用于產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的組合化學(xué)遺傳方法
【專利說(shuō)明】用于產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的組合化學(xué)遺傳方法
[0001] 本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2009/037429,國(guó)際申請(qǐng)日2009年3月17日，進(jìn)入中 國(guó)國(guó)家階段日期為2010年11月16日，中國(guó)申請(qǐng)?zhí)?00980117686. X，發(fā)明名稱為"用于產(chǎn) 生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的組合化學(xué)遺傳方法"的分案申請(qǐng)。
[0002] 對(duì)相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉參考
[0003] 本申請(qǐng)要求于2008年3月17日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/069, 956和于2008 年10月31日提交的61/197, 986的優(yōu)先權(quán)利益，通過(guò)參考將其結(jié)合于此。
[0004]發(fā)明背景
[0005] 干細(xì)胞通常分類為全能的或多能的。全能干細(xì)胞具有完全的分化潛力：它產(chǎn)生體 內(nèi)全部不同類型的細(xì)胞。受精卵細(xì)胞是全能干細(xì)胞的實(shí)例。多能干細(xì)胞可以在體內(nèi)產(chǎn)生源 自三個(gè)主要生殖細(xì)胞層或其胚胎的任一細(xì)胞類型。
[0006] 多能干細(xì)胞，諸如胚胎干細(xì)胞（ESCs)，快速增殖，同時(shí)保持多能性，即分化為多種 細(xì)胞類型的能力。胚胎干細(xì)胞是對(duì)于細(xì)胞移植治療有前景的供體來(lái)源。然而，人ESC還 與關(guān)于人胚胎使用的倫理問(wèn)題和異源移植后的排斥反應(yīng)有關(guān)。通過(guò)直接由患者體細(xì)胞產(chǎn) 生多能干細(xì)胞來(lái)克服這些問(wèn)題是可能的。體細(xì)胞核通過(guò)與ESCs融合獲得胚胎干樣狀態(tài)， 這提示"多能性誘導(dǎo)"因子的存在。以前的研宄近期已經(jīng)顯示，反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的將在 ESCs中高度表達(dá)的四種轉(zhuǎn)錄因子（Oct-3/4, Sox2, KLF4和c-Myc)轉(zhuǎn)染進(jìn)入小鼠成纖維 細(xì)胞導(dǎo)致誘導(dǎo)的多能干（iPS)細(xì)胞的產(chǎn)生。參見(jiàn)Takahashi，K.&Yamanaka，S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors(通過(guò)確定的因子由小鼠胚胎和成熟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo) 多能干細(xì)胞）? Cell (細(xì)胞）126,663-676(2006) ;0kita，K.，Ichisaka，T. &Yamanaka， S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells (產(chǎn)生種系 能性誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞）.Nature (自然）448, 313-317 (2007) ;Wernig，M.等 In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state (體外重編 程成纖維細(xì)胞進(jìn)入多能ES-細(xì)胞樣狀態(tài)）.Nature (自然）448, 318-324 (2007) Waherali， N.等 Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution(直接重編程的成纖維細(xì)胞顯示整體外遺傳重建和普 遍的組織貢獻(xiàn)）.Cell Stem Cell (細(xì)胞干細(xì)胞）1，55-70 (2007) ;Meissner，A.，Wernig， M. &Jaenisch? R. Direct reprogramming of genetically unmodified fibroblasts into pluripotent stem cells (將未遺傳修飾的成纖維細(xì)胞直接重編程為多能干細(xì)胞）.Nature Biotechnol(自然生物技術(shù)）25,1177-1181 (2007) ;Takahashi，K?等 Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors (通過(guò)石角 定的因子由成熟的人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）.Cell (細(xì)胞）131,861-872(2007) ;Yu， J.等，Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells (源 自人體細(xì)胞的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞系）.Science(科學(xué)）318,1917-1920(2007) ;Nakagawa， M.等 Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts (在無(wú)Myc的條件下由小鼠和人成纖維細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì) 胞）Nature Biotechnol(自然生物技術(shù)）26,101-106 (2007);Wernig，M.，Meissner，A.，Cassady,J. P. &Jaenisch,R. c~Myc is dispensable for direct reprogramming of mouse fibroblasts (c-Myc對(duì)于小鼠成纖維細(xì)胞直接重編程不是必要的）.Cell Stem Cell(細(xì)胞 干細(xì)胞）2,10-12 (2008)。iPS細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、增殖、和多能性方面類似于ESCs，這通過(guò)畸胎 瘤形成和嵌合體貢獻(xiàn)來(lái)判斷。
