及綠色直方圖表示用一抗的染色。圖7示出了 mAb 84對hESC、IPSC以及成纖維細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。(A)在4°C下使用5yg mAb 84(B)或沒有使用抗體(對照，Α)溫育細(xì)胞45分鐘。其后，收獲細(xì)胞用于在流式細(xì)胞儀上通過PI排除測定進(jìn)行分析。在散布圖中的門控區(qū)表示活細(xì)胞群體。圖8.細(xì)胞毒性mAb84還殺傷誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。該圖示出了根據(jù)圖7的結(jié)果總結(jié)。 在4°C下在使用5yg mAb 84(深藍(lán)色條)或沒有使用抗體(淺藍(lán)色條)溫育45分鐘以后細(xì)胞的生存力百分比。圖9.顯微照片示出了通過ES4SKIN和ESIMR90細(xì)胞表達(dá)多能標(biāo)記0ct4SSEA 4和 Tra-1-60。圖 10.表示出了各種單克隆抗體與 hESC(HES-3)、IPSC(ES4SKIN 和 ESIMR90)、包皮以及IMR90細(xì)胞的結(jié)合(由鉤號表示)。圖11. 528個氨基酸足糖萼蛋白樣蛋白1前體的氨基酸序列(SEQ IDNO 1)。圖 12.人 PODXL GenBank 登錄號 000592. 2GI :2四462740 的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。圖 13.人PODXL GenBank登錄號 AAI43319. IGI :219520307 的氨基酸序列(SEQ ID NO 3)。圖14. mAb 84的\鏈的氨基酸序列(和編碼多核苷酸序列)(SEQ IDNO 4&5)。未加下劃線的氨基酸對應(yīng)于構(gòu)架區(qū)。加下劃線的氨基酸對應(yīng)于互補決定區(qū)(CDR)。圖15. mAb 84的Vh鏈的氨基酸序列(和編碼多核苷酸序列)(SEQ IDNO 6&7)。未加下劃線的氨基酸對應(yīng)于構(gòu)架區(qū)。加下劃線的氨基酸對應(yīng)于CDR。圖16.兩種PODXL變體的氨基酸序列(SEQ ID NO 8&9)。
具體實施例方式在下面所附的描述中通過實施例陳述了本發(fā)明的一個或多個實施方式的細(xì)節(jié)，包括本發(fā)明人設(shè)想的用于實施本發(fā)明的最佳方式的具體細(xì)節(jié)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯而易見的是，可以實施本發(fā)明而不限于這些具體細(xì)節(jié)。
像hESC —樣，分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的未來的治療應(yīng)用具有通過污染殘余IPSC的畸胎瘤形成的危險。盡管存在該問題，但目前并沒有開發(fā)許多策略來分開這些細(xì)胞群體。 mAb是特異性地靶向抗原上的單表位的抗體的同源群體。因此，本申請的HlAb可以潛在地用來純化或消除呈現(xiàn)抗原庫的活細(xì)胞的子集，其中上述抗原庫表征分化成具體譜系的一種或多種未分化細(xì)胞。mAb 84可以在分化以后和在動物移植試驗以前用來消除殘余誘導(dǎo)多能干細(xì)胞以測試它們的分化細(xì)胞的功能。mAb 84 (連同其它mAb—起，如在WO 2007/102787中所描述的)可以在移植以前潛在地用來消除殘余hESC或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，從而在再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中增加移植的成功和安全。實施例1材料與方法細(xì)胞培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞系HES-3獲自ES Cell hternational。在37°C/5% CO2下在人工基膜涂覆的器官培養(yǎng)皿上培養(yǎng)細(xì)胞，其中上述培養(yǎng)皿補充有來自小鼠飼養(yǎng)物的受調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，Δ E-MEF (無飼養(yǎng)物的培養(yǎng)物)。用于培養(yǎng)hESC的培養(yǎng)基是KNOCKOUT (KO)培養(yǎng)基。 如先前所述4，對于無飼養(yǎng)物的培養(yǎng)物，在酶處理以后，對hESC進(jìn)行傳代。人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系，ES4SKIN和 ESIMR90，獲自 University of Wisconsin 并如先前所述4進(jìn)行培養(yǎng)。人包皮成纖維細(xì)胞系，BJl (CRL-2522)，以及肺成纖維細(xì)胞系， IMR90(CCL-186)，購買自American Type Culture Collection并按照供應(yīng)商的說明進(jìn)行培養(yǎng)。流式細(xì)胞術(shù)分析利用胰蛋白酶，細(xì)胞被收獲為單細(xì)胞懸液，以2X IO5個細(xì)胞/10 μ 1體積再懸浮在 1 % BSA/PBS中，然后用每種mAb克隆(5-10 μ g純化的mAb，在200 μ 1 1% BSA/PBS中)或 TRA-l-60(2. 5μ g，在 200μ 1 1 % BSA/PBS 中，Chemicon，ΜΑΒ4360/4381)溫育 45 分鐘。然后用冷BSA/PBS洗滌細(xì)胞，并進(jìn)一步用1 500稀釋度的山羊α-小鼠抗體(FITC共軛的)(DAKO)溫育15分鐘。在溫育以后，再次洗滌細(xì)胞并再懸浮在BSA/PBS和1. 25mg/ ml 碘化丙啶(PI)中，用于在 FAC^can (Becton Dickinson FACS Calibur)上進(jìn)行分析。除非另外指出，在4°C下進(jìn)行所有溫育。作為陰性對照，用適當(dāng)?shù)耐蛯φ諏?xì)胞進(jìn)行染色。對于Oct-4染色，對單細(xì)胞懸液進(jìn)行固定，透化處理(Caltag Laboratories)，并且用1 20稀釋度的相對于Oct-4 (Santa Cruz, sc-5279)的小鼠mAb溫育。然后用 BSA/PBS洗滌細(xì)胞，并進(jìn)一步用1 500稀釋度的山羊α-小鼠抗體(FITC共軛的)(DAKO) 溫育15分鐘。在溫育以后，再次洗滌細(xì)胞并再懸浮在BSA/PBS中供分析。在室溫下進(jìn)行所有溫育15分鐘。作為陰性對照，用適當(dāng)?shù)耐蛯φ諏?xì)胞進(jìn)行染色。細(xì)胞毒性測定利用PI排除測定和流式細(xì)胞術(shù)來評價mAb 84對細(xì)胞的細(xì)胞毒性。