專利名稱：檢測(cè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)方法，具體是一種檢測(cè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 的方法。
背景技術(shù)：
量子點(diǎn)結(jié)合抗體、抗原或DNA等物質(zhì)后所構(gòu)成的結(jié)合體被稱為生物探針或熒光探 針。但是這類熒光探針僅只能對(duì)所標(biāo)記的生物分子作定性或定量分析，不具備對(duì)欲作定性 或定量分析的生物分子進(jìn)行采集或分離的功能。磁性納米粒子因其具有良好的超順磁性和 表面易功能化等特點(diǎn)而十分引人注意，它可以復(fù)合抗體、抗原或免疫球蛋白。在體內(nèi)與欲分 離的目標(biāo)物相結(jié)合，在磁場(chǎng)的作用下進(jìn)行免疫磁分離，但本身不具備標(biāo)記的功能。標(biāo)記和分 離已經(jīng)成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域中的重要工作，如果標(biāo)記和分離的工作能一步完成，必 將極大地推動(dòng)生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展。因此，集磁性能和發(fā)光性能于一身的復(fù)合型納米粒子 以其良好的應(yīng)用前景備受關(guān)注。生物芯片技術(shù)在最近十幾年發(fā)展迅速，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基 因表達(dá)、功能基因組、蛋白質(zhì)組等前沿領(lǐng)域。尤其在近幾年，所涉及的領(lǐng)域從研究型場(chǎng)合迅 速擴(kuò)展至應(yīng)用型場(chǎng)合，在臨床檢驗(yàn)、疾病診斷、藥物篩選等方面發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用。 微陣列是一種可用于生物學(xué)研究的大規(guī)模、高通量的重要分析技術(shù)。近年來(lái)，蛋白質(zhì)微陣列 技術(shù)已經(jīng)在蛋白質(zhì)組的功能研究、疾病診斷以及藥物開發(fā)中顯示出巨大的潛力。影響蛋白 質(zhì)微陣列分析性能的主要因素包括蛋白質(zhì)分子識(shí)別的特異性、蛋白質(zhì)的固定化技術(shù)以及檢 測(cè)方法等，其中蛋白質(zhì)的固定和檢測(cè)方法是開展蛋白質(zhì)微陣列研究的最基本的技術(shù)。結(jié)合 臨床上常用的酶聯(lián)免疫技術(shù)成功開發(fā)了芯片技術(shù)和ELISA技術(shù)的結(jié)晶——微陣列酶聯(lián)免疫 技術(shù)，該技術(shù)在保持了 ELISA方法學(xué)的成熟、方便、自動(dòng)化程度高的基礎(chǔ)上，又具有芯片技 術(shù)的高通量、低成本、高平行、微型化等特點(diǎn)。臨床診斷上，可同時(shí)對(duì)單個(gè)樣本進(jìn)行多種疾病 指標(biāo)的檢測(cè)；樣品用量??；靈敏度和可靠性更高；檢測(cè)成本低，自動(dòng)化程度高；利于大規(guī)模 推廣應(yīng)用。在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù)和微陣列技術(shù)的基礎(chǔ)上，終于形成新一代檢測(cè)技術(shù)體 系一微陣列酶聯(lián)免疫技術(shù)，建立了蛋白芯片技術(shù)平臺(tái)。蛋白芯片檢測(cè)技術(shù)在快速檢測(cè)、多項(xiàng) 目聯(lián)合檢測(cè)上具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，它將引領(lǐng)體外診斷試劑行業(yè)的技術(shù)革命。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS細(xì)胞)是利用載體將 不同轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入分化的體細(xì)胞中，使其重編程為類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞類型。