專利名稱：一種制備甲基萬古霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種制備甲基萬古霉素(M43D) 的方法。
背景技術(shù)：
甲基萬古霉素(M43D)是K. E. Merkel等1985年在東方擬無枝酸菌 Amycolatopsisorientalis NRRL2450中作為萬古霉素的小組份而被發(fā)現(xiàn)的。如圖1所示， M43D是一種糖肽類抗生素，結(jié)構(gòu)與萬古霉素類似，在N端一位氨基酸的氮上比萬古霉素多 一個(gè)甲基，對革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的抗菌活性。 2000年，D. P. O'Brain等克隆了萬古霉素類似物chloroeremomycin的生物合成基 因簇中的N端甲基轉(zhuǎn)移酶，并以去甲萬古霉素，去甲萬古霉素七肽骨架等為底物進(jìn)行催化 反應(yīng)。在以去甲萬古霉素七肽骨架為底物的催化反應(yīng)中，除了得到單甲基化的萬古霉素七 肽骨架外，還發(fā)現(xiàn)了少部分可能是雙甲基化的產(chǎn)物，但未繼續(xù)研究。而在以去甲萬古霉素為 底物的反應(yīng)中，只發(fā)現(xiàn)了單甲基化的產(chǎn)物即萬古霉素，卻并未發(fā)現(xiàn)雙甲基化的產(chǎn)物。因此， M43D只能由Amycolatopsis oriental is NRRL2450菌株發(fā)酵所得，且M43D在該菌株的產(chǎn)物 中為小組分，難以大量制備。 在申請?zhí)枮?00710036861.5的中國發(fā)明專利申請中，本申請的發(fā)明人公開了萬 古霉素生物合成基因簇中的26個(gè)基因，其中的vcml2基因編碼N-甲基轉(zhuǎn)移酶。該酶主要 負(fù)責(zé)催化甲基轉(zhuǎn)移到萬古霉素七肽骨架的第一個(gè)氨基酸亮氨酸的N端氮原子上，是萬古霉 素生物合成途徑中的一個(gè)重要的后修飾酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種制備M43D的方法，以用于生產(chǎn)M43D。 本發(fā)明提供的制備M43D的方法為利用N甲基轉(zhuǎn)移酶催化去甲萬古霉素或萬古霉
素制備M43D。 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明中使用的N甲基轉(zhuǎn)移酶通過發(fā)酵表達(dá)N甲 基轉(zhuǎn)移酶的菌株獲得。 進(jìn)一步地，所述N甲基轉(zhuǎn)移酶由萬古霉素生物合成基因簇中編碼N-甲基轉(zhuǎn)移酶的 vcml2基因編碼；所述編碼N-甲基轉(zhuǎn)移酶的vcml2基因來源于東方擬無枝酸菌ATCC43491。
本發(fā)明提供的M43D的制備方法，可用于工業(yè)化生產(chǎn)M43D。


圖1是M43D與萬古霉素的結(jié)構(gòu)圖，其中，R二CH3，當(dāng)R1 二H時(shí)，為萬古霉素；當(dāng)R1 =CH3時(shí)，為M43D。 圖2是菌株E.coli BL21(DE3)/pLYLH13誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體的電泳檢測結(jié)果，其 中，泳道1是細(xì)胞破碎液沉淀的電泳結(jié)果，泳道2是細(xì)胞破碎液上清的電泳結(jié)果。
圖3是以去甲萬古霉素為底物的催化反應(yīng)的HPLC檢測結(jié)果，其中，(1)是萬古霉素 標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC檢測結(jié)果；(2)E. coli BL21 (DE3) /pLYLH13的粗酶液催化的反應(yīng)的HPLC檢 測結(jié)果；(3)E. coli BL21 (DE3)/pET30a(+)的粗酶液催化的反應(yīng)的HPLC檢測結(jié)果。
圖4是M43D的質(zhì)譜檢測結(jié)果。 圖5是M43D的NMR檢測結(jié)果，其中，圖5a是M43D的tfNMR圖譜，圖5b是M43D的 C13NMR圖譜。 圖6是以萬古霉素為底物的催化反應(yīng)的HPLC檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí) 驗(yàn)室手冊》(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件進(jìn)行。
本發(fā)明使用的菌株和質(zhì)粒分別為 pMD18-T Simple Vector,具有ampK，購于TaKaRa公司。pET30a (+)，具有T7promoter， T7teminater， kanK，購于N0VAGEN。 大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，具有F— ompT hsdSB(rB— mB—) gal dcm(DE3)，購于
