類孢子細(xì)胞子群及其用圖
【專利說明】類孢子細(xì)胞子群及其用途
[0001 ] 本申請(qǐng)是國際申請(qǐng)日為2010年11月11日，進(jìn)入中國國家階段的申請(qǐng)?zhí)枮?01080059186.8(國際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2010/056340)，發(fā)明名稱為“類孢子細(xì)胞子群及其用途”的PCT國際申請(qǐng)進(jìn)入中國國家階段的案件的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及類孢子細(xì)胞子群的鑒別、分離和使用。
【背景技術(shù)】
[0003]多能細(xì)胞的使用已經(jīng)在醫(yī)藥研宄領(lǐng)域，尤其是提供用于治療因遺傳缺陷、損傷和/或疾病過程引起的組織損傷的試劑領(lǐng)域引起人們的關(guān)注。理想情況是，可將能夠分化成受影響細(xì)胞類型的細(xì)胞移植到有需要的個(gè)體中，在個(gè)體體內(nèi)，這些細(xì)胞將與器官微環(huán)境相互作用，并提供必要的細(xì)胞類型來修復(fù)損傷。胚胎干(Embryonic stem，ES)細(xì)胞是來源于胚泡的多能細(xì)胞，其可在體外以未分化狀態(tài)無限增殖，可在體內(nèi)分化成所有細(xì)胞譜系，并且可在體外經(jīng)過誘導(dǎo)而分化成大多數(shù)細(xì)胞類型(馬丁(Martin)，美國國家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad Sci USA.), 78:7634-7638 (1981)) ο 盡管已經(jīng)從人類中分離出 ES 細(xì)胞，但其在研宄以及治療學(xué)中的應(yīng)用因倫理方面的約因而受到阻礙(弗蘭克(Frankel)，科學(xué)(Science).287:1397(2000))ο
[0004]已經(jīng)不斷地嘗試從包括造血細(xì)胞(美國專利第5，750，397號(hào))、神經(jīng)細(xì)胞(蓋吉(Gage),科學(xué)，287:1433-1438(2000))、胃腸細(xì)胞(普騰(Potten),倫敦皇家學(xué)會(huì)哲學(xué)匯刊 B 輯:生物科學(xué)(Philos Trans R Soc Lond B B1l Sc1.) 353:821-830 (1998))、表皮細(xì)胞(瓦特(Watt)，倫敦皇家學(xué)會(huì)哲學(xué)匯刊B輯:生物科學(xué)，353:831-837(1998))和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)(美國專利第5，736, 396號(hào))在內(nèi)的非胚胎組織分離干細(xì)胞。也已經(jīng)從骨髓中純化出另一細(xì)胞群，即專能成體祖細(xì)胞(multipotent adult progenitor cell，MAPC)(雷耶斯(Reyes)等人，血液學(xué)(Blood), 98 (9):2615-2625 (2001);雷耶斯和維特法雷(Vetfaillie),紐約科學(xué)院年報(bào)(Ann NY Acad Sci)，938:231-235 (2001))。這些細(xì)胞能夠在體外擴(kuò)增以實(shí)現(xiàn)超過100代群體倍增，同時(shí)無端?？s短或不會(huì)發(fā)生核型異常。經(jīng)顯示，MAPC也能在指定培養(yǎng)條件下分化成各種間充質(zhì)細(xì)胞類型(例如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和骨骼肌成肌細(xì)胞)、內(nèi)皮、神經(jīng)外胚層細(xì)胞，且更近來顯示其分化成肝細(xì)胞(斯查沃茲(Schwartz)等人，臨床研宄(Clin Invest),109:1291-1302(2000))。
