菊酯類農(nóng)藥降解菌株及其菌劑和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種菊酯類農(nóng)藥降解菌株，其為奇異變形桿菌（Proteus?mirabilis）JZB42C001，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.8585。上述菌株來源于北京郊區(qū)農(nóng)田土壤中。本發(fā)明還公開了一種包含上述菌株的菌劑以及其在降解殘留菊酯方面的應(yīng)用。該奇異變形桿菌JZB42C001對基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)液中濃度為100mg/L的三氟氯氰菊酯降解率達71.6%；對于基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)液中濃度為100mg/L的聯(lián)苯菊酯降解率達到61.5%；對于基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)液中濃度為100mg/L的高效氯氰菊酯降解率達到87.6%。
【專利說明】菊酯類農(nóng)藥降解菌株及其菌劑和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物降解農(nóng)藥殘留領(lǐng)域，具體而言，涉及一種菊酯類農(nóng)藥降解菌株及其菌劑和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)報道我國農(nóng)藥土壤污染高達1.4億畝，蔬菜、水果中農(nóng)藥殘留超標問題成為制約我國農(nóng)產(chǎn)品出口的貿(mào)易壁壘，急慢性中毒事件也時有發(fā)生。有機磷、菊酯、氨基甲酸酯、雜環(huán)類等農(nóng)藥的廣泛、大劑量使用不僅嚴重影響農(nóng)產(chǎn)品的食品安全和質(zhì)量，也引起了土壤、地表水和地下水的污染。
[0003]菊酯類農(nóng)藥已成為我國出口的蔬菜、水果中主要農(nóng)藥殘留之一，引起急慢性中毒事件也越來越多，對人類、水生生物和自然環(huán)境造成很大危險。據(jù)資料報道，2003年世界擬除蟲菊酯殺蟲劑的銷售額為13.0億美元，位列殺蟲劑第二位。菊酯類農(nóng)藥有蓄積毒性，長期接觸會引起慢性疾病，如能刺激乳腺癌細胞增殖和P52基因的表達，具有擬雌激素活性，而且對魚類，蛘類等水生生物也有很高的毒性。
[0004]三氟氯氰菊酯是擬除蟲菊酯類殺蟲劑，廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物及家庭衛(wèi)生害蟲防除。三氟氯氰菊酯具有對光、熱穩(wěn)定的特點，在環(huán)境中半衰期較長，很難在自然條件下快速降解，加之長期頻繁使用，有關(guān)其農(nóng)藥殘留超標問題日趨嚴重，當前農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全問題，越來越引起社會的廣泛關(guān)注。
[0005]而以微生物為主體的生物修復(fù)技術(shù)可用于降解多種有機污染物，具有安全、高效、無二次污染、費用低等優(yōu)點，是國際上殘留農(nóng)藥處理技術(shù)研究的前沿和熱點。有關(guān)菊酯類農(nóng)藥微生物降解的報道并不多。如研究表明假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、腸桿菌屬(Ehterobacte sp.)、產(chǎn)喊桿菌屬(Alcaligenes sp.)和芽抱桿菌屬(Bacillus sp.)等對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有較好的降解作用。王兆守等從茶葉中分離到一株標號為clf6經(jīng)鑒定為假單胞菌屬的菌株可有效地降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯，降解率分別為55.645^44.56^^^152.19 %。許育新等分離得到的紅球菌Rhodoco-ccus sp.CDT3和辛偉等分離到的蠟狀芽孢桿菌BaciIluscereus TR2均可以降解氯氰菊酯。因此，開展擬除蟲菊酯類農(nóng)藥微生物修復(fù)技術(shù)研究，篩選不同類型的三氟氯氰菊酯的高效降解微生物菌株，可為減低土壤或作物中三氟氯氰菊酯殘留提供有效手段，為保障農(nóng)產(chǎn)品安全和農(nóng)田環(huán)境安全提供技術(shù)支持。
[0006]但是，目前的菌株普遍存在對三氟氯氰菊酯降解效率低的缺陷，而且利用微生物實現(xiàn)對農(nóng)藥進行降解，機理十分復(fù)雜，具有很強的針對性。目前未見變形桿菌屬菌株降解擬除蟲菊酯農(nóng)藥的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的第一目的在于提供一種菊酯類農(nóng)藥降解菌株。
[0008]本發(fā)明的第二目的在于提供一種含有上述菌株的菌劑。[0009]本發(fā)明的第三目的在于提供上述菌株或菌劑的應(yīng)用。