近年 來(lái)，ips細(xì)胞成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，并且ips細(xì)胞的突破性進(jìn)展為許多疑難病的基 礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究以及臨床應(yīng)用方面帶了巨大的希望，在干細(xì)胞研究領(lǐng)域、表觀遺傳學(xué)研究以及 生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域都引起了強(qiáng)烈的反響。ips細(xì)胞的鑒定必須符合干細(xì)胞多能性的條件，具 有強(qiáng)大的自我更新能力和分化潛能，目前鑒定ips細(xì)胞的多能性手段有形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)、標(biāo)志 分子的表達(dá)、生長(zhǎng)特性、發(fā)育潛能、表觀遺傳學(xué)特征。對(duì)ips細(xì)胞確定可以通過(guò)標(biāo)志分子的 表達(dá)來(lái)進(jìn)行分析，目前現(xiàn)有的成熟手段是通過(guò)免疫熒光技術(shù)進(jìn)行表面抗原的鑒定，有直接 染色法和間接染色法(1)直接染色法是將標(biāo)記的特異熒光抗體直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng) 一定溫度和時(shí)間的染色，洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，在熒光顯微鏡下便可見到被檢抗原與熒光抗體形成的特異性結(jié)合物而發(fā)出的熒光。直接染色法的優(yōu)點(diǎn)是特異性高，操作 簡(jiǎn)便，比較快速。⑵間接染色法是先用已知未標(biāo)記的特異抗體(第一抗體)與抗原標(biāo)本進(jìn) 行反應(yīng)，作用一定時(shí)間后，洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體即抗球蛋白抗體(第二抗 體)與抗原標(biāo)本反應(yīng)，如果第一步中的抗原抗體互相發(fā)生了反應(yīng)，則抗體被固定或與熒光 素標(biāo)記的抗抗體結(jié)合，形成抗原_抗體_抗抗體復(fù)合物，再洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗抗體，在熒 光顯微鏡下可見熒光。間接染色法的優(yōu)點(diǎn)是既能檢查未知抗原，也能檢查未知抗體；用一種 標(biāo)記的抗球蛋白抗體，能與在種屬上相同的所有動(dòng)物的抗體結(jié)合，檢查各種未知抗原或抗 體，敏感性高。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)Yamanaka等在《cell》(細(xì)胞)雜志2007年 第 131 期的 861 872 頁(yè)上發(fā)表“Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult HumanFibroblasts by Defined Factors”(通過(guò)特定的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞重組為 多能干細(xì)胞的研究)，該文中提出通過(guò)免疫熒光技術(shù)對(duì)ips細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物進(jìn)行鑒 定，其不足之處在于由于參加反應(yīng)的因素較多，受干擾的可能性也較大，判定結(jié)果有時(shí)較 難，操作繁瑣，對(duì)照較多，時(shí)間長(zhǎng)；帶熒光染料的抗體成本高；有機(jī)熒光染料熒光強(qiáng)度低；短 時(shí)間內(nèi)熒光會(huì)淬滅，有機(jī)熒光染料毒性大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法。 本發(fā)明的方法可實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)單個(gè)樣本進(jìn)行多種特異性分子的檢測(cè)；樣品用量小；靈敏度和 特異性高；檢測(cè)成本低；操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高；檢測(cè)速度快。本發(fā)明涉及一種檢測(cè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，包括如下步驟步驟一，采用常規(guī)方法制備磁性納米粒子和水溶性量子點(diǎn)；步驟二，取正硅酸四乙酯(TE0S)水解生成二氧化硅微球，采用反相微乳液法制備 熒光磁性納米硅球；步驟三，表面改性熒光磁性納米硅球，之后偶聯(lián)抗體，得偶聯(lián)抗體的熒光磁性納米 硅球；步驟四，以內(nèi)參蛋白為陽(yáng)性對(duì)照，牛血清白蛋白(BSA)為陰性對(duì)照，利用抗誘導(dǎo)多 能干細(xì)胞表面表達(dá)的特異性標(biāo)記物的抗體制備微陣列芯片；步驟五，利用步驟四的微陣列芯片檢測(cè)樣品，之后用步驟三所得的偶聯(lián)抗體的熒 光磁性納米硅球?qū)ξ㈥嚵行酒M(jìn)行熒光標(biāo)記，得檢測(cè)結(jié)果。步驟一中，所述制備磁性納米粒子具體為采用共沉淀法制備，將Fe2+與Fe3+按摩爾 比為1 2混合，之后加入1. 5M的NaOH的水溶液，劇烈攪拌，氮?dú)獗Ｗo(hù)、80°C下反應(yīng)lh，磁 分離，得磁性納米粒子。步驟一中，所述水溶性量子點(diǎn)為CdTe量子點(diǎn)。所述CdTe量子點(diǎn)的制備方法具體為在Cd2+鹽的水溶液中加入巰基乙酸，用1M的 NaOH的水溶液調(diào)節(jié)pH為11，氮?dú)獗Ｗo(hù)、磁力攪拌下加入NaHTe的水溶液，100°C下回流1 24h，得CdTe量子點(diǎn)。步驟二中，所述反相微乳液法具體為將磁性納米粒子與水溶性量子點(diǎn)混合，加 入到環(huán)己烷的油相微乳溶液中，劇烈攪拌，得油包水微乳反應(yīng)體系，用體積分?jǐn)?shù)為27%的NH3*H20調(diào)節(jié)pH值為堿性，然后加入正硅酸四乙酯(TE0S)水解反應(yīng)24h，磁分離，得熒光磁 性納米粒子硅球。步驟三中，所述表面改性具體為，將熒光磁性納米粒子硅球分散在乙醇中，80°C油 浴下加入硅烷偶聯(lián)劑，攪拌反應(yīng)3h，磁分離，得到氨基化的熒光磁性納米硅球；之后將氨基 化的熒光磁性納米硅球分散在DMF溶液中，加入過(guò)量的丁二酸酐，25°C下攪拌反應(yīng)24h，磁 分離，得改性后的熒光磁性納米硅球。所述硅烷偶聯(lián)劑為氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)。步驟四中，所述制備微陣列芯片具體為將抗誘導(dǎo)多能干細(xì)胞表面表達(dá)的特異性 標(biāo)記物的抗體噴到硝酸纖維素膜上4X4微陣列結(jié)構(gòu)的檢測(cè)區(qū)，同時(shí)以內(nèi)參蛋白作為陽(yáng)性 對(duì)照區(qū)，BSA作為陰性對(duì)照，以中性蛋白封閉，干燥，然后將固化有檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)的硝酸纖 維素膜組裝在高分子吸水紙上，最后組裝在塑料外殼內(nèi)放置，即得。步驟五中，所述得檢測(cè)結(jié)果具體為先用PBST潤(rùn)濕芯片，再加入待測(cè)樣品，之后用 PBST洗滌膜，去除未連接的抗原，再加入偶聯(lián)抗體的熒光磁性納米硅球，再次用PBST洗滌 膜，置于紫外燈下觀察，如果待測(cè)樣品中含有被硝酸纖維素膜上的相應(yīng)抗體捕獲的抗原，則 會(huì)在紫外照射下可以形成肉眼可分辨的彩色檢測(cè)區(qū)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果熒光磁性納米硅球是一種復(fù)合型 納米材料，使用其熒光性能解決了傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料容易淬滅和熒光強(qiáng)度低的問題，其磁 性能可以分離純化未偶聯(lián)的抗ips細(xì)胞表面表達(dá)的特異性標(biāo)記物抗體以避免對(duì)樣本檢測(cè) 產(chǎn)生干擾；同時(shí)具有良好的生物安全性；一個(gè)待檢樣本可以在一個(gè)芯片上同時(shí)進(jìn)行4種特 異性標(biāo)記物的檢測(cè)，并且同時(shí)具備陰性和陽(yáng)性對(duì)照區(qū)域，因此可實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)單個(gè)樣本進(jìn)行 多種特異性分子的檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，快速檢測(cè)，省時(shí)省力；本檢測(cè)方法樣品用量小，檢測(cè)成本 低，能夠富集樣品中的微量待檢物，檢出率和特異性均高于傳統(tǒng)的免疫熒光技術(shù)；本發(fā)明的 檢測(cè)方法參加反應(yīng)的環(huán)節(jié)較少，受干擾的可能性也較小，因此具有高的靈敏度；微陣列芯片 制備工藝簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。


圖1為實(shí)施例1中的微陣列生物芯片結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為實(shí)施例2中的微陣列生物芯片結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前 提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的 條件。實(shí)施例1ips細(xì)胞表面表達(dá)特異性oct4，sox2, nanog，AP抗原的檢測(cè)檢測(cè)方法分析oct4，sox2, nanog, AP抗原在ips細(xì)胞中的表達(dá)，選用人的oct4， sox2, nanog, AP單克隆抗體作為檢測(cè)手段，抗BSA單抗作為陰性對(duì)照，抗beta-tubulin單 抗作為陽(yáng)性對(duì)照。
步驟一，稱取1. 35g(0. 005mol)FeCl3 6H20 和 0. 69(0. 0025mol) FeS04 7H20 溶于 50ml的去離子水中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)、80°C的環(huán)境下加入20mll. 5M的NaOH，劇烈攪拌反應(yīng)lh 后，用磁分離的方法分離出黑色沉淀，并用去離子是水洗滌3次，得磁性納米粒子，之后將 磁性納米粒子分散在20ml去離子水中形成濃度為8mg/ml溶液；步驟二，取 1. 1417g(5mmol)CdCl2 2. 5H20 溶解 110ml 水中，再加入 1. 1053g(12mmol)TGA攪拌均勻，用lMNaOH調(diào)節(jié)pH到11，再用氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入2. 5mmol新制 備的NaHTe水溶液，將此反應(yīng)體系加熱到100°C，回流4h，得到熒光發(fā)射波長(zhǎng)為570nm，濃度 為4mg/ml的表面帶有羧基的黃色CdTe水溶性量子點(diǎn)；步驟三，量取50ml的環(huán)己烷，10ml的Triton-100，8ml的正己醇，室溫下劇烈攪拌 反應(yīng)30min ；取步驟二制備的CdTe水溶性量子點(diǎn)4ml，乙醇8ml，按1 2體積比沉淀量子 點(diǎn)，然后用1ml磁性納米粒子水溶液重懸沉淀后的量子點(diǎn)，并逐滴加入到已形成微乳結(jié)構(gòu) 的油相體系中，然后再劇烈攪拌30min，加入體積分?jǐn)?shù)為27% NH3 H20150ul調(diào)節(jié)反應(yīng)體系 PH為堿性，然后加入500ul的TE0S攪拌反應(yīng)24h，通過(guò)磁分離的方法收集樣品，并分別用無(wú) 水乙醇和去離子水各洗滌3次，最后用5ml的去離子水重懸，形成水溶性的熒光磁性納米硅 球溶液，磁分離，得熒光磁性納米硅球，之后重懸于100ml乙醇溶液中，并添加2ml的APTS， 80°C的油浴中攪拌反應(yīng)3h，磁分離收集氨基功能化的熒光磁性納米硅球，再將氨基化的熒 光磁性納米硅球分散在lOOmlDMF溶液中，加入3mg 丁二酸酐室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，利用磁分 離的方法分離得到羧基化的熒光磁性納米硅球，最后用DMF洗滌3次，并重懸于3ml的無(wú)菌 PBS(pH7. 4)中待用；步驟四，取lml的羧基化的熒光磁性納米硅球加入2.5ml磷酸鹽緩沖溶液 (pH6. 0)，再加入125mg的EDC和125mgNHS反應(yīng)30min活化羧基，最后加入300ug的oct4， sox2, nanog, AP單抗避光搖勻反應(yīng)2h，然后4°C下過(guò)夜；步驟五，以pH 7.60.01!1101/1的磷酸鹽緩沖液將1 8細(xì)胞表達(dá)的特異性標(biāo)記物 (oct4，sox2, nanog, AP)相對(duì)應(yīng)的抗體稀釋為lmg/ml，如圖1所示，以Bio-Dot點(diǎn)樣儀噴到 0. 