[0005]使用ES細(xì)胞或其它多能細(xì)胞用于個(gè)體的再生療法的一個(gè)問題是控制這些細(xì)胞的生長(zhǎng)和這些細(xì)胞成為個(gè)體治療所需的特定細(xì)胞類型的分化。如斯查丁納(Schuldiner)等人，美國國家科學(xué)院院刊，97:11307-11312(2000)中所揭露，其中所用八種生長(zhǎng)因子都不能僅定向分化成一種細(xì)胞類型。因此，仍需要用于產(chǎn)生適于多種應(yīng)用(包括治療各種器官和/或組織的損傷和/或疾病)的可移植專能和多能細(xì)胞群的新方法。此外，專能或多能細(xì)胞的來源因這些細(xì)胞必須從活體組織采集而受到限制。
[0006]瓦坎提(Vacanti)等人的美國公開申請(qǐng)案第2004/0057942號(hào)和第2004/0033598號(hào)揭露了對(duì)缺氧具有特別高耐受性的小原始細(xì)胞。經(jīng)證實(shí)，這些稱為“類孢子”細(xì)胞的細(xì)胞可基本上耐受完全缺氧環(huán)境至少24小時(shí)(盡管缺氧4小時(shí)或24小時(shí)，細(xì)胞仍可存活)。類孢子細(xì)胞的增殖能力比從特化組織分離的終末分化細(xì)胞強(qiáng)。增殖能力是一種重要的特性，因?yàn)榻M織工程、細(xì)胞療法和基于基因的療法常常會(huì)因醫(yī)師無法獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞投予患者而受阻。
[0007]因此，本發(fā)明一個(gè)目的是提供表達(dá)特定細(xì)胞表面或基因表達(dá)標(biāo)記物的類孢子細(xì)胞子群。
[0008]本發(fā)明另一目的是提供多能類孢子細(xì)胞子群，以及分離多能類孢子細(xì)胞子群的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]已經(jīng)鑒別出表達(dá)特定細(xì)胞表面受體和/或基因表達(dá)標(biāo)記物的類孢子細(xì)胞子群。在一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞表達(dá)至少一種細(xì)胞表面/基因表達(dá)標(biāo)記物，例如0ct4、nanog、2邙296、《^?仂、6(^3、仳卩^。3衍3881、5(?2、？3叉6、巢蛋白、50六-1、0)29、0)34、0)90、81整合素、cKit、SP-C、CC10、SFl、DAXl和SCG10。在大多數(shù)實(shí)施例中，所述細(xì)胞表達(dá)標(biāo)記物組合。本發(fā)明還提供可經(jīng)過誘導(dǎo)而分化成內(nèi)胚層、中胚層或外胚層來源的細(xì)胞的類孢子細(xì)胞子群。這些類孢子細(xì)胞子群不管來源的組織如何，都可用于產(chǎn)生來源于全部三種胚層的細(xì)胞。
[0010]本發(fā)明描述用于鑒別和獲得類孢子細(xì)胞子群的方法。所述方法包括培養(yǎng)分離的類孢子細(xì)胞一段足以表達(dá)細(xì)胞表面和/或基因表達(dá)標(biāo)記物的時(shí)間，以及鑒別這些細(xì)胞表面和/或基因表達(dá)標(biāo)記物。
[0011]還描述用于從類孢子細(xì)胞群中純化出相關(guān)類孢子細(xì)胞子群的方法。在一些實(shí)施例中，所述方法包括(a)提供類孢子細(xì)胞群；(b)鑒別表達(dá)例如0ct4、nanog、Zfp296、cripto、Gdf3, UtFU EcatU EsgU Sox2、Pax6、巢蛋白、SCA-1、CD29、CD34、CD90、BI 整合素、cKit、SP-C、CC10、SF1、DAX1和/或SCGlO等一種或一種以上標(biāo)記物的類孢子細(xì)胞子群；和(c)純化所述子群。在一些實(shí)施例中，使用細(xì)胞表面標(biāo)記物特異性抗體分離所述細(xì)胞。
