經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【專利說(shuō)明】經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及一種制備經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，屬于干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域
【背景技術(shù)】
[0003]胚胎干細(xì)胞(ESCs)具有細(xì)胞全能性可以分化成全部三層胚層細(xì)胞層的多種細(xì)胞類型。但是胚胎干細(xì)胞的成畸胎瘤的潛在性和其在大型臨床應(yīng)用方面的局限性嚴(yán)格限制了它在科學(xué)研究中的應(yīng)用。但是，隨著患有無(wú)數(shù)病癥的患者的數(shù)目的增多，我們正在迫切的尋找具有使用臨床價(jià)值的其他干細(xì)胞來(lái)源。許多其他來(lái)源的干細(xì)胞都可以用于在早期的臨床試驗(yàn)，如心臟病，脊髓損傷，骨和軟骨修復(fù)等。許多組織和器官的基質(zhì)干細(xì)胞碎片都在體外顯現(xiàn)了其多分化潛能性，因?yàn)樗鼈兛梢苑只芍T如神經(jīng)原細(xì)胞系和生心細(xì)胞系，成骨細(xì)胞系，軟骨細(xì)胞系和成脂細(xì)胞系。事實(shí)上，基質(zhì)細(xì)胞可以分化成外胚層和中胚層細(xì)胞系，它們可以進(jìn)一步進(jìn)行它們的多潛能性分化。那么現(xiàn)在我們所面臨的問(wèn)題則是是否可以安全獲得一個(gè)基質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源，其中這些干細(xì)胞都具有自我更新能力和原有的多分化潛能性。最近，基質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)存在于子宮內(nèi)膜組織內(nèi)。但是直接獲得這些細(xì)胞卻是一個(gè)很具有損害性的過(guò)程。在每個(gè)月經(jīng)周期都會(huì)有組織和血管的大量增長(zhǎng)，這一增長(zhǎng)過(guò)程會(huì)隨著月經(jīng)周期的結(jié)束而停止。經(jīng)血以及這些組織中含有一些具有可再生能力的細(xì)胞的異質(zhì)群體。子宮基質(zhì)細(xì)胞含有的多分化潛能性標(biāo)志物與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中存在的相同，事實(shí)上子宮基質(zhì)細(xì)胞中的這些標(biāo)志物部分是來(lái)源于骨髓的。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)血來(lái)源樣品在制備間充質(zhì)干細(xì)胞中降低污染率的應(yīng)用和經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。該分離制備的方法中用到物理的方法對(duì)樣品進(jìn)行初步的清洗并除去大部分細(xì)菌，再通過(guò)羥乙基淀粉(HES)對(duì)樣品進(jìn)行分離，獲得經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞。所用到的方法簡(jiǎn)單易行，操作方便，并且能最大量獲得所需的干細(xì)胞并培養(yǎng)成功。
[0006]經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞常采用淋巴細(xì)胞分離液分離獲得經(jīng)血干細(xì)胞，多用含10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)，多用含10%DMS0的凍存液凍存。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)中，制備經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞的方法通常會(huì)存在以下不足之處:
1)經(jīng)血干細(xì)胞分離的現(xiàn)有技術(shù)，無(wú)法除去經(jīng)血采集過(guò)程中流經(jīng)陰道而附帶的細(xì)菌，防污染措施作用有限，原代培養(yǎng)污染率高，缺少?gòu)牟杉搭^開(kāi)始減少污染的方法，目前在培養(yǎng)環(huán)節(jié)添加抗生素只能在培養(yǎng)過(guò)程中抑制污染菌繁殖，不能有效減少污染；
2)現(xiàn)有分離方法，沒(méi)有除去經(jīng)血中細(xì)菌或真菌的操作步驟
3)現(xiàn)有的分離方法，不能獲得最大量的經(jīng)血原始的干細(xì)胞，而本實(shí)驗(yàn)方法可以最大量的獲得原始的經(jīng)血干細(xì)胞 4)干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞易衰老，細(xì)胞扁平，增值緩慢或停止增殖，失去分化能力等，目前尚未有方法或技術(shù)經(jīng)驗(yàn)闡述有效維持經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)，防止細(xì)胞老化，維持細(xì)胞在增殖過(guò)程中保留分化能力；
5)間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)期傳代后可能發(fā)生端粒酶失活、癌基因表達(dá)增高抑癌基因表達(dá)下降、核型改變等風(fēng)險(xiǎn)，目前缺少經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞這方面的研究資料。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種制備經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
I)使用月亮杯采集女性經(jīng)期中第二天或第三天的經(jīng)血作為原料；將采集到的經(jīng)血倒入裝有保存液的無(wú)菌容器中，4°c保存。
[0009]2)48h內(nèi)將浸泡在經(jīng)血保存液中的經(jīng)血運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，將經(jīng)血和保存液充分混勻，轉(zhuǎn)移至離心管中，首次離心為800-1000g/5-15min，除去上清。加入清洗，充分混勻，再次離心為 300-700g/5-15min，除去上清。
