一種制備蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，屬于干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell,MSC)是來源于發(fā)育中胚層的一類多能干 細(xì)胞，具有自我更新及多向分化潛能，它在特定誘導(dǎo)條件下可分化為多種類型的組織細(xì)胞， 可形成骨、軟骨、脂肪、心肌等多種組織。間充質(zhì)干細(xì)胞最早主要來源于骨髓，但人骨髓中的 間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSC)含量極低。近年來，已有具備干/祖細(xì)胞特征的間充質(zhì)細(xì)胞自外周 血、牙髓、軟骨、肌肉、臍帶和胎盤等多種組織中分離出來。從胎盤組織中可以分離出來源于 子體的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞和絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞，以及來源于母體的 蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞。成體的間充質(zhì)細(xì)胞可以在不同的條件下分化為多種具有特定功能的細(xì) 胞，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肌細(xì)胞等等，，具有巨大的潛在醫(yī)療和存儲(chǔ) 價(jià)值。胎盤的臍帶、羊膜和絨毛膜都可以提取出間充質(zhì)干細(xì)胞，作為小孩自身細(xì)胞的移植或 凍存。而胎盤的蛻膜提取出來的間充質(zhì)干細(xì)胞，來源于母體，可以用于母親自身細(xì)胞的移植 或凍存，具有針對(duì)性。
[0003] 蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞常采用酶消化蛻膜組織獲得，多用含10% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)， 多用含10% DMSO的凍存液凍存。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中，制備蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法通常會(huì)存在以下不足之處：
[0005] 1)蛻膜組織分離的現(xiàn)有技術(shù)，無(wú)法剝離單純的來自于母體的蛻膜組織，總混有胎 盤的來源于子體的絨毛膜組織或羊膜組織。
[0006] 2)胎盤采集及蛻膜分離的現(xiàn)有技術(shù)缺少有效減少污染措施，防污染措施作用有 限，原代培養(yǎng)污染率高，缺少?gòu)牟杉搭^開始減少污染的方法，目前在培養(yǎng)環(huán)節(jié)添加抗生素 只能在培養(yǎng)過程中抑制污染菌繁殖，不能有效減少污染；
[0007] 2)現(xiàn)有酶消化方法復(fù)雜，需多次酶消化；
[0008] 3)酶消化、凍存復(fù)蘇等操作對(duì)細(xì)胞有可能造成細(xì)胞損傷；
[0009] 4)干細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞易衰老，細(xì)胞扁平，增值緩慢或停止增殖，失去分化能力 等，目前尚未有方法或技術(shù)經(jīng)驗(yàn)闡述有效維持蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)，防止細(xì)胞老化，維持 細(xì)胞在增殖過程中保留分化能力；
[0010] 5)間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)期傳代后可能發(fā)生端粒酶失活、癌基因表達(dá)增高抑癌基因表達(dá) 下降、核型改變等風(fēng)險(xiǎn)，目前缺少蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞這方面的研究資料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種制備單純蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞 的方法。
[0012] 本發(fā)明的制備蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟：
[0013] 1)使用分娩排出0?30min內(nèi)的男性足月胎兒胎盤作為原料；用胎盤清洗液沖洗 胎盤外表1-3次,將胎盤浸泡于胎盤清洗液中；
[0014] 2)48h內(nèi)將浸泡在胎盤清洗液中的胎盤運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，取出胎盤，再次用清洗液清洗 1-3次，再?gòu)奶ケP底部小心分離壁蛻膜，清洗干凈后，放入清洗液浸泡0?30min，然后將蛻 膜組織剪碎成1?3mm 3大小的組織塊；