[0010]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
[0011]—種菊酯類農(nóng)藥降解菌株,其為奇異變形桿菌(Proteus mirabilis) JZB42C001,該菌株已于2013年12月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏號為CGMCC N0.8585，其保藏單位地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。
[0012]上述菌株來 源于北京通州區(qū)種植蔬菜的農(nóng)田土壤中，經(jīng)過富集、分離和純化得到，其對菊酯類農(nóng)藥或殺蟲劑有很強的降解作用。
[0013]上述菌株的特征如下:
[0014]I)形態(tài)學(xué)特征:該菌在固體培養(yǎng)基中，形態(tài)呈明顯的多形性，可為桿狀、球桿狀、球形、絲狀等，大小(0.4~0.6) μ mX (1.0~3.0) μ m,無莢膜,不形成芽孢,有周身鞭毛。
[0015]2)生理生化特征:革蘭氏陰性，吲哚試驗陰性，明膠液化、硫化氫、苯丙氨酸脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶、脲酶陽性。麥芽糖發(fā)酵陰性，氧化酶陰性，水楊苷水解陰性，七葉苷水解陰性，乙酰甲基醇(VP)陰性，甲基紅(MR)陽性。
[0016]3)上述菌株的16S rDNA鑒定:
[0017]PCR擴增奇異變形桿菌JZB42C001菌株16S rDNA約1.5kb，測序結(jié)果顯示具有序列表中SEQ ID N0.1的核苷酸序列，將其用BLAST軟件與GenBank中的序列進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)該菌與奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)的同源性最高,達到99%。
[0018]本發(fā)明參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠，蔡妙英)變形桿菌屬特征，并結(jié)合上述形態(tài)特征、生理生化特征和16SrDNA基因序列相似性，將本發(fā)明菌株JZB42C001鑒定為奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)。
[0019]本發(fā)明奇異變形桿菌JZB42C001在好氧條件下可以利用菊酯作為唯一碳源，該菌可在普通固/液培養(yǎng)基或LB固/液培養(yǎng)基上生長，也可在含有菊酯濃度為I~100mg/L的基礎(chǔ)無機鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長溫度為25~30°C，pH為7~8，最適生長溫度為30°C，最適pH為7。
[0020]一種含有上述菌株的菌劑，優(yōu)選地，該菌劑是通過以下方法獲得的:將純化后的奇異變形桿菌JZB42C001接種于普通液體培養(yǎng)基或LB液體培養(yǎng)基中，在25~30°C、180r/min條件下培養(yǎng)24~48h，然后在4~5°C條件下離心8~12min以收集沉淀物菌體，用0.1mol/L的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液洗滌菌體，再用0.lmol/L的Na2HPO4~KH2PO4緩沖液將菌體稀釋成菌體懸濁液，所述菌體懸濁液即菌劑，更優(yōu)選地，所述菌劑中奇異變形桿菌JZB42C001的濃度為1.0X IO7CFU.mr1。其中，所述0.lmol/L的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液的配制如下:按體積比為61:39量取0.2mol/L的Na2HPO4和0.2mol/L的NaH2PO4,混合均勻后調(diào)整ρΗ=7.0,得到0.2moI/LNa2HPO4-KH2PO4緩沖液；然后用蒸餾水將0.2moI/LNa2HPO4-KH2PO4緩沖液稀釋成 0.1moI/LNa2HPO4-KH2PO4 緩沖液。
[0021]上述菌株在降解殘留菊酯方面的應(yīng)用。
[0022]上述菌劑在降解殘留菊酯方面的應(yīng)用。
[0023]在上述菌劑的應(yīng)用中，作為一種優(yōu)選實施方式，所述菌劑在降解殘留菊酯方面的應(yīng)用具體方法為:將菌劑均勻噴灑于被處理物表面，其中菌劑使用濃度為0.5-5.0X 107CFU/g，所述菌劑在25~30°C條件下于所述被處理物表面停留1_10天，更優(yōu)選停留4-6天。
[0024]所述菊酯優(yōu)選選自三氟氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯和高效氯氰菊酯中的一種或多種。