[0012]患有病癥(例如皮膚病)、腫瘤或疾病(例如糖尿病)的患者可例如通過將類孢子細(xì)胞子群投予損傷區(qū)域(例如患者皮膚的損傷區(qū)域、切除腫瘤的區(qū)域或胰臟)來進(jìn)行治療。全身投藥也是可能的。所述方法可用于治療在例如視網(wǎng)膜、腸、膀胱、腎臟、肝臟、肺、神經(jīng)系統(tǒng)(包括脊髓或腦)或內(nèi)分泌系統(tǒng)等多種組織中的任一種中具有功能細(xì)胞缺陷或病癥的患者ο
【附圖說明】
[0013]圖1顯示從胰島瘤(胰臟腫瘤)分離的類孢子細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0014]1.定義
[0015]如本文中所用，多能類孢子細(xì)胞是一種能夠產(chǎn)生來源于全部三種胚層(中胚層、內(nèi)胚層和外胚層)的細(xì)胞的類孢子細(xì)胞。
[0016]如在類孢子細(xì)胞的上下文中使用的術(shù)語“分離的”表示這種細(xì)胞與其天然環(huán)境分開。分離的細(xì)胞可完全與其它細(xì)胞類型分離，或者可在群體中以較多量存在。
[0017]如本文中所用，富集類孢子細(xì)胞的群體是這樣一種細(xì)胞群，其已經(jīng)與在其天然環(huán)境中存在的其它細(xì)胞分離，以致細(xì)胞混合物中這種細(xì)胞的比例高于在其天然環(huán)境中所發(fā)現(xiàn)或剛分離后的比例。
[0018]如本文中所用，“可檢測(cè)標(biāo)記”是指可添加到相關(guān)結(jié)合搭配物以允許檢測(cè)所述結(jié)合搭配物的任何部分。
[0019]I1.類孢子細(xì)胞群
[0020]類孢子細(xì)胞的來源
[0021]類孢子細(xì)胞可從例如禽類、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物或哺乳動(dòng)物等動(dòng)物供體獲得。舉例來說，可從嚙齒動(dòng)物、兔、母牛、豬、馬、山羊、綿羊、狗、貓、非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物或人類分離出哺乳動(dòng)物類孢子細(xì)胞。類孢子細(xì)胞可從成熟動(dòng)物獲得。由于類孢子細(xì)胞對(duì)于缺氧的耐受性優(yōu)于分化的細(xì)胞，故也可從死亡的動(dòng)物(包括已經(jīng)死亡達(dá)24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間的動(dòng)物)分離有活力的類孢子細(xì)胞。類孢子細(xì)胞是從在食品雜貨店購買的雞肝(禽類)分離。初始分離時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)染料排除測(cè)試(trypan blue dye exclus1n test)顯示有活力的(染料排除的)類孢子細(xì)胞極少。分離后三天，可以看到大的漂浮的類孢子細(xì)胞團(tuán)，數(shù)量太多無法計(jì)數(shù)(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0022]在給定的供體內(nèi)，類孢子細(xì)胞可從多種來源獲得。舉例來說，可從體液(例如血液、唾液或尿液)和大多數(shù)(如果不是全部的話)功能器官獲得類孢子細(xì)胞。此外，還可從隨后將用類孢子細(xì)胞治療的患者、從另一個(gè)人或從不同物種的動(dòng)物獲得類孢子細(xì)胞?？色@得自體、同種異體和異種類孢子細(xì)胞子群并用于治療患者或生長(zhǎng)組織。
[0023]類孢子細(xì)胞也可從患病組織(例如癌組織)分離得到(圖1)。由此分離的類孢子細(xì)胞在適當(dāng)條件下具有顯著的再生潛力。
[0024]類孢子細(xì)胞的分離