[0015] 3)將蛻膜組織留樣進(jìn)行性別鑒定，確定采集的蛻膜組織單純來自于母體；
[0016] 4)通過膠原酶消化法從蛻膜組織塊獲取蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0017] 5)使用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞，其中PO代蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)滿 至80%密度后，使用0. 25%胰酶消化，消化時(shí)間為3-5min，PO代之后，細(xì)胞在傳代操作后 48-72h內(nèi)進(jìn)行傳代，要求傳代時(shí)細(xì)胞密度80% -90%，傳代后細(xì)胞按（3-8) X IO3個(gè)/cm2密 度接種，培養(yǎng)過程中注意觀察培養(yǎng)基PH值變化，一旦變黃添加新鮮培養(yǎng)基并去除培養(yǎng)器皿 中等量舊培養(yǎng)基，細(xì)胞從PO代傳代，傳至Pl?P30中間的任何一代次；
[0018] 其中，
[0019] 所述的步驟1)和步驟2)中的清洗液為0. 9 %生理鹽水；
[0020] 所述的步驟4)中的膠原酶消化法中所用的膠原酶為終濃度為l_5mg/ml的膠原酶 II ;
[0021] 所述的步驟5)中的無(wú)血清培養(yǎng)基由以下成分組成：DMEM/F12、TOGF-BB、bFGF、 (TGF)-P 1、EGF 和轉(zhuǎn)鐵蛋白 Transferrin ;其中，PDGF-BB 含量為 50 ?100ng/mL ;bFGF 含 量為0?50ng/mL ;(TGF)-0 1含量為0?20ng/mL ;EGF含量為0?30ng/mL ;轉(zhuǎn)鐵蛋白 Transferrin 含量為 2. 0 ?4. 5mg/mL〇
[0022] 優(yōu)選地，
[0023] 所述的步驟1)和步驟2)中的清洗液還含有抗生素，所說的抗生素為青霉素、鏈霉 素或兩性霉素 B。
[0024] 所述的步驟4)中的膠原酶消化法的步驟如下：將蛻膜組織塊放入37°C溫度中，振 蕩消化15?60min，加入體積為組織塊體積1?5倍的生理鹽水，以2500轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速離 心5min，去上清，將底部消化后產(chǎn)物，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿，按Iml蛻膜組織塊加入IOml無(wú)血清培 養(yǎng)基的比例添加無(wú)血清培養(yǎng)基，所述的步驟4)中的無(wú)血清培養(yǎng)基由以下成分組成：DMEM/ F12、PDGF-BB、bFGF、（TGF)-P 1、EGF 和轉(zhuǎn)鐵蛋白 Transferrin ;其中，PDGF-BB 含量為 50 ? 100ng/mL ;bFGF 含量為 0 ?50ng/mL ; (TGF) - β 1 含量為 0 ?20ng/mL ;EGF 含量為 0 ?30ng/ mL ;轉(zhuǎn)鐵蛋白 Transferrin 含量為 2. 0 ?4. 5mg/mL。
[0025] 所述的步驟4)中的無(wú)血清培養(yǎng)基由以下成分組成：DMEM/F12+80ng/mL PDGF-BB+20ng/mL bFGF+10ng/mL (TGF)-βΙ+lOng/mL EGF+3.0mg/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白。
[0026] 所述的步驟4)中的無(wú)血清培養(yǎng)基中還添加有抗生素，所說的抗生素為青霉素、鏈 霉素或兩性霉素 B。
[0027] 所述的步驟5)中的無(wú)血清培養(yǎng)基由以下成分組成：DMEM/F12+80ng/mL PDGF-BB+20ng/mL bFGF+10ng/mL (TGF)-βΙ+lOng/mL EGF+3.0mg/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白。
[0028] 所述的步驟5)中的PO代細(xì)胞培養(yǎng)用的無(wú)血清培養(yǎng)基中還添加有抗生素，所說的 抗生素為青霉素、鏈霉素或兩性霉素 B。
[0029] 所述的蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法如下：每IO6-IO7細(xì)胞加入Iml凍存液，放入 凍存盒，轉(zhuǎn)入_80°C冰箱，12?24h后轉(zhuǎn)入-196°C液氮或氣氮中保存?zhèn)溆?；所述凍存液由?礎(chǔ)液和滲透性冷凍保護(hù)劑組成，所說的滲透性冷凍保護(hù)劑濃度為1-1. 4mol/L，所說的基礎(chǔ) 液為培養(yǎng)液DMEM/F12 ;所說的滲透性冷凍保護(hù)劑為二甲基亞砜。
[0030] 本發(fā)明的制備蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，具有如下技術(shù)效果：