45um的硝酸纖維素膜上，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制高速每針噴射InL的抗體溶液到微陣列為4X4 結(jié)構(gòu)的硝酸纖維素膜上，同時(shí)以抗beta-tubulin抗體為陽(yáng)性對(duì)照噴在4X4微陣列結(jié)構(gòu)的 左上和右下對(duì)角方位，以抗BSA抗體為陰性對(duì)照噴在4X4微陣列結(jié)構(gòu)的右上和左下對(duì)角方 位，然后用含有10mg/ml的PBS封閉、37°C干燥，最后將硝酸纖維素膜組裝在高分子吸水紙 上并放入塑料外殼內(nèi)并放置在4°C待用；步驟六，以含0. 05% Tween20的PBS緩沖液(PBST) 100ul潤(rùn)濕微陣列芯片，待PBST 滲透入硝酸纖維素膜后，加入200ul待檢樣品，待滲透入膜內(nèi)后，加PBST洗滌3次去除未 連接抗原，再分別加入200ul的連接有oct4，sox2, nanog, AP抗體的熒光磁性納米硅球，用 PBST溶液洗滌膜三遍，然后用紫外手提燈照射微陣列芯片，測(cè)試結(jié)果可以肉眼分辨出來(lái)， 如待檢樣品中含有被硝酸纖維素膜上的抗體捕獲的oct4，sox2, nanog, AP抗原，則會(huì)在微 陣列芯片上出現(xiàn)肉眼可分辨的陽(yáng)性黃色檢測(cè)圓圈區(qū)域；而不管待檢樣品中是否含有oct4， sox2，nanog, AP抗原，beta-tubulin都將被捕獲在噴涂有抗beta-tubulin的區(qū)域形成肉 眼可見的黃色圓圈區(qū)域?yàn)殛?yáng)性對(duì)照，如芯片失效則在陽(yáng)性區(qū)域不會(huì)出現(xiàn)黃色圓圈；而陰性 對(duì)照區(qū)域無(wú)論如何都不會(huì)出現(xiàn)顯色區(qū)域。實(shí)施例2
ips細(xì)胞表面表達(dá)特異性SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81抗原的檢測(cè)檢測(cè)方法分析SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81抗原在ips細(xì)胞中的表達(dá)，選 用抗SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60, TRA-1-81的單克隆抗體作為檢測(cè)手段，抗BSA單抗作為陰 性對(duì)照，抗GAPDH單抗作為陽(yáng)性對(duì)照；步驟一，稱取1. 35g(0. 005mol)FeCl3 6H20 和 0. 69(0. 0025mol) FeS04 7H20 溶于 50ml的去離子水中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)、80°C的環(huán)境下加入20mll. 5M的NaOH，劇烈攪拌反應(yīng)lh 后，用磁分離的方法分離出黑色沉淀，并用去離子是水洗滌3次，得磁性納米粒子，最后將 磁性納米粒子分散在20ml去離子水中形成濃度為8mg/ml溶液；步驟二，1.1417g(5mmol)CdCl2 .2. 5H20 溶解 110ml 水中，再加入 1. 1053g(12mmol) TGA攪拌均勻，用mNaOH調(diào)節(jié)pH到11，再用氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入2. 5mmol新制備的NaHTe水溶 液，將此反應(yīng)體系加熱到100°C，回流4h，得到熒光發(fā)射波長(zhǎng)為570nm，濃度為4mg/ml的表面 帶有羧基的黃色CdTe水溶性量子點(diǎn)；步驟三，量取50ml的環(huán)己烷，10ml的Triton-100，8ml的正己醇，室溫下劇烈攪拌 反應(yīng)30min ；取上述步驟制備好的CdTe水溶性量子點(diǎn)4ml，乙醇8ml，按1 2體積比沉淀 量子點(diǎn)，然后用1ml磁性納米粒子水溶液重懸沉淀后的量子點(diǎn)，并逐滴的加入到已形成微 乳結(jié)構(gòu)的油相體系中，然后再劇烈攪拌30min，加入體積分?jǐn)?shù)為27% NH3 H20150ul調(diào)節(jié)反 應(yīng)體系PH為堿性，然后加入500ul的TE0S攪拌反應(yīng)24h，通過(guò)磁分離的方法收集樣品，并分 別用無(wú)水乙醇和去離子水各洗滌3次，最后用5ml的去離子水重懸，形成水溶性的熒光磁性 納米硅球溶液，磁分離，得熒光磁性納米硅球，之后重懸于100ml乙醇溶液中，并添加2ml的 APTS，在80°C的油浴中攪拌反應(yīng)3h，磁分離收集氨基功能化的熒光磁性納米硅球，再將氨 基化的熒光磁性納米硅球分散在lOOmlDMF溶液中，加入3mg 丁二酸酐室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，利 用磁分離的方法分離得到羧基化的熒光磁性納米硅球，最后用DMF洗滌3次，并重懸于3ml 的無(wú)菌PBS(pH7.4)中待用；步驟四，取1ml的羧基化的熒光磁性納米硅球溶液加入2. 