如上所述，用 mAb 84(5μ g純化的mAb，在200μ 1 1 % BSA/PBS中)溫育以2X IO5個細(xì)胞/10 μ 1體積的在 1% BSA/PBS中的單細(xì)胞懸液45分鐘。其后，洗滌細(xì)胞并再懸浮在BSA/PBS和1. 25mg/ ml碘化丙啶(PI)中，用于通過FACS進(jìn)行分析。作為陰性對照，在沒有一抗的情況下，溫育細(xì)胞。除非另外指出，在4°C下進(jìn)行所有溫育。結(jié)果mAb與hESC、IPSC以及成纖維細(xì)胞系的反應(yīng)性在第一種情況下，測試所有細(xì)胞系的多能標(biāo)記Oct-4和Tra-1-60的表達(dá)(分別為圖Ia和b)。如預(yù)期的，僅hESC和IPSC表達(dá)兩種標(biāo)記，雖然在兩種成纖維細(xì)胞系中表達(dá)均被顯著下調(diào)。隨后，對相對于hESC的9種內(nèi)部的mAb的小組，篩查與5種細(xì)胞系的結(jié)合(圖 2-6)。類似于hESC，發(fā)現(xiàn)所有9種mAb結(jié)合于hESC和IPSC。因為ES4SKIN和ESIMR90重新編程自分別來自包皮和肺的原代成纖維細(xì)胞，所以在篩查中并入這些原代細(xì)胞系以鑒定僅結(jié)合于“重新編程”細(xì)胞系但不結(jié)合于親代成纖維細(xì)胞系的抗體?；诤Y查結(jié)果，7種mAb 克隆并不結(jié)合于原代成纖維細(xì)胞。然而，觀測到mAb 5和mAb 63的反應(yīng)性。此結(jié)果是與先前的利用hESC的觀測結(jié)果一致的1O此結(jié)果表明，對于這兩種mAb克隆的抗原靶的表達(dá)在所有人細(xì)胞中可以是保守的，并且尤其是，對于mAb 5來說，與hESC或IPSC相比，在終末分化的原代成纖維細(xì)胞中被上調(diào)。細(xì)胞毒性抗體mAb 84的表征為了研究是否mAb 84類似于hESC殺傷IPSC，用mAb 84溫育細(xì)胞并利用PI排除測定來評價細(xì)胞毒性。發(fā)現(xiàn)，與對照相比(圖7和8)，在用mAb 84溫育(在4°C下，45分鐘)以后，分別有2. 5,7. 6以及6. 4%的hESC、ES4SKIN以及ESIMR90細(xì)胞保持活力。與此相反，對于BJl和IMR90成纖維細(xì)胞系，生存力仍然為100%。一并考慮mAb 84的結(jié)合和細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)(圖6-9)，可以推斷mAb 84結(jié)合并殺傷hESC和IPSC兩者。mAb 84的這種細(xì)胞毒性作用相關(guān)于mAb與細(xì)胞系的結(jié)合，因為mAb 84對并不結(jié)合mAb (BJl和IMR90)的細(xì)胞并不施加細(xì)胞毒性作用。參考文獻(xiàn)1. Choo et al(2008). Selection Against Undifferentiated Human Embryonic Stem Cells By A Cytotoxic Antibody Recognizing Podocalyxin-Iike Protein—l. Stem Cells 26(6) :1454-63.2. Takahashi et al (2007)Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell 131 (5) :861-72.3. Yu et al (2007)Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science 318(5858) :1917-20.4. Choo et al(2004)Expansion of pluripotent human embryonic stem cells on human feeders. Biotechnology and. Bioengineering 88 :321-331.5. Brandenberger et al(2004)Transcriptome characterization elucidates signaling networks that control human ES cell growth an differentiation. Nature Biotechnology 22 :707-7166. Cai et al(2006)Assessing self-renewal and differentiation in human embryonic stem cell limes. Stem cells 24 :516-5307.Cai et al (2005)Development of antibodies to human embryonic stem cell antigens. BMC Dev Biol 5 :26
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權(quán)利要求
1.一種在包含一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中鑒定一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括鑒定在所述樣品中的在它們的表面上表達(dá)足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的一種或多種細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，使所述樣品與結(jié)合部分接觸，所述部分結(jié)合于 P0DXL，并且所述一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞借助于被結(jié)合于所述結(jié)合部分而被鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括分離在它們的表面上表達(dá)PODXL的一種或多種所述細(xì)胞，其中，所述方法包括(i)使所述樣品與能夠結(jié)合PODXL的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在所述樣品中在細(xì)胞表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸；以及( )使結(jié)合于所述結(jié)合部分的細(xì)胞與未結(jié)合于所述部分的細(xì)胞分離。
