通過閱讀整個本申請將清楚本發(fā)明的其他實施方案。
[0350] 附圖簡述
[0351] 圖1.通過0ct4/Klf4病毒轉(zhuǎn)導和BIX01294處理由確定的原代神經(jīng)祖細胞 (primary neural progenitor cells)產(chǎn)生 iPS 細胞。在有或無 BIX01294 處理的條件下， 通過 0ct4/Klf4/Sox2/c_Myc，0ct4/Klf4/Sox2,或 0ct4/Klf4 的反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導由 3. 5xl04 個原代0G2神經(jīng)祖細胞產(chǎn)生的GFP+iPS細胞集落數(shù)量的比較。
[0352] 圖2.通過Klf4/Sox2/c_Myc病毒轉(zhuǎn)導和BIX01294處理由原代神經(jīng)祖細胞產(chǎn)生 iPS細胞。在有或無BIX01294處理的條件下，通過Klf4/Sox2/c-Myc的反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導由 3. 5xl04個原代OG2神經(jīng)祖細胞產(chǎn)生的GFP+iPS細胞集落數(shù)量。
[0353] 圖3.由原代OG2MEFs產(chǎn)生OK2B iPSCs。柱形圖表示在3個獨立實驗中由OG2-MEFs 誘導的平均GFP+集落數(shù)量。該圖顯示關(guān)于用四種因子轉(zhuǎn)導（Oct4，Klf4，Sox2,和cMyc ;4F); 用OK轉(zhuǎn)導（OK);用OK轉(zhuǎn)導并用1 yM處理BIX(OK+BIX);用OK轉(zhuǎn)導并用1 yM BIX+2yM BayK處理（OK+BIX+BayK);用 OK 轉(zhuǎn)導并用 lyM BIX+0.04yM RG108 處理（0K+BIX+RG108) 的0G2MEF細胞的數(shù)據(jù)，n = 3,誤差條表示使用Excel計算的標準偏差。
[0354] 圖4. 0K2B iPSC具有與mESCs之一類似的轉(zhuǎn)錄特征。（A)0K2B iPSCs的RT-PCR分 析說明它們表達特異于多能mESCs的基因。RlmESCs用作陽性對照，而0G2MEFS用作陰性對 照。GAPDH用作加樣對照。（B)亞磷酸氫鹽測序法揭示0K2B iPSCs的nanog啟動子去甲基 化，進一步提示特異于mESCs的內(nèi)源基因的再活化。示意性描述為進行該分析擴增的Nanog 啟動子區(qū)域中存在的胞嘧啶?？招膱A表示去甲基化的胞嘧啶，而實心圓/黑色圓表示甲基 化的胞嘧啶。
[0355] 圖5.用BIX、BayK或二者的組合處理不增加mES細胞的增殖。散點圖表示用 DMS0(對照），2yM BayK，lyM BIX和二者的組合（BayK+BIX)處理后的RlmES細胞數(shù)。n =3。誤差條表示在Excel中計算的標準偏差。如在Excel中利用t檢驗計算的，對于各種 處理均沒有獲得與DMS0相比的顯著差異。
[0356] 圖6.化合物處理后關(guān)于Sox2表達的RT-PCR分析。OG2+/7R〇SA26+a (0G2)MEFs用 DMS0 (對照），1 y M BIX，2 y M BayK和二者的組合處理6天。然后利用Qiagen RNAeasy小 型試劑盒提取RNA。通過半定量PCR評估Sox2表達。0K2B iPSCs p37和R1用作陽性對照， GAPDH作為加樣對照。
[0357] 定義
[0358] "Oct多肽"意指Octomer轉(zhuǎn)錄因子家族的任一天然存在成員，或其保留與最接近 的相關(guān)天然存在家族成員相比類似的轉(zhuǎn)錄因子活性（在至少50 %，80 %，或90 %活性之內(nèi)） 的變體，或至少包括天然存在家族成員的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和任選包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的 多肽。示范性O(shè)ct多肽包括，例如，0ct3/4(本文中稱為"0ct4")，其包含P0U結(jié)構(gòu)域。參 見 Ryan，A.K. &Rosenfeld，M.G. Genes Dev?(基因發(fā)育）11，1207-1225 (1997)。在一些實施 方案中，與天然存在Oct多肽家族成員諸如與以上列出的那些相比，變體在其整個序列上 具有至少90%的氨基酸序列同一性。