5ml磷酸鹽緩沖溶液 (pH6. 0)，再加入125mg的EDC和125mgNHS反應(yīng)30min活化羧基，最后加入300ug的SSEA-3， SSEA-4，TRA-1-60, TRA-1-81單抗避光搖勻反應(yīng)2h，然后4°C下過(guò)夜；步驟五，以pH 7. 60. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液將ips細(xì)胞表達(dá)的特異性標(biāo)記 物(SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60, TRA-1-81)相對(duì)應(yīng)的抗體稀釋為lmg/ml，如圖2所示，以 Bio-Dot點(diǎn)樣儀噴到0. 45um的硝酸纖維素膜上，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制高速每針噴射InL的抗體 溶液到微陣列為4X4結(jié)構(gòu)的硝酸纖維素膜上，同時(shí)以抗GAPDH抗體為陽(yáng)性對(duì)照噴在4X4 微陣列結(jié)構(gòu)的左上和右下對(duì)角方位，以抗BSA抗體為陰性對(duì)照噴在4X4微陣列結(jié)構(gòu)的右上 和左下對(duì)角方位，然后用含有10mg/ml的PBS封閉、37°C干燥，最后將硝酸纖維素膜組裝在 高分子吸水紙上并放入塑料外殼內(nèi)并放置在4°C待用；步驟六，以含0. 05% Tween20的PBS緩沖液(PBST) 100ul潤(rùn)濕微陣列芯片，待 PBST滲透入硝酸纖維素膜后，加入200ul待檢樣品，待滲透入膜內(nèi)后，加PBST洗滌3次去 除未連接抗原，再分別加入200ul的連接有SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60, TRA-1-81抗體的熒 光磁性納米硅球，用PBST溶液洗滌膜三遍，然后用紫外手提燈照射微陣列芯片，測(cè)試結(jié)果 可以肉眼分辨出來(lái)，如待檢樣品中含有被硝酸纖維素膜上的抗體捕獲的SSEA-3，SSEA-4， TRA-1-60,TRA-1-81抗原，則會(huì)在微陣列芯片上出現(xiàn)肉眼可分辨的陽(yáng)性黃色檢測(cè)圓圈區(qū)域；而不管待檢樣品中是否含有SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60, TRA-1-81抗原，GAPDH蛋白都將被 捕獲在噴涂有抗GAPDH抗體的區(qū)域形成肉眼可見的黃色圓圈區(qū)域?yàn)殛?yáng)性對(duì)照，如芯片失效 則在陽(yáng)性區(qū)域不會(huì)出現(xiàn)黃色圓圈；而陰性對(duì)照區(qū)域無(wú)論如何都不會(huì)出現(xiàn)顯色區(qū)域。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，制備磁性納米粒子和水溶性量子點(diǎn)；步驟二，取正硅酸四乙酯水解生成二氧化硅微球，采用反相微乳液法制備熒光磁性納米硅球；步驟三，表面改性熒光磁性納米硅球，之后偶聯(lián)抗體，得偶聯(lián)抗體的熒光磁性納米硅球；步驟四，以內(nèi)參蛋白為陽(yáng)性對(duì)照，牛血清白蛋白為陰性對(duì)照，利用抗誘導(dǎo)多能干細(xì)胞表面表達(dá)的特異性標(biāo)記物的抗體制備微陣列芯片；步驟五，利用步驟四的微陣列芯片檢測(cè)樣品，之后用步驟三所得的偶聯(lián)抗體的熒光磁性納米硅球?qū)ξ㈥嚵行酒M(jìn)行熒光標(biāo)記，得檢測(cè)結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征是，步驟一中，所述制備 磁性納米粒子具體為采用共沉淀法制備，將Fe2+與Fe3+按摩爾比為1 2混合，之后加入 1. 