4.一種使未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與已經(jīng)歷或正在經(jīng)歷分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分離的方法，其中，所述未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和已經(jīng)歷或正在經(jīng)歷分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞存在于樣品中，所述方法包括(i)使所述樣品與能夠結(jié)合足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在所述樣品中在細(xì)胞表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸；以及( )使結(jié)合于所述結(jié)合部分的細(xì)胞與未結(jié)合于所述部分的細(xì)胞分離。
5.一種通過根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法獲得的分離的一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
6.一種通過根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法獲得的分離的一種或多種分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
7.—種從包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中分離一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括分離在所述樣品中的在它們的表面上表達(dá)PODXL的一種或多種所述細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，使所述樣品與結(jié)合部分接觸，所述部分結(jié)合于 P0DXL，并且所述一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞借助于被結(jié)合于所述結(jié)合部分而從所述樣品中分離。
9.一種通過根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法分離的一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
10.一種從包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和已經(jīng)歷或正在經(jīng)歷分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的混合物中富集未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括(i)使所述混合物與能夠結(jié)合足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在所述混合物中在細(xì)胞表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸；以及( )使結(jié)合于所述部分的細(xì)胞與未結(jié)合于所述部分的細(xì)胞分離，以便產(chǎn)生富集有未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的細(xì)胞群體。
11.一種從包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和已經(jīng)歷或正在經(jīng)歷分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的混合物中富集已經(jīng)歷或正在經(jīng)歷分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括(i)使所述混合物與能夠結(jié)合足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在所述混合物中在細(xì)胞表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸；以及( )使未結(jié)合于所述部分的細(xì)胞與結(jié)合于所述部分的細(xì)胞分離，以便產(chǎn)生富集有已經(jīng)歷或正在經(jīng)歷分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的細(xì)胞群體。
12.—種制備包含從未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞的組合物的方法，所述組合物基本上不包含在它們的表面上表達(dá)PODXL的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，所述方法包括(i)提供包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和從未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞的細(xì)胞群體；( )使所述群體與能夠結(jié)合足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在所述樣品中在細(xì)胞表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸；以及(iii)使未結(jié)合于所述結(jié)合部分的細(xì)胞與結(jié)合于所述部分的細(xì)胞分離。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，進(jìn)一步包括使分離的所述未結(jié)合于所述結(jié)合部分的細(xì)胞與藥用載體、佐劑或稀釋劑混合。
14.一種制備包含在它們的表面上表達(dá)PODXL的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的組合物的方法，所述組合物基本上不包含從未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞，所述方法包括(i)提供包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和從未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞的細(xì)胞群體；( )使所述群體與能夠結(jié)合足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在所述樣品中在細(xì)胞表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸；以及(iii)使結(jié)合于所述結(jié)合部分的細(xì)胞與未結(jié)合于所述部分的細(xì)胞分離。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，進(jìn)一步包括從分離的所述結(jié)合于所述結(jié)合部分的細(xì)胞中離解所述結(jié)合部分。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的方法，進(jìn)一步包括使分離的所述結(jié)合于所述結(jié)合部分的細(xì)胞與藥用載體、佐劑或稀釋劑混合。