[0359] "Klf多肽"意指Krilppel樣因子（Klfs)家族的任一天然存在成員，含有與果 幡（Drosophila)胚胎模式調(diào)控子KrUppel類似的氨基酸序列的鋅指蛋白，或保留與最接 近相關(guān)的天然存在家族成員相比類似的轉(zhuǎn)錄因子活性（在至少50%，80%，或90%活性 之內(nèi)）的變體，或至少包括天然存在家族成員的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和任選包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié) 構(gòu)域的多肽。參見，Dang，D.T.，Pevsner，J.&Yang，V.W.. Cell Biol.(細胞生物學）32， 1103-1121(2000)。示范性Klf家族成員包括，例如，Klf l、Klf4、和Klf5,其中每種均顯示 能夠彼此替換，以產(chǎn)生iPS細胞。參見，Nakagawa，等，Nature Biotechnology (自然生物技 術(shù)）26 :101-106 (2007)。在一些實施方案中，與天然存在Klf多肽家族成員諸如與以上列 出的那些相比，變體在其整個序列上具有至少90%的氨基酸序列同一性。就本文中描述的 KLF多肽而言，其可以用Essrb替換。因此，意圖是對于本文中所述的各種Klf多肽實施方 案同等地描述Essrb替代Klf4多肽的應(yīng)用。
[0360] "Myc多肽"意指Myc家族的任一天然存在成員（參見，例如Adhikary，S. &Eilers， M. Nat. Rev. Mol Cell Biol.(自然分子細胞生物學綜述）6:635-645 (2005))，或其保留與最 接近相關(guān)的天然存在家族成員相比類似的轉(zhuǎn)錄因子活性（在至少50 %，80 %，或90 %活性 之內(nèi)）的變體，或至少包括天然存在家族成員的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和任選包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu) 域的多肽。示范性Myc多肽包括，例如，c-My C，N-Myc和L-Myc。在一些實施方案中，與天然 存在Myc多肽家族成員諸如與以上列出的那些相比，變體在其整個序列上具有至少90 %的 氨基酸序列同一性。
[0361] "Sox多肽"意指SRY-相關(guān)的HMG_b〇X(S 〇X)轉(zhuǎn)錄因子的任一天然存在成員，其特 征在于存在高運動基團（high-mobility group) (HMG)結(jié)構(gòu)域，或其保留與最接近相關(guān)的天 然存在家族成員相比類似的轉(zhuǎn)錄因子活性（在至少50%，80%，或90%活性之內(nèi)）的變體， 或至少包括天然存在家族成員的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和任選包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的多肽。參 見，例如，Dang，D. T.，等Int. J.Biochem. Cell Biol.(國際生物化學細胞生物學雜志）32 : 1103-1121(2000)。示范性 Sox 多肽包括，例如，Soxl，Sox2, Sox3, Soxl5,或 Soxl8,其中每 種均顯示能夠彼此替換，以產(chǎn)生iPS細胞。參見，Nakagawa，等，Nature Biotechnology (自 然生物技術(shù)）26 :101-106 (2007)。在一些實施方案中，與天然存在Sox多肽家族成員諸如 與以上列出的那些相比，變體在其整個序列上具有至少90%的氨基酸序列同一性。
[0362] "H3K9"指組蛋白H3賴氨酸9。H3K9可以在K9處去甲基化（di-methylated)。參 見，例如，Kubicek，等，Mol. Cell (分子細胞）473-481 (2007)。