[0010]3)加入1%_6%羥乙基淀粉(HES)，充分混勻后，靜止10_60分鐘，取上層稍微清晰層，離心取得原始經(jīng)血中的經(jīng)血干細(xì)胞。
[0011]4下層繼續(xù)加入新的1%_6%羥乙基淀粉(HES)，充分混勻后，靜止10_60分鐘，取上層稍微清晰層，離心取得原始經(jīng)血中的經(jīng)血干細(xì)胞。(重復(fù)2-3次)
5)將兩次離心獲得的原始經(jīng)血干細(xì)胞，使用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其中PO代蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%-90%的密度后，使用0.25%胰酶消化，消化時(shí)間為3-5min，PO代之后，細(xì)胞在傳代操作后48-72h內(nèi)進(jìn)行傳代,要求傳代時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%以上,傳代后細(xì)胞按3-8 X 13個(gè)/cm2密度接種，培養(yǎng)過(guò)程中注意觀察培養(yǎng)基PH值變化，一旦PH變黃添加新鮮培養(yǎng)基并去除培養(yǎng)器皿中等量舊培養(yǎng)基，細(xì)胞從PO代傳代，傳至Pl?P30中間的任何一代次；
6)PO?P30代蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存:每16-1O7細(xì)胞加入Iml凍存液，放入凍存盒，轉(zhuǎn)入_80°C冰箱，12?24h后轉(zhuǎn)入-196°C液氮或氣氮中保存?zhèn)溆茫?br> 其中，
所述的步驟I)和步驟2)中的保存液為0.9%生理鹽水或者PBS，加入相應(yīng)的抗生素和抗凝劑。抗生素濃度為終濃度為0.5-3%的青霉素和鏈霉素以及終濃度為l-10ug/ml的兩性霉素B，以及肝素
所述的步驟2)中的清洗液為0.9%生理鹽水或者PBS，加入相應(yīng)青霉素、鏈霉素、兩性霉素B。其中青霉素和鏈霉素為0.5-3%的終濃度,兩性霉素B為l-10ug/ml的終濃度。
[0012]所述的步驟5)中的無(wú)血清培養(yǎng)基由以下成分組成:DMEM/F12、PDGF-BB, bFGF、(TGF) - β 1、EGF 和 Transferrin ;其中，PDGF-BB 含量為 50 ?100 ng/mL ;bFGF 含量為 O ?50 ng/mL ； (TGF) - β I 含量為 O ?20ng/mL ；EGF 含量為 O ?30 ng/mL ；Transferrin 含量為2.0 ?4.5 mg/mL ；
所述的步驟6)中的經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液由基礎(chǔ)液、滲透性冷凍保護(hù)劑所說(shuō)的滲透性冷凍保護(hù)劑濃度為1-1.4 mol/L所說(shuō)的基礎(chǔ)液為培養(yǎng)液DMEM/F12 ;所說(shuō)的滲透性冷凍保護(hù)劑為二甲基亞砜。
[0013]本發(fā)明的制備蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，具有如下技術(shù)效果: I)選擇經(jīng)期中第二或第三天的經(jīng)血作為原料，保存于保存液中，可以防范污染方法，從源頭減少污染幾率。
[0014]2)差異離心洗滌經(jīng)血樣品，利用密度差盡量除去細(xì)菌，有效減少污染幾率；
3)本專利方法中在分離經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)候，采用羥乙基淀粉多次沉淀法，可最大量的獲得經(jīng)血原始干細(xì)胞，提高生產(chǎn)量；
4)使用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)減少動(dòng)物源成分使用，細(xì)胞可按此方法從PO代傳代至P30維持性能穩(wěn)定，可維持蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程，維持細(xì)胞形態(tài)、增殖能力、MSC表面標(biāo)記表達(dá)、分化能力，還可維持經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程，維持端粒酶表達(dá)、癌基因穩(wěn)定表達(dá)、核型穩(wěn)定；
5)本方法中酶消化和凍存復(fù)蘇對(duì)細(xì)胞無(wú)傷害。
[0015]
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1是經(jīng)血樣品羥乙基淀粉沉淀靜止時(shí)的實(shí)驗(yàn)圖圖2是經(jīng)血樣品原代培養(yǎng)的經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖圖3是經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果圖；
圖4是采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的PO?PlO代蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖；
圖5是采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的P2、P5和PlO代蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞，與老化細(xì)胞和未分化細(xì)胞形態(tài)的對(duì)照?qǐng)D；
圖6是生長(zhǎng)曲線測(cè)定檢測(cè)結(jié)果圖；
圖7是成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化檢測(cè)結(jié)果圖；
圖8是不同代次經(jīng)血干細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果圖；
圖9是端粒酶檢測(cè)結(jié)果圖；
圖10是癌基因檢測(cè)結(jié)果圖；
圖11是G顯帶核型分析結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1制備蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞
本實(shí)施例中的制備經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟: