昆明犬精子體外獲能及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物生殖生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是昆明犬精子體外獲能及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人及哺乳動(dòng)物精子在剛射出或從附睪尾部取出時(shí)雖然具有運(yùn)動(dòng)能力，但還不能立 刻和卵細(xì)胞結(jié)合，需要在雌性生殖道中停留一段時(shí)間，發(fā)生一系列生理生化變化才具備使 卵細(xì)胞受精的能力，這種現(xiàn)象稱(chēng)為"精子獲能"。當(dāng)獲能的精子進(jìn)入卵丘細(xì)胞或與卵子透明 帶結(jié)合時(shí)被激活，精子頭部前端頂體破裂，發(fā)生所謂的"頂體反應(yīng)"，頂體內(nèi)所含的頂體酶被 釋放出來(lái)，支持精子穿過(guò)透明帶，從而導(dǎo)致精卵融合，完成受精。大量研究表明，精子獲能是 所有哺乳動(dòng)物精子受精前必須經(jīng)歷的一個(gè)生理階段。
[0003] 早期的精子獲能研究，采用體內(nèi)獲能的方法，即從交配后的雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)取 出精子用于受精，借以分析獲能的部位、時(shí)程及其機(jī)制。但這種對(duì)體內(nèi)獲能的研究常常受到 許多條件的限制，例如，精子在體內(nèi)總是與雌性生殖道分泌物接觸，而雌性生殖道中存在著 影響獲能的因子，人們很難控制這種復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境，因而給研究精子獲能帶來(lái)極大的困 難。
[0004] 為此，體外獲能的研究方法應(yīng)運(yùn)而生。早期研究精子體外獲能通常使用各種動(dòng)物 的體液（如輸卵管液、濾泡液和血清），而這些體液的成分相對(duì)復(fù)雜，很難確定何種成分參 與誘發(fā)或支持精子獲能。自從Toyoda和Chang最先報(bào)道了采用一種特定的化學(xué)培養(yǎng)液成 功實(shí)現(xiàn)體外受精以來(lái)，研究精子體外獲能已變得相對(duì)容易?，F(xiàn)在，體外獲能技術(shù)可以精確地 控制實(shí)驗(yàn)條件，逐個(gè)分析獲能及其相關(guān)因子，由體外獲能的研究結(jié)果可以揭示體內(nèi)獲能的 本質(zhì)。最使人類(lèi)受益的是，體外獲能的成功直接導(dǎo)致了目前廣泛應(yīng)用于不育癥治療的試管 嬰兒技術(shù)的誕生。
[0005] 雖然大部分動(dòng)物精子的體外獲能已再無(wú)技術(shù)障礙，但是獲能的分子機(jī)理仍有許多 問(wèn)題尚未闡明。目前，小鼠、倉(cāng)鼠、牛、犬、羊、豬等動(dòng)物以及人精子被用于進(jìn)行獲能分子機(jī)理 的研究。
[0006] 昆明犬是中國(guó)唯一列入世界知名警犬的優(yōu)良定型犬種，是中國(guó)獨(dú)立自主培育的唯 一工作犬種，在追蹤、鑒別、搜毒、搜爆、巡邏、守候、警戒、消防、探雷等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作 用，其種質(zhì)資源極為寶貴，開(kāi)展其精子獲能的研究有利于該動(dòng)物體外受精及人工繁殖技術(shù) 的發(fā)展，但關(guān)于昆明犬精子獲能的研究目前未見(jiàn)報(bào)道，即使是其他犬種的精子獲能，也僅見(jiàn) 于國(guó)外早期一些零星、不系統(tǒng)的報(bào)道，未明確犬精子獲能的基本條件。本發(fā)明闡明了昆明犬 精子體外獲能的必需條件，成功建立了該犬種精子的體外獲能體系，豐富了動(dòng)物精子獲能 的內(nèi)容，為深入研究昆明犬精子獲能的分子機(jī)理奠定了良好基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是建立一種昆明犬精子體外獲能及檢測(cè)方法，為深入研究昆明犬精 子獲能的分子機(jī)理奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