[0031] 1)選擇胎兒為男性的足月胎盤為原料，可以防范污染方法，從源頭減少污染幾率， 多次沖洗表面，有效減少污染幾率；
[0032] 2)限定蛻膜取材區(qū)域：從胎盤底部輕柔剝?nèi)∽畋砻嫱懩そM織，減少混雜細(xì)胞污 染；同時(shí)對(duì)剝離下來的蛻膜組織進(jìn)行性別鑒定，確保剝離下來的蛻膜組織沒有胎盤其他組 織的污染。
[0033] 3)本專利方法中在分離蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)候，采用單一酶消化，可精簡(jiǎn)流程；
[0034] 4)使用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)減少動(dòng)物源成分使用，細(xì)胞可按此方法從PO代傳代至 P30維持性能穩(wěn)定，可維持蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)過程，維持細(xì)胞形態(tài)、增殖能 力、MSC表面標(biāo)記表達(dá)、分化能力，還可維持蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)過程，維持端 粒酶表達(dá)、癌基因穩(wěn)定表達(dá)、核型穩(wěn)定；
[0035] 5)本方法中酶消化和凍存復(fù)蘇對(duì)細(xì)胞無(wú)傷害。
【附圖說明】
[0036] 圖1是制得的蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)圖；
[0037] 圖2-1是分離的蛻膜組織與其他胎盤組織的性別鑒定結(jié)果；
[0038] 圖2-2是制得的蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果圖；
[0039] 圖3是經(jīng)消化酶消化后的蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)圖；
[0040] 圖4是經(jīng)消化酶消化后的蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線檢測(cè)結(jié)果圖；
[0041] 圖5是采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的PO?PlO代蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖；
[0042] 圖6是采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的P2、P5和PlO代蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞，與老化細(xì)胞 和未分化細(xì)胞形態(tài)的對(duì)照?qǐng)D；
[0043] 圖7是生長(zhǎng)曲線測(cè)定檢測(cè)結(jié)果圖；
[0044] 圖8是成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化檢測(cè)結(jié)果圖；
[0045] 圖9是流式檢測(cè)結(jié)果圖；
[0046] 圖10是端粒酶檢測(cè)結(jié)果圖；
[0047] 圖11是癌基因檢測(cè)結(jié)果圖；
[0048] 圖12是G顯帶核型分析結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 實(shí)施例中所用的試劑購(gòu)自試劑名稱后面括號(hào)內(nèi)的廠商。
[0050] 實(shí)施例1制備蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞
[0051] 本實(shí)施例中的制備蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟：
[0052] 1)使用分娩排出0?30min內(nèi)的男性足月胎兒胎盤作為原料；操作人員著無(wú)菌手 套握取胎盤，操作過程中防止胎盤接觸可能帶來污染的物體（如地面等），用胎盤清洗液沖 洗外表3次，清洗液為0. 9 %生理鹽水（貴州天地），清洗液中可以加入或不加入抗生素，加 入的抗生素為青霉素（gibco)、鏈霉素（gibco)、兩性霉素 B(sigma)。用無(wú)菌紗布擦拭表面， 去除表面血跡，至胎盤表面無(wú)液體滴落后浸泡于含清洗液的胎盤采集盒中，48h內(nèi)將浸泡在 清洗液中的胎盤運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。
[0053] 2)胎盤運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，放置于40cmX40cmX20cm(長(zhǎng)X寬X高）的盤子當(dāng)中， 用無(wú)菌清洗液沖洗外表3次，清洗液為0. 9%生理鹽水（貴州天地），清洗液中可以加入或 不加入抗生素，加入的抗生素為青霉素（gibco)、鏈霉素