5M的NaOH的水溶液，攪拌，氮?dú)獗Ｗo(hù)、80°C下反應(yīng)lh，磁分離，得磁性納米粒子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征是，步驟一中，所述水溶 性量子點(diǎn)為CdTe量子點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征是，所述CdTe量子點(diǎn)的 制備方法具體為在Cd2+鹽的水溶液中加入巰基乙酸，用1M的NaOH的水溶液調(diào)節(jié)pH為11， 氮?dú)獗Ｗo(hù)、磁力攪拌下加入NaHTe的水溶液，100°C下回流1 24h，得CdTe量子點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征是，步驟二中，所述反相 微乳液法具體為將磁性納米粒子與水溶性量子點(diǎn)混合，加入到環(huán)己烷的油相微乳溶液中， 劇烈攪拌，得油包水微乳反應(yīng)體系，用體積分?jǐn)?shù)為27%的NH3 H20調(diào)節(jié)pH值為堿性，然后 加入正硅酸四乙酯水解反應(yīng)24h，磁分離，得熒光磁性納米硅球。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征是，步驟三中，所述表 面改性具體為，將熒光磁性納米硅球分散在乙醇中，80°C油浴下加入硅烷偶聯(lián)劑，攪拌反應(yīng) 3h，磁分離，得到氨基化的熒光磁性納米硅球；之后將氨基化的熒光磁性納米硅球分散在 DMF溶液中，加入過(guò)量的丁二酸酐，25°C下攪拌反應(yīng)24h，磁分離，得改性后的熒光磁性納米 硅球。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征是，所述硅烷偶聯(lián)劑為 氨丙基三乙氧基硅烷。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征是，步驟四中，所述制備 微陣列芯片具體為將抗誘導(dǎo)多能干細(xì)胞表面表達(dá)的特異性標(biāo)記物的抗體噴到硝酸纖維素 膜上4 X 4微陣列結(jié)構(gòu)的檢測(cè)區(qū)，同時(shí)以內(nèi)參蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照區(qū)，BSA作為陰性對(duì)照，以中 性蛋白封閉，干燥，然后將固化有檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)的硝酸纖維素膜組裝在高分子吸水紙上， 最后組裝在塑料外殼內(nèi)放置，即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征是，步驟五中，所述得檢 測(cè)結(jié)果具體為先用PBST潤(rùn)濕芯片，再加入待測(cè)樣品，之后用PBST洗滌膜，去除未連接的抗 原，再加入偶聯(lián)抗體的熒光磁性納米硅球，再次用PBST洗滌膜，置于紫外燈下觀察，如果待 測(cè)樣品中含有被硝酸纖維素膜上的相應(yīng)抗體捕獲的抗原，則會(huì)在紫外照射下可以形成肉眼 可分辨的彩色檢測(cè)區(qū)。
全文摘要
一種檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，包括如下步驟制備磁性納米粒子和水溶性量子點(diǎn)；取正硅酸四乙酯水解生成二氧化硅微球，采用反相微乳液法制備熒光磁性納米硅球；表面改性熒光磁性納米硅球，之后偶聯(lián)抗體，得偶聯(lián)抗體的熒光磁性納米硅球；以內(nèi)參蛋白為陽(yáng)性對(duì)照，牛血清白蛋白為陰性對(duì)照，利用抗誘導(dǎo)多能干細(xì)胞表面表達(dá)的特異性標(biāo)記物的抗體制備微陣列芯片；利用微陣列芯片檢測(cè)樣品，之后用偶聯(lián)抗體的熒光磁性納米硅球?qū)ξ㈥嚵行酒M(jìn)行熒光標(biāo)記，得檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明的方法可實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)單個(gè)樣本進(jìn)行多種特異性分子的檢測(cè)；樣品用量??；靈敏度和特異性高；檢測(cè)成本低；操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高；檢測(cè)速度快。
文檔編號(hào)G01N33/533GK101799416SQ20101012088
公開日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2010年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月10日
發(fā)明者吉佳佳, 崔大祥, 賀蓉, 阮靜 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)