17.一種將能夠結(jié)合PODXL的結(jié)合部分結(jié)合于未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括使包含一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品與能夠結(jié)合PODXL的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在所述樣品中在細(xì)胞表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸。
18.—種在包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中破壞一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括破壞在所述樣品中的在它們的表面上表達(dá)PODXL的一種或多種所述細(xì)胞。
19.一種從包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的樣品中除去一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括從所述樣品中除去在它們的表面上表達(dá)PODXL的一種或多種所述細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，使所述樣品與結(jié)合部分接觸，所述部分結(jié)合于 P0DXL，并且所述一種或多種未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞借助于被結(jié)合于所述結(jié)合部分而從所述樣品中除去。
21.根據(jù)權(quán)利要求2至4、8、10至17或20中任一項所述的方法，其中，所述結(jié)合部分是抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述抗體是mAb84。
23.一種包含從未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞的組合物，所述組合物基本上不包含在它們的表面上表達(dá)PODXL的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
24.一種包含未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的組合物，所述組合物基本上不包含從未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的組合物，其中，所述未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在它們的表面上表達(dá)PODXL。
26.一種治療需要細(xì)胞治療的患者的方法，所述方法包括給予所述患者根據(jù)權(quán)利要求 5、6或9中任一項所述的一種或多種細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求23至25中任一項所述的組合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求5、6或9中任一項所述的一種或多種細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求23至25 中任一項所述的組合物在制備用于治療需要細(xì)胞治療的患者的藥物中的應(yīng)用。
28.根據(jù)權(quán)利要求5、6或9中任一項所述的一種或多種細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求23至25 中任一項所述的組合物，用于治療需要細(xì)胞治療的患者。
29.一種復(fù)合物，包含在它的表面上表達(dá)足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和能夠結(jié)合PODXL的結(jié)合部分，所述結(jié)合部分結(jié)合于在所述未分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的表面上表達(dá)的PODXL。
30.一種試劑盒，包括結(jié)合PODXL的結(jié)合部分、以及檢測另一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞標(biāo)記的另外的制劑。
31.一種產(chǎn)生和鑒定誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括(i)將非多能供體細(xì)胞誘導(dǎo)成多能狀態(tài)以產(chǎn)生在它們的表面上表達(dá)PODXL的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；( )使所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與能夠結(jié)合PODXL的結(jié)合部分在允許所述部分結(jié)合于在所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的表面上表達(dá)的PODXL的條件下接觸；以及(iii)鑒定由所述結(jié)合部分結(jié)合的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明披露內(nèi)容涉及在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞表面上的足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的表達(dá)，并且特別(雖然不完全)涉及PODXL作為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的標(biāo)記的應(yīng)用。
文檔編號G01N33/53GK102216445SQ200980145802
公開日2011年10月12日 申請日期2009年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月18日
發(fā)明者徐文華, 胡家榮 申請人:新加坡科技研究局