麗AGEN。 大腸桿菌E. coli DH5a ，購于TaKaRa公司。 本發(fā)明使用到的LB培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物10g/L， NaCl 5g/ L， pH7. 4。 向LB培養(yǎng)基中加入20g/L瓊脂粉即得LB固體培養(yǎng)基。 本發(fā)明使用的酶制劑均購自TaKaRa公司；DNA Marker均為Fermentase的 GeneRulerTM lkb DNA ladder ;蛋白質(zhì)Marker均為TaKaRa公司的Protein Molecular WeightMarker(Low);胰蛋白胨，酵母抽提物購自O(shè)xoid公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn) 口分裝。 本發(fā)明先通過PCR反應(yīng)克隆得到萬古霉素生物合成基因簇中的N端甲基轉(zhuǎn)移酶基 因vcml2，然后將vcml2基因片段連接到pET30a (+)載體中，獲得vcml2表達(dá)載體pLYLH13。 然后將pLYLH13轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E. coli BL21(DE3)中，獲得目的表達(dá)菌株E. coliBL21 (DE3) / pLYLH13，將其發(fā)酵并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到N端甲基轉(zhuǎn)移酶，用于轉(zhuǎn)化去甲萬古霉素和萬古霉 素，以制備M43D。 實(shí)施例1、 vcml2基因片段制備
1. 1、引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)東方擬無枝酸菌ATCC 43491的基因序列，設(shè)計(jì)基因vcml2的上下游引物P7 和P8，以用于擴(kuò)增vcml2基因片段，引物P7和P8的序列分別如下所示
P7 :CATATGACCGATCAACTGGACCGC ;
P8 :AAGCTTCTTCGCGTCTGCCGTGAC。 其中，引物P7和P8的下劃線部分分別為在引物序列上引入的Ndel和HindIII酶 切位點(diǎn)。
1.2、PCR擴(kuò)增 抽提東方擬無枝酸菌ATCC 43491的基因組，作為模板，以引物P7和P8為引物對， 通過PCR擴(kuò)增制備vcml2基因片段，具體如下 PCR反應(yīng)體系(50iiL)為0.5iimol/L每條引物，lXBuffer，50iimol/L dNTPs， 5%DMS0，2.5U Ex Taq聚合酶，Mg2+1. 5mmol/L。 PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性2min ;94。C變性45s， 50。C退火45s， 72。C延伸60s， 30 個(gè)循環(huán)；72"C延伸5min。 取上述PCR產(chǎn)物，然后參考使用手冊，使用杭州維特潔生化技術(shù)有限公司的純化 試劑盒，純化獲得的PCR產(chǎn)物約為850bp，經(jīng)測序?yàn)関cml2基因片段。
^MMl、構(gòu)建vcml2基因的表達(dá)載體和表達(dá)菌株 根據(jù)TaKaRa公司的產(chǎn)品說明，將步驟1. 2中獲得的vcml2基因片段連接到 pMD18-TSimple Vector中，并轉(zhuǎn)化到宿主E. coli DH5 a中，抽提質(zhì)粒并測序。結(jié)果顯示，得 到的載體pLYLH12中含有目的基因vcml2。 用限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII酶切pLYLH12，純化得到約850bp的目的片段。同
時(shí)用限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII酶切pET30a(+)，純化得到約5. 4kb的片段。連接兩片
段，得到vcml2基因的表達(dá)載體pLYLH13，然后將表達(dá)載體pLYLH13轉(zhuǎn)化到表達(dá)載體E. coli
BL21(DE3)中，得到vcml2基因的表達(dá)菌株E. coli BL21 (DE3)/pLYLH13。 同時(shí)將質(zhì)粒pET30a(+)轉(zhuǎn)化到表達(dá)載體E. coli BL21 (DE3)中，得到菌株
E. coliBL21 (DE3)/pET30a，用于酶催化反應(yīng)時(shí)做對照。 實(shí)施例3、 N甲基轉(zhuǎn)移酶的誘導(dǎo)表達(dá) 挑新鮮的表達(dá)菌株E. coli BL21 (DE3) /pLYLH13的單克隆到添加含50Tg/ml卡那霉
素的LB培養(yǎng)基中，于37t:過夜培養(yǎng)。取lml菌液加入到含50Tg/ml卡那霉素的100ml LB
中，培養(yǎng)到0D6。。為0. 6 0. 8后，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，于30。C誘導(dǎo)4h。 離心收集菌體，超聲破碎后，離心收集上清，蛋白電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)
圖2的結(jié)果，上清中含有目標(biāo)蛋白N甲基轉(zhuǎn)移酶。 實(shí)施例4、轉(zhuǎn)化去甲萬古霉素 4. 1、轉(zhuǎn)化去甲萬古霉素 使用步驟3中獲得的E. coli BL21 (DE3)/pLYLH13破碎離心后所得的粗酶液上清 催化去甲萬古霉素，具體如下 反應(yīng)體系為(lml) :2mM腺苷甲硫氨酸(SAM) 100 yl ， 0. 5mg/ml去甲萬古霉素 (dmV2)300 ii l，粗酶液100 ii l，緩沖體系為Tris/HCl (50mM， PH 7. 5)。