[0363] 術(shù)語"多能"或"多能性"意指具有產(chǎn)生這樣的后代的能力的細胞，所述后代能夠 在適當條件下經(jīng)歷分化成為共同展示與來自全部三胚層（內(nèi)胚層、中胚層和外胚層）的細 胞譜系相關(guān)的特征的細胞類型。多能干細胞可以形成出生前、出生后或成年動物的許多或 全部組織。標準的本領(lǐng)域公認測試，諸如在8-12周齡SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，可以 用于確定細胞群的多能性，然而，不同多能干細胞特征的鑒定也可以用于檢測多能細胞。
[0364] "多能干細胞特征"意指將多能干細胞與其他細胞相區(qū)別的細胞特征。產(chǎn)生能夠 在適當條件下經(jīng)歷分化成為共同展示與來自全部三胚層（內(nèi)胚層、中胚層和外胚層）的細 胞譜系相關(guān)的特征的細胞類型的后代的能力是多能干細胞特征。表達或不表達某些分子標 記物組合也是多能干細胞特征。例如，人多能干細胞表達至少一些，且任選地全部，來自以 下非限制性列表的標記物：SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81，TRA-2-49/6E，ALP，Sox2， 已-鈣黏著蛋白，^^-1，0(^4，1?以1，和似11(^。與多能干細胞相關(guān)的細胞形態(tài)學也是多能干 細胞特征。
[0365] 術(shù)語"文庫"，根據(jù)其在本領(lǐng)域中的一般用法，用于表示分子集合，其任選地以可以 鑒別各成員的方式來組織和/或分類。文庫可以包括，但不僅限于，組合化學藥品文庫，天 然產(chǎn)物文庫，和肽文庫。
[0366] "重組"多核苷酸是不以其天然狀態(tài)存在的多核苷酸，例如，所述多核苷酸包括 自然界中不存在的核苷酸序列，或所述多核苷酸處于除其天然存在的背景以外的背景中， 例如，與其在自然界中典型接近的核苷酸序列分開，或與其典型不接近的核苷酸序列相鄰 (或相連）。例如，問題序列可以克隆至載體中，或否則與一種或多種另外的核酸重組。
[0367] "表達盒"意指包括啟動子或與編碼蛋白的序列可操作相連的其他調(diào)控序列的多 核苷酸。
[0368] 術(shù)語"啟動子"和"表達控制序列"在本文中用于意指指導核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序 列陣列。用于本文中時，啟動子包括接近轉(zhuǎn)錄起始點的必需核酸序列，諸如在聚合酶II型 啟動子的情形中，TATA元件。啟動子還任選地包括遠端增強子或抑制子元件，其可以位于 距轉(zhuǎn)錄起始點多至數(shù)千堿基對處。啟動子包括組成型和誘導型啟動子。"組成型"啟動子是 在大部分環(huán)境和發(fā)育條件下處于活性的啟動子。"誘導型"啟動子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下處 于活性的啟動子。術(shù)語"可操作相連"意指核酸表達控制序列（諸如啟動子、或轉(zhuǎn)錄因子結(jié) 合位點陣列）和第二核酸序列之間的功能性連接，其中所述表達控制序列指導對應(yīng)于所述 第二序列的核酸轉(zhuǎn)錄。
[0369] "異源序列"或"異源核酸"，用于本文中時，是來源于與特定宿主細胞異源的來源 的序列或核酸，或如果來自相同來源，則由其初始形式進行修飾。因此，細胞中的異源表達 盒不是特定宿主細胞內(nèi)源的表達盒，例如通過與來自表達載體的核酸序列而非染色體DNA 相連，與異源啟動子相連，或與報道基因相連等。
[0370] 術(shù)語"試劑"或"測試化合物"意指用于本文中所述的篩選測定中的任一化合物。 試劑可以是，例如，有機化合物（例如，小分子諸如藥物），多肽（例如，肽或抗體），核酸（例 如，DNA、RNA、雙鏈、單鏈、寡核苷酸、反義RNA、小抑制RNA、微小RNA、核糖核酸酶等），寡糖， 脂質(zhì)。通常，本發(fā)明篩選方法中使用的試劑具有小于10, 〇〇〇道爾頓，例如，小于8000,6000， 4000, 2000 道爾頓，例如，50-1500, 500-1500, 200-2000, 500-5000 道爾頓的分子量。測試化 合物可以采用測試化合物文庫的形式，諸如提供充足多樣性范圍的組合文庫或隨機文庫。 測試化合物任選地與融合配偶體，例如靶向化合物，拯救化合物，二聚化合物，穩(wěn)定化合物， 可尋址化合物（addressable compounds)，和其他功能結(jié)構(gòu)部分相連。常規(guī)地，具有有用特 性的新化學個體通過下述來產(chǎn)生：鑒定具有一些理想特性或活性，例如在某些條件下諸如 本文中所述的條件下誘導多能性的能力的測試化合物（稱為"前導化合物"），產(chǎn)生所述前 導化合物的變體，和評估那些變體化合物的特性和活性。通常，將高通量篩選（HTS)方法用 于所述分析。