[0025]本發(fā)明的有益效果:該奇異變形桿菌JZB42C001對土壤、水果、蔬菜或水體中殘留的菊酯降解效果好，對于基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)液中濃度為100mg/L的三氟氯氰菊酯,采用本發(fā)明菌株處理5天后降解率達到71.6% ;對于基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)液中濃度為100mg/L的聯(lián)苯菊酯，采用本發(fā)明菌株處理5天后降解率達到61.5% ;對于基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)液中濃度為IOOmg/L的高效氯氰菊酯 ，采用本發(fā)明菌株處理5天后降解率達到87.6%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為奇異變形桿菌JZB42C001菌株在三氟氯氰菊酯濃度為100mg/L的無機鹽培養(yǎng)液中、不同培養(yǎng)時間內(nèi)菌株的生長情況以及對三氟氯氰菊酯的降解效果；
[0027]圖2為在三氟氯氰菊酯不同初始濃度下，菌株對三氟氯氰菊酯的降解曲線。
[0028]圖3為本發(fā)明奇異變形桿菌JZB42C001的電鏡掃描照片。
【具體實施方式】
[0029]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將采用實施例的方式對本發(fā)明進行詳細說明。
[0030]本發(fā)明中使用的各種培養(yǎng)基均采用常規(guī)方法配制，實施例中涉及的分子生物學(xué)操作如未注明具體試驗條件和方法，均參照SambrookJ等主編，科學(xué)出版社，2002，分子克隆實驗指南(第三版)。
[0031]本發(fā)明中使用的各種培養(yǎng)基的配制方法如下:
[0032]富集培養(yǎng)基:蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化鈉5g,蒸懼水補至1000mL,調(diào)pH至7.0,高壓滅菌20min。
[0033]普通固體培養(yǎng)基:蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化鈉5g,瓊脂15g、蒸懼水補至1000mL,調(diào)pH至7.0,高壓滅菌20min,然后倒平板。
[0034]普通液體培養(yǎng)基:蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化鈉5g,蒸懼水補至1000mL,調(diào)pH至
7.0,高壓滅菌20min。
[0035]基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)基:lgΝΗ4Ν03、0.5g MgSO4.7Η20、0.5g(NH4)2S04、0.5g ΚΗ2Ρ04、0.5gNaCl> 1.5g K2HPO4、蒸懼水補至1L,調(diào)pH至7.0,高壓滅菌20min。
[0036]分離培養(yǎng)基:lgNH4NO3^0.5g MgSO4.7Η20、0.5g(NH4)2S04、0.5gKH2P04、0.5g NaCl、
1.5g K2HPO4> 15g瓊脂、蒸懼水補至1L,調(diào)pH至?.0,高壓滅菌20min,然后倒平板。
[0037]LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，蒸餾水補至1L，調(diào)pH至
7.0,高壓滅菌20min。
[0038]LB固體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaC110g，15g瓊脂、蒸餾水補至1L，調(diào)pH至7.0,高壓滅菌20min,然后倒平板。
[0039]0.lmol/L Na2HPO4-KH2PO4 緩沖液(ρΗ=7.0)的配制依次如下:
[0040]1)0.2mol/L Na2HPO4 的配制:取 71.6g Na2HPO4-12H20 溶于 1000mL 蒸餾水；
[0041]2) 0.2mol/L NaH2PO4 的配制:取 31.2g NaH2P04_2H20 溶于 1000mL 蒸餾水；
[0042]3) 0.2moI/LNa2HPO4-KH2PO4 緩沖液(ρΗ=7.0)的配制:取 0.2moI/LNa2HPO4 溶液61mL、0.2mol/L NaH2PO4溶液39mL，將二者混合均勻，調(diào)節(jié)pH至7.0 ;
[0043]4)取 0.2moI/LNa2HPO4-KH2PO4 緩沖液(ρΗ=7.0) 50mL,然后用蒸餾水稀釋為 IOOmL即成為 0.1moI/LNa2HPO4-KH2PO4 緩沖液(pH=7.0)。
[0044]實施例1:奇異變形桿菌(Proteus mirabilis) JZB42C001的分離、純化