反應(yīng)條件為25 °C ，反應(yīng)24hr 。 同時(shí)，按步驟3和4. l中的方法，以E. coli BL21(DE3)/pET30a處理去甲萬古霉素， 作為對照。 4. 2、HPLC檢測反應(yīng)結(jié)果 使用HPLC檢測步驟4. 1中獲得的反應(yīng)液，同時(shí)以步驟3中的對照反應(yīng)液以及萬古 霉素標(biāo)準(zhǔn)品為HPLC檢測的對照，具體方法如下 流動相配制用0. 2%的三乙胺溶液，磷酸調(diào)pH至3. 2作為緩沖液。緩沖液與 乙睛和四氫呋喃按92 : 7 : 1的比例混合，搖勻，作為A液；緩沖液與乙睛和四氫呋喃按70 : 29 : 1的比例混合，搖勻，作為B液，A液和B液的加入方式如表l所示。 色譜條件 色譜柱:DiamonsilTM C18， ODS， ID 4. 6*200mm 柱溫40。C 檢測器DAD(HP1100)檢測器 檢測波長240nm 流速lml/min 進(jìn)樣量5ul 洗脫方法梯度洗脫。 表1、 A液和B液的加入方式
洗脫時(shí)間(min)01322262735
A(%)10010000100100
B(%)0010010000 檢測結(jié)果如圖3所示，根據(jù)圖3結(jié)果，反應(yīng)中沒有去甲萬古霉素的峰，卻多了兩個(gè) 峰，這兩個(gè)新的峰一個(gè)在7min左右，與標(biāo)準(zhǔn)品比對后應(yīng)該為萬古霉素。而另一個(gè)在12min 的峰為一未知的峰，將該物質(zhì)命名為化合物X，而以E. coli BL21 (DE3)/pET30a為對照所得 的結(jié)果中卻只有去甲萬古霉素，而無其他的萬古霉素類似物。
4. 3、化合物X的結(jié)構(gòu)確認(rèn) 參考U. S. Patent :4547488中提供的方法，分離純化化合物X，并進(jìn)行質(zhì)譜和NMR 檢領(lǐng)"結(jié)果如圖4和圖5所示。 圖4結(jié)果顯示，化合物X的分子量為1461，與M43D的分子量相同。 根據(jù)圖4的質(zhì)譜檢測結(jié)果和圖5的tfNMR和C13NMR圖譜的結(jié)果，并參考圖3，可以
確定化合物X為M43D。 實(shí)施例5、轉(zhuǎn)化萬古霉素 按步驟4. 1中的方法，使用步驟3中獲得的E. coli BL21(DE3)/pLYLH13破碎離心 后所得的粗酶液上清催化萬古霉素，并收集反應(yīng)液上清，其中，將實(shí)施例4的反應(yīng)體系中去 甲萬古霉素使用萬古霉素替代，作為反應(yīng)的底物。 按步驟4. 2中的方法，使用HPLC檢測反應(yīng)液上清，檢測結(jié)果溶液圖6所示，將保留 時(shí)間為12min的物質(zhì)命名為化合物Y。 按步驟4. 3中的方法，分離純化化合物Y，并對化合物Y進(jìn)行質(zhì)譜和NMR檢測。
根據(jù)檢測結(jié)果，化合物Y為M43D。 綜上所述，本發(fā)明提供了一種M43D的制備方法，使用該方法可工業(yè)化生產(chǎn)M43D。
權(quán)利要求
一種制備甲基萬古霉素的方法，其特征在于，所述方法利用N甲基轉(zhuǎn)移酶催化去甲萬古霉素或萬古霉素制備甲基萬古霉素。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述N甲基轉(zhuǎn)移酶通過發(fā)酵表達(dá)N甲基轉(zhuǎn)移 酶的菌株獲得。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述N甲基轉(zhuǎn)移酶由萬古霉素生物合成 基因簇中編碼N-甲基轉(zhuǎn)移酶的vcml2基因編碼。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述編碼N-甲基轉(zhuǎn)移酶的vcml2基因來源 于東方擬無枝酸菌ATCC 43491。
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)N甲基轉(zhuǎn)移酶的菌株包含表達(dá) vcml2基因編碼的蛋白的質(zhì)粒。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)粒包含vcml2基因片段和合適的載體。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述載體為pET30a(+)。
8. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)N甲基轉(zhuǎn)移酶的菌株的DNA中包含 vcml2基因片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種制備甲基萬古霉素的方法。本發(fā)明提供的方法是利用萬古霉素生物合成基因簇中的N甲基轉(zhuǎn)移酶催化去甲萬古霉素或萬古霉素制備甲基萬古霉素。本發(fā)明提供的制備方法，可用于工業(yè)化生產(chǎn)甲基萬古霉素。
文檔編號C12N15/63GK101724673SQ20081020190
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月29日
發(fā)明者夏興, 姜衛(wèi)紅, 戈梅, 朱麗, 李航, 楊天, 楊志鈞, 楊晟, 殷瑜, 王天嬌, 羅敏玉, 阮林高, 陳代杰, 魏維, 黃鶴, 齊曉丹 申請人:上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司;浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