[0371] 術(shù)語"核酸"和"多核苷酸"在本文中可互換地用于意指采用單鏈或雙鏈形式的脫 氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術(shù)語包括包含已知的核苷酸類似物或修飾的主 鏈殘基或連鎖的核酸，其是合成的、天然存在的、和非天然存在的，其具有與參考核酸類似 的結(jié)合特性，且其以與參考核苷酸類似的方式代謝。所述類似物的實例包括，但不僅限于， 硫代磷酸酯，磷酰胺，甲基膦酸酯（methyl phosphonates)，手性-甲基膦酸酯，2-0-甲基核 糖核酸，肽-核酸（PNAs)。
[0372]除非另外指出，特定核酸序列還包括其保守修飾變體（例如，簡并密碼子置換） 和互補序列，以及明確指出的序列。特別地，簡并密碼子置換可以通過產(chǎn)生這樣的序列來 獲得，在所述序列中，一個或多個所選（或全部）密碼子的第三個位置被混合堿基和/或 脫氧肌苷殘基取代（Batzer 等，Nucleic Acid Res?(核酸研宄）19:5081 (1991) ;0htsuka 等，J.Biol.Chem.(生物化學雜志）260 :2605-2608(1985) ;Rossolini 等，Mol.Cell-probes ( 分子細胞探針 ） 8 :91-98 (1994)) 。
[0373] 表達或活性的"抑制劑"、"活化劑"和"調(diào)節(jié)劑"分別用來指利用關(guān)于所述靶蛋白 (或編碼多核苷酸）表達或活性的體外和體內(nèi)測定所鑒定的抑制分子、活化分子或調(diào)節(jié)分 子，例如，配體、激動劑、拮抗劑、及其同系物和模擬物。術(shù)語"調(diào)節(jié)劑"包括抑制劑和活化劑。 抑制劑是，例如，抑制表達或結(jié)合，部分或全部阻斷刺激或蛋白酶抑制劑活性，降低、防止、 延遲活化，失活，去穩(wěn)定化，或下調(diào)所述靶蛋白活性的試劑，例如拮抗劑。活化劑是例如，誘 導或活化所述靶蛋白表達或結(jié)合，刺激、增加、開放、活化、促進、增強活化或蛋白酶抑制劑 活性，致敏或上調(diào)所述靶蛋白（或編碼多核苷酸）的活性，例如，激動劑。調(diào)節(jié)劑包括天然 存在的和合成的配體，詰抗劑和激動劑（例如，起激動劑或詰抗劑功能的小化學分子、抗體 等）。所述關(guān)于抑制劑和活化劑的測定包括，例如，將推定的調(diào)節(jié)劑化合物應(yīng)用到表達所述 靶蛋白的細胞，然后確定對所述靶蛋白活性的功能性作用，如上所述。將用潛在的活化劑、 抑制劑、或調(diào)節(jié)劑處理的包括所述靶蛋白的樣品或測定與無抑制劑、活化劑、或調(diào)節(jié)劑的對 照樣品進行比較，以檢驗作用程度。對照樣品（未用調(diào)節(jié)劑處理）被賦予100%的相對活 性值。當活性值相對于對照為約80 %，任選50%或25,10 %，5%或1%時，實現(xiàn)所述靶蛋 白的抑制。當活性值相對于對照為約110%，任選150%，任選200, 300%，400%，500%，或 1000-3000%或更高時，實現(xiàn)所述靶蛋白的活化。
[0374] 發(fā)明詳述
[0375] I?介紹
[0376] 本發(fā)明部分地基于意外的發(fā)現(xiàn)，即小分子可以用于模擬參與引發(fā)誘導的多能干細 胞（iPS)的轉(zhuǎn)錄因子的作用。例如，如本文中詳細描述地，0ct4可以用減少組蛋白3賴氨酸 9(H3K9)甲基化的小分子"代替"。因此，例如，BIX01294,一種特異性抑制G9a(關(guān)于H3K9 的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶）的小分子，在與其中已經(jīng)表達Klf4、c-Myc和Sox2的哺乳動物細胞 相接觸時，引起多能干細胞的誘導。
[0377] 這些結(jié)果不僅關(guān)于H3K9的甲基化作用及其參與細胞編程方面令人感興趣，而且