[0007] 近期在將小鼠和人體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)的多能干（iPS)細(xì)胞中使用確定的遺傳 操作，即在小鼠或人胚胎干（ES)細(xì)胞中高度和/或特異性表達(dá)的少數(shù)基因的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的突 破已經(jīng)揭示了大量在無(wú)常規(guī)人ES細(xì)胞相關(guān)爭(zhēng)議的條件下產(chǎn)生用于不同應(yīng)用（例如，基于 細(xì)胞的治療或藥物發(fā)現(xiàn)）的患者特異性干細(xì)胞，以及研宄外遺傳反轉(zhuǎn)過(guò)程的機(jī)會(huì)。iPS-細(xì) 胞方法的最終臨床應(yīng)用應(yīng)該在很大程度上需要定向分化人PS細(xì)胞以產(chǎn)生譜系特異性細(xì)胞 類型的同源群體以及消除與當(dāng)前遺傳操作的iPS-細(xì)胞缺陷和低效率/慢動(dòng)力學(xué)相關(guān)的風(fēng) 險(xiǎn)。近期的研宄已經(jīng)顯示以前需要的四種基因之一，cMyc，對(duì)于在產(chǎn)生iPS細(xì)胞中過(guò)表達(dá) 不是必須的° 參見(jiàn)，Nakagawa，M.等，Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts (在無(wú) Myc 條件下由小鼠和人成纖維 細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞）Nature Biotechnol(自然生物技術(shù)）26，101-106(2007); ffernig, M. , Meissner, A. ,Cassady,J. P. &Jaenisch,R. c~Myc is dispensable for direct reprogramming of mouse fibroblasts (c_Myc對(duì)于小鼠成纖維細(xì)胞直接重編程不是必要 的）.Cell Stem Cell (細(xì)胞干細(xì)胞）2,10-12 (2008)。然而，在缺乏cMyc條件下，重編程效 率隨著也慢得多的重編程動(dòng)力學(xué)而充分減小。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明提供用于篩選誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞重編程或去分化成為多能干細(xì)胞的試劑 的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括：
[0010] a)將Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的至少一種，但非全部引入非多 能細(xì)胞中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；
[0011] b)使所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與不同試劑文庫(kù)相接觸；
[0012] C)針對(duì)多能干細(xì)胞特征篩選所接觸的細(xì)胞；和
[0013] d)使干細(xì)胞特征的形成與來(lái)自所述文庫(kù)的特定試劑相關(guān)聯(lián)，由此鑒定刺激細(xì)胞去 分化成為多能干細(xì)胞的試劑。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，步驟a)包括將一個(gè)或多個(gè)用于表達(dá)Oct多肽、Klf多肽、Myc 多肽、和Sox多肽中的至少一種，但非全部的表達(dá)盒引入所述非多能細(xì)胞。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，步驟a)包括將外源Oct多肽、外源Klf?多肽、外源Myc多肽、 和外源Sox多肽中的至少一種，但非全部引入所述非多能細(xì)胞。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，所述特定試劑在50-1500道爾頓之間。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，步驟a)包括將兩個(gè)表達(dá)盒引入所述細(xì)胞，其中每個(gè)表達(dá)盒包 括編碼不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多 肽組成的組，且不將所述組的其余成員引入所述細(xì)胞內(nèi)。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，步驟a)包括將三個(gè)表達(dá)盒引入所述細(xì)胞，其中每個(gè)表達(dá)盒包 括編碼不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多 肽組成的組，且不將所述組的其余成員引入所述細(xì)胞內(nèi)。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是非人哺乳 動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述非多能細(xì)胞是祖細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述祖細(xì)胞 是神經(jīng)祖細(xì)胞、皮膚祖細(xì)胞或毛囊祖細(xì)胞。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，所述Oct多肽是0ct4,所述Klf多肽是Klf 4,所述Myc多肽 是c-Myc，且所述Sox多肽是Sox2。
[0021] 本發(fā)明還提供篩選具有多能干細(xì)胞特征的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施方案 中，所述方法包括：
[0022] a)使細(xì)胞與MAPK/ERK激酶（MEK)抑制劑相接觸，從而抑制非多能細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn) 多能干細(xì)胞生長(zhǎng)；和
[0023] b)針對(duì)多能干細(xì)胞特征篩選所接觸的細(xì)胞。
[0024] 在一些實(shí)施方案中，所述方法包括：
[0025] 在步驟a)之前，使所述細(xì)胞與試劑文庫(kù)相接觸；
[0026] 和，在步驟b)之后，基于步驟b)的結(jié)果篩選誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的試劑。
[0027] 在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是小鼠、狗、 牛、豬、大鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞。
[0028] 在一些實(shí)施方案中，所述MEK抑制劑是ro〇325901。