[0045]將來源于北京郊區(qū)且施用過三氟氯氰菊酯的菜田土壤樣品分成2份，每份10g，在無菌操作條件下，分別加到IOOmL含有三氟氯氰菊酯的富集培養(yǎng)基中(其中，三氟氯氰菊酯在富集培養(yǎng)基中的濃度為50mg/L)，在30°C下180r/min的搖床上培養(yǎng)7d ;之后按10%的接種量(本實施例中“10%的接種量”是指接種液與被接種培養(yǎng)基的體積比)將其轉(zhuǎn)接到下一批含有三氟氯氰菊酯的富集培養(yǎng)基(其中，該批富集培養(yǎng)基中，三氟氯氰菊酯的濃度為100mg/L)中，繼續(xù)培養(yǎng)7d ;之后再按10%的接種量轉(zhuǎn)接到含三氟氯氰菊酯的富集培養(yǎng)基(三氟氯氰菊酯在富集培養(yǎng)基中的濃度為200mg/L)中，再培養(yǎng)7d ;接著按10%的接種量轉(zhuǎn)接到含三氟氯氰菊酯的基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)基(三氟氯氰菊酯在基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)基濃度為250mg/L)中，繼續(xù)培養(yǎng)7d ;再按10%的接種量轉(zhuǎn)接到含三氟氯氰菊酯的基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)基(三氟氯氰菊酯在基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)基濃度為250mg/L)中，繼續(xù)培養(yǎng)7d ;然后從兩份培養(yǎng)液中各取0.1mL分別轉(zhuǎn)接到各自的平板上，涂布平板，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，選取不同形態(tài)特征的單菌落接種于含三氟氯氰菊酯的分離培養(yǎng)基(三氟氯氰菊酯在分離培養(yǎng)基中的濃度為250mg/L)上，采用平板劃線法分別進行3次分離純化。純化后選取平板上長勢較好的單菌落菌株進行編號，其中一株定名為JZB42C001，將其保藏于具有普通固體培養(yǎng)基的斜面試管中。[0046]實施例2:奇異變形桿菌(Proteus mirabilis) JZB42C001 的 16S rDNA 鑒定
[0047]1、PCR模板的獲取:其包括兩種方法，一種是提取基因組DNA以將其作為PCR模板，另一種是直接熱處理菌液以將熱處理后的菌液作為PCR模板。下面對兩種方法均做一介紹。
[0048]I)提取基因組DNA，采用溶菌酶加10%SDS法，具體如下:
[0049](a)將純化后的該菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28°C條件下180r/min的搖床上培養(yǎng)24h，然后取新鮮培養(yǎng)菌液2ml，12000rpm，離心l_2min，棄去上清；
[0050](b)再向沉淀物中加入lmL、lXTE(pH8.0)buffer混勻洗漆，12000rpm,離心l-2min,棄去上清；
[0051](c)再向沉淀物中加入400 μ L、5XTE(pH8.0)buffer混勻洗漆，12000rpm,離心l-2min,棄去上清；
[0052](d)再向沉淀物中加入50μ L、20mg/ml溶菌酶溶液，37°C水浴30_60min ；
[0053](e)加入 50μ LU0wt%SDS,20y L 蛋白酶(20mg/ml)，55°C水浴 60min ；
[0054](f)加入500yL酚/氯仿/異戊醇(體積比為25:24:1)混勻，12000rpm，離心IOmin ；
[0055](g)取上清液轉(zhuǎn)入新離心管中，加入與上清液等體積的氯仿/異戊醇(體積比為24:1),混勻，12000rpm,離心 IOmin ；
[0056](h)取上清液轉(zhuǎn)入新離心管中(1.5ml),加入2倍上清液體積的無水乙醇，輕混勻直至 DNA 沉淀，12000rpm,離心 IOmin ；
[0057](i)棄去上清液，70%乙醇洗漆，12000rpm,離心10min ；[0058](j)棄去上清液,操作臺晾干,至DNA透明；
[0059](k)加入50 μ L滅菌水，0.5 μ L RNase，混勻，_20°C冰箱保存，備用。
[0060]2)直接熱處理獲得PCR模板，具體如下:將純化后的該菌種接種于LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)24h，然后用無菌槍頭蘸取少量菌體，混勻在100 μ LddH2O中，沸水處理2min后12000rpm離心5min，上清液即為PCR擴增模板。本實施例采用了該方法獲得PCR模板。
[0061]2、PCR
[0062]PCR 引物采用 16S rDNA 通用引物 27F(5' -GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3/，即序列表中 SEQ ID N0.2)和 1492R (5' -ACG GAT ACC TTG TTA CGA CTT-3'，即序列表中 SEQ ID N0.3)。
[0063]PCR 反應(yīng)體系 25μ L:2XTaq PCR Mixl2.5 μ L，引物 27F1 μ L，引物 1492R1 μ L，ddH208.5 μ L，DNA 模板 2 μ L。
[0064]PCR 程序:94°C 5min ；94°C 40s, 55°C 40s, 72°C 90s, 30 個循環(huán)；72°C IOmin0