[0008] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下： 昆明犬精子體外獲能及檢測(cè)方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)： (1) 洗精液mCCM (W)及獲能液mCCM的配制 按每IOOml溶液中含氯化鈉0. 488g、氯化鉀0. 0356g、磷酸二氫鉀0. 0162g、丙酮酸鈉 0. 0028g、乳酸鈉60%水溶液0. 338ml、葡萄糖0. 05g、青霉素 G鈉鹽10000 IU、硫酸鏈霉素 0. 005g、酚紅0. 002g的配方用Mi 11 i-Q超純水配制洗精液mCCM (W)，經(jīng)孔徑0. 22 μ m濾器過(guò) 濾后將其于38°C水浴保溫； 按每IOOml溶液中含氯化鈉0. 488g、氯化鉀0. 0356g、氯化鈣0. 0222g、磷酸二氫鉀 0. 0162g、碳酸氫鈉0. 3159g、丙酮酸鈉0. 0028g、乳酸鈉60%水溶液0. 338ml、葡萄糖0. 05g、 牛血清白蛋白0. 3g、青霉素 G鈉鹽10000 IU、硫酸鏈霉素0. 005g、酚紅0. 002g的配方用 Milli-Q超純水配制獲能液mCCM，經(jīng)孔徑0. 22 μ m濾器過(guò)濾后將其置于CO2培養(yǎng)箱38°C平 衡至少2小時(shí)； (2) 精液洗滌 將采集的新鮮精液15ml轉(zhuǎn)至滅菌離心管中，加入IOml mCCM(W)洗精液，700g離心 5min，棄上清，再加 IOml mCCM(W)洗精液，700g離心5min洗滌一次，沉淀用適量mCCM(W)洗 精液重懸，使精子濃度為60 X IO6AiL ; (3) 體外獲能 將上述洗滌后的精液分至2mL圓底離心管中，每管300 μ L ;每管再加入38°C預(yù)熱平衡 的含2X (CaCl2、NaHCOjP BSA)的mCCM 300 μ L，將離心管置CO 2培養(yǎng)箱于38°C培養(yǎng)3小 時(shí)； (4) CTC獲能檢測(cè) ① 、CTC染液配制：稱(chēng)取CTC 2mg，氯化鈉38mg，半胱氨酸3mg，Tris緩沖液12mg， 加入 5mL Milli-Q 超純水，用 IN NaOH 或 IN HCl 調(diào) pH 為 7. 8 ; ② 、染色：避光條件下，在38°C預(yù)熱的載玻片上加入10 μ L的CTC染液，再加10 μ L的 步驟（2)所得的精子懸液，10秒鐘后加入2 μ L 12. 5%戊二醛Tris溶液，輕輕蓋上蓋玻片， 放于濕盒內(nèi)，4°C避光過(guò)夜；取出載玻片，在紫外光下觀察，記數(shù)，每組總數(shù)不少于200個(gè)，染 色精子分為三種類(lèi)型： "F"型，為未獲能精子，整個(gè)精子頭部呈較亮的黃綠色； "B"型，為獲能但未發(fā)生頂體反應(yīng)的精子，精子的頭部頂體區(qū)呈黃綠色，而頂體 后區(qū)較暗； "AR"型，為已發(fā)生頂體反應(yīng)的精子，精子頭部后區(qū)呈黃綠色，而頂體區(qū)變暗； (5) FITC-PSA檢測(cè)誘發(fā)頂體反應(yīng) ① 、向步驟（3)獲能3h的精子中加入鈣離子載體A23187使其終濃度為10 μ M，于CO2 培養(yǎng)箱38°C繼續(xù)培養(yǎng)30min ; ② 、取出孵育的精子50 μ L，加入ImL Tris緩沖液，700g離心5min，棄上清； ③ 、沉淀用4°C預(yù)冷的ImL無(wú)水甲醇于4°C固定30s ; ④ 、700g離心5min,棄上清，加入ImL Tris緩沖液，700g離心5min ; ⑤ 、加入FITC-PSA，使染料濃度為0· 05mg/mL，避光孵育20min ; ⑥ 、用PBS洗滌一次，吸取10 μ L于載玻片上，用熒光顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)，每組總數(shù)不少 于200個(gè)；染色精子分為兩種類(lèi)型： 頂體完整型：精子頂體區(qū)呈綠色，頂體后區(qū)變暗； 頂體丟失型：精子頂體區(qū)和頂體后區(qū)無(wú)熒光，精子中段有一綠色熒光帶。<