[0025]用于分離類孢子細(xì)胞的方法揭露于頒予瓦坎提等人的美國專利第7，060, 492號(hào)、第7，575，921號(hào)和第7，560，275號(hào)中。簡(jiǎn)單點(diǎn)說，從動(dòng)物獲得組織或血液樣品。最易于獲得的一種樣品是全血樣品。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，分離方法可根據(jù)用作原材料的組織類型而略有變化。舉例來說，在樣品是血液樣品的情況下，其可被放入含有抗凝血?jiǎng)┑墓苤小?br>[0026]收集后，組織樣品，無論其是體液樣品還是從實(shí)體器官獲得的細(xì)胞懸浮液樣品，都以足以使樣品內(nèi)的細(xì)胞在離心管底部聚結(jié)成球的時(shí)間和速度離心。所得細(xì)胞小球再懸浮于補(bǔ)充有葡萄糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)、胰島素、腐胺(putricine)、砸、孕酮、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)和喊性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblastgrowth factor，bFGF)的適合培養(yǎng)基(例如DMEM/F-12培養(yǎng)基)中。
[0027]隨后將懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)容器中，并在37°C或接近37°C下培育。起初，當(dāng)樣品是血液樣品時(shí)，培養(yǎng)燒瓶主要含有造血細(xì)胞。然而，在培養(yǎng)數(shù)天后，紅細(xì)胞溶解，以致培養(yǎng)物主要(如果不是全部的話)含有類孢子細(xì)胞。這是因?yàn)榧t細(xì)胞沒有細(xì)胞核；而類孢子細(xì)胞在這些條件下仍能存活。當(dāng)從實(shí)體組織分離類孢子細(xì)胞時(shí)，可通過用一系列移液管(各自具有比前一個(gè)小的孔徑)濕磨樣品，來溶解分化細(xì)胞。舉例來說，所用最后一個(gè)移液管可具有約15μ的孔徑。再培養(yǎng)數(shù)天后，類孢子細(xì)胞倍增，并且可連合形成細(xì)胞團(tuán)(球)。經(jīng)過一段時(shí)間(通常約7天)，其數(shù)量可大幅增加。通常，當(dāng)如上文所述進(jìn)行分離時(shí)，根據(jù)臺(tái)盼藍(lán)排除研宄，超過90%的細(xì)胞存活。
[0028]所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，經(jīng)由減小孔的移液管進(jìn)行濕磨不是從較大的分化細(xì)胞分離類孢子細(xì)胞的唯一方式。舉例來說，可使含有類孢子細(xì)胞和分化細(xì)胞的懸浮液通過具有特定尺寸的孔的過濾器。過濾器內(nèi)孔隙的尺寸(以及類似地用于濕磨的移液管的直徑)可根據(jù)希望的分離程序嚴(yán)格度而變化。一般說來，過濾器內(nèi)的孔隙越小，或用于濕磨的移液管直徑越小，則將從分離程序存活的分化細(xì)胞的數(shù)量越少。用于分離類孢子細(xì)胞的其它方法是冷凍/解凍和尺寸排阻法。
[0029]在一些實(shí)施例中，用于從血液/骨髓分離類孢子細(xì)胞，同時(shí)確保排除細(xì)胞/干細(xì)胞類型的方法包括:在不添加任何冷凍保護(hù)劑情況下，將經(jīng)過抗凝血處理的全血冷凍到-20°C到_80°C，隨后將冷凍的樣品解凍。在冷凍期間形成的細(xì)胞內(nèi)冰晶將殺死所有其它細(xì)胞。隨后在培養(yǎng)基中濕磨細(xì)胞，接著培養(yǎng)。剩余的生長(zhǎng)細(xì)胞是類孢子細(xì)胞。從血液分離類孢子細(xì)胞的其它技術(shù)包括缺氧24小時(shí)。用高滲溶液溶解血液或骨髓樣品以使細(xì)胞/干細(xì)胞破裂。在培養(yǎng)物中不使用血清和喂養(yǎng)細(xì)胞來選擇類孢子細(xì)胞。這些方法特別適用于血液以及其它組織。
[0030]類孢子細(xì)胞子群的富集
[0031]本發(fā)明揭露一種用于富