[0029] 本發(fā)明還提供用由哺乳動(dòng)物非多能細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法。在一些實(shí) 施方案中，所述方法包括：
[0030] a)將Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的一種或多種引入至所述非多 能細(xì)胞中；
[0031] b)使所述細(xì)胞與抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑相接觸，由此生成 誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
[0032] 在一些實(shí)施方案中，步驟a)包括使所述非多能細(xì)胞與一種或多種選自Klf多肽、 Oct多肽、Myc多肽、和Sox多肽的外源多肽相接觸。在一些實(shí)施方案中，步驟a)包括以下 的至少兩個(gè)（例如，2, 3,4, 5,或更多個(gè)）循環(huán)：
[0033] i.使所述非多能細(xì)胞與一種或多種選自Klf多肽、Oct多肽、Myc多肽、和Sox多 肽的外源多肽相接觸；
[0034]ii.隨后在缺乏所述外源多肽的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
[0035] 在一些實(shí)施方案中，步驟a)包括將用于表達(dá)Klf多肽、Oct多肽、Myc多肽、和Sox 多肽的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒引入至所述非多能細(xì)胞中。
[0036] 在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括針對(duì)多能干細(xì)胞特征篩選相接觸的細(xì)胞。
[0037] 在一些實(shí)施方案中，將用于表達(dá)Oct多肽的表達(dá)盒和用于表達(dá)Sox多肽的表達(dá)盒 引入至所述非多能細(xì)胞中。
[0038] 在一些實(shí)施方案中，所述引入步驟包括向所述非多能細(xì)胞中引入一個(gè)或多個(gè)用于 表達(dá)KLF多肽和Oct多肽的表達(dá)盒，其中用于Myc多肽和/或Sox多肽的表達(dá)盒不引入至 所述細(xì)胞中。
[0039] 在一些實(shí)施方案中，所述Klf多肽是Klf4且所述Oct多肽是0ct4。
[0040] 在一些實(shí)施方案中，所述非多能細(xì)胞是體細(xì)胞。
[0041] 在一些實(shí)施方案中，所述非多能細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
[0042] 在一些實(shí)施方案中，用于表達(dá)Myc多肽的表達(dá)盒或用于表達(dá)Klf多肽的表達(dá)盒均 不引入所述非多能細(xì)胞。
[0043] 在一些實(shí)施方案中，所述引入步驟在體內(nèi)進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述引入步驟 在體外進(jìn)行。
[0044] 在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括，
[0045] c)選擇表現(xiàn)出多能干細(xì)胞特征的細(xì)胞。
[0046] 在一些實(shí)施方案中，所述非多能細(xì)胞獲自動(dòng)物；且所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞分化為 所需的細(xì)胞類型。
[0047] 在一些實(shí)施方案中，將所述所需的細(xì)胞類型引入至動(dòng)物中。在一些實(shí)施方案中，所 述動(dòng)物是人。在一些實(shí)施方案中，所述動(dòng)物是非人動(dòng)物。
[0048] 在一些實(shí)施方案中，所選擇的細(xì)胞不包括用于表達(dá)0ct4的外源表達(dá)盒。
[0049] 在一些實(shí)施方案中，所述試劑抑制H3K9甲基化。在一些實(shí)施方案中，抑制H3K9甲 基化的試劑是BIX01294。
[0050] 在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是小鼠細(xì) 胞。在一些實(shí)施方案中，所述非多能細(xì)胞是祖細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述祖細(xì)胞是神經(jīng) 祖細(xì)胞。
[0051] 在一些實(shí)施方案中，所述引入步驟包括引入下述：
[0052] 第一載體，其包含與第一表達(dá)盒可操作相連的啟動(dòng)子，所述第一表達(dá)盒包括編碼 Klf4的多核苷酸；
[0053] 第二載體，其包含與第二表達(dá)盒可操作相連的啟動(dòng)子，所述第二表達(dá)盒包括編碼 Sox2的多核苷酸；和
[0054] 第三載體，其包含與第三表達(dá)盒可操作相連的啟動(dòng)子，所述第三表達(dá)盒包括編碼 c-Myc的多核苷酸。
[0055] 在一些實(shí)施方案中，所述載體是反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒（lentiviral)載體、腺 病毒載體、標(biāo)準(zhǔn)非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá)載體。
[0056] 本發(fā)明還包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞和抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑的混 合物，其中所述細(xì)胞表達(dá)Oct多肽、Klf多肽、Sox多肽、和Myc多肽中的至少一種或多種； 和/或與外源Oct多肽、外源Klf多肽、外源Sox多肽、和外源Myc多肽中的至少一種或多 種相接觸。
[0057] 在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包括第一、第二和第三重組表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒 包括與編碼Klf?多肽的多核苷酸可操作相連的啟動(dòng)子，所述第二表達(dá)盒包括與編碼Sox多 肽的多核苷酸可操作相連的啟動(dòng)子；且所述第三表達(dá)盒包括與編碼Myc多肽的多核苷酸可 操作相連的啟動(dòng)子。
[0058] 在一些實(shí)施方案中，所述試劑抑制H3K9甲基化。在一些實(shí)施方案中，抑制H3K9甲 基化的試劑是BIX01294。
[0059] 在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包括一種或多種反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病毒質(zhì)粒、腺病