[0065]PCR結(jié)束后采用1%瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物為1.5kb，經(jīng)純化回收后連接到T載體上克隆，經(jīng)藍白篩選后提取質(zhì)粒，將其送至中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司測序，測序結(jié)果顯示具有序列表中SEQ ID N0.1的核苷酸序列，將其用DNAMAN version5.2.2和BLAST軟件與GenBank中的序列進行同源性比對,發(fā)現(xiàn)該菌與奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)的同源性最高,達到99%。
[0066]實施例3:奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)JZB42C001菌株形態(tài)特征及生理生化特征測定
[0067]將純化后的菌株JZB42C001接種在LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h后電鏡觀察菌株形態(tài)特征，取純化的菌株生長的對數(shù)期進行革蘭氏、莢膜等染色，生理生化特征測定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》。其結(jié)果為:該菌形態(tài)呈明顯的多形性，參見圖3，可為桿狀、球桿狀、球形、絲狀等，大小(0.4~0.6) μ mX (1.0~3.0) μ m,無莢膜,不形成芽孢,有周身鞭毛，革蘭氏陰性，吲哚試驗陰性，明膠液化陽性，硫化氫陽性，其他生理生化特性見表1。
[0068]表1菌株JZB42C001的生理生化特性
[0069]
【權(quán)利要求】
1.一種菊酯類農(nóng)藥降解菌株，該菌株為奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)JZB42C001,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCN0.8585。
2.一種含有權(quán)利要求1所述菌株的菌劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菌劑，其特征在于，該菌劑是通過以下方法獲得的:將純化后的奇異變形桿菌JZB42C001接種于普通液體培養(yǎng)基或LB液體培養(yǎng)基中，在25~30°C、180r/min條件下培養(yǎng)24~48h,然后在4~5°C條件下離心8~12min以收集沉淀物菌體，用0.lmol/L的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液洗滌菌體，再用0.lmol/L的Na2HPO4~KH2PO4緩沖液將菌體稀釋成菌體懸濁液，所述菌體懸濁液即為所述菌劑；其中，所述0.lmol/L的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液的配制如下:按體積比為61:39量取0.2mol/L的Na2HPO4和0.2mol/L的NaH2PO4，混合均勻后調(diào)整pH=7.0，得到0.2moI/LNa2HPO4-KH2PO4緩沖液；然后用蒸餾水將 0.2moI/LNa2HPO4-KH2PO4 緩沖液稀釋成 0.1moVLNa2HPO4-KH2PO4 緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的菌劑，其特征在于，所述菌劑中奇異變形桿菌JZB42C001的濃度為 1.0XlO7CFU.mL'
5.權(quán)利要求1所述菌株在降解殘留菊酯方面的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2-4任一所述菌劑在降解殘留菊酯方面的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用的具體方法如下:將菌劑均勻噴灑于被處理物表面，其中菌劑使用濃度為0.5-5.0X107CFU/g，所述菌劑在25~30°C條件下于所述被處理物表面停留1-10天。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述菌劑在所述被處理物表面停留4-6天。
9.權(quán)利要求5-8任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述菊酯選自三氟氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯和高效氯氰菊酯中的一種或多種。
【文檔編號】C12R1/37GK103911319SQ201410088205
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】陳莉, 李文華, 賈春紅, 盧彩鴿, 余蘋中, 朱曉丹, 趙爾成, 賀敏 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院