一種制備(s)-n-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種由生物催化技術(shù)制備（S)-N-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶的方法，屬 于生物制藥工業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] (S)-N-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶是一種重要的藥物中間體，被廣泛應(yīng)用于鎮(zhèn)痛、 抗精神病、抗腫瘤等藥物的合成，如藥物依魯替尼。該藥物于2013年底在美國上市，保守預(yù) 計(jì)2018年全球銷售額可以達(dá)到23. 2億美元。
[0003] 目前，光學(xué)活性的（s) -N-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶化合物可通過化學(xué)或酶促方法 拆分外消旋體獲得。但是拆分方法的局限性在于最大理論收率為50%，分離提取也較為繁 瑣（USpatent2011092698Al，W02011036280Al)〇
[0004] 生物催化羰基不對稱還原，其最大理論產(chǎn)率及對映體過量值為100%，且反應(yīng)體系 簡單，綠色環(huán)保，是手性醇生產(chǎn)的重要方法之一。目前已發(fā)掘的制備該中間體的生物催化劑 大多來自于生物離體組織（如磨碎的野生胡蘿卜根），細(xì)菌，真菌等，也有重組羰基還原酶 生物催化的報(bào)道。然而，這些催化劑大多獲取困難，立體選擇性不高，底物耐受性差，轉(zhuǎn)化率 較低，從而導(dǎo)致時(shí)空產(chǎn)率低，沒有良好的工業(yè)化經(jīng)濟(jì)效益（〇rg.Lett. 2009,11，1245-1248 ; OPRD.2014, 18,827-830 ;CN104603278A，CN103276027A，CN103923957A，CN103571908A， CN103131734A,W02013190341A1)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在提供一種尚廣率，尚立體選擇性及尚時(shí)空廣率的幾基還原酶催化如手 性酮N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮制備（S) -N-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶的方法，以滿足工業(yè) 化生產(chǎn)需求。
[0006] 本發(fā)明涉及用于制備式（I)的化合物方法：
[0007]
[0008] (S) 叔丁氧幾基羥基呢陡
[0009] 所述方法包括在還原型輔酶或者輔酶再生體系（包括氧化型輔酶，氫供體及偶聯(lián) 酶）存在的情況下，用羰基還原酶還原式（II)的化合物：
[0010]
[0011] N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮
[0012] 式（II)的化合物（在本文中也稱為"底物"）在本領(lǐng)域是已知的。
[0013] 本發(fā)明生物催化體系為：羰基還原酶、輔酶、底物、緩沖液。
[0014] 在本發(fā)明中使用的羰基還原酶為ChKRED03 (NCBI登錄號為KC342003)， ChKRED08(NCBI登錄號為KC342008)，ChKRED23(NCBI登錄號為KC342023)或者 ChKRED26 (NCBI登錄號為KC342026)。根據(jù)本領(lǐng)域一般常識，上述羰基還原酶可通過商業(yè)化 的全基因合成服務(wù)得到。
[0015] 根據(jù)本領(lǐng)域的一般常識，反應(yīng)體系中可以用上述羰基還原酶構(gòu)建的重組酶的休止 細(xì)胞、粗酶液、純酶或者粗酶粉等。為獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，優(yōu)選使用粗酶液。羰基還原酶 的用量與底物用量比率優(yōu)選為1%~6% (w/w)(羰基還原酶以粗酶液的總蛋白量計(jì)）。
[0016] 本發(fā)明的輔酶可以為NADH或者NADPH或者構(gòu)建一個(gè)可以產(chǎn)生這兩種還原型輔酶 之一的輔酶再生體系。
[0017] 本發(fā)明優(yōu)選的輔酶再生體系為：葡萄糖脫氫酶GDH、氧化型輔酶NADP+、葡萄糖。葡 萄糖脫氫酶為1~30U/mL，NADP+用量與底物用量比率為0. 2%~0. 9% (w/w)，葡萄糖的物 質(zhì)的量為底物物質(zhì)的量的1. 1~3倍。
[0018] 本發(fā)明的底物為：N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮。底物優(yōu)選加入助溶劑后添加到反應(yīng) 體系中，所述助溶劑是二甲亞砜、甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮，濃度優(yōu)選5%~25% (v/v)。根 據(jù)本發(fā)明的有利實(shí)施例，助溶劑最優(yōu)選于甲醇。
[0019] 反應(yīng)體系中底物終濃度優(yōu)選1~250g/L。
[0020] 本發(fā)明緩沖液優(yōu)選Tris-HCl緩沖液，磷酸鹽緩沖液；緩沖液的pH優(yōu)選6. 0~8. 0 ; 緩沖液濃度優(yōu)選〇. 1M;
[0021] 本發(fā)明反應(yīng)溫度優(yōu)選20°C~40°C，轉(zhuǎn)速優(yōu)選100~200rpm。
[0022] 根據(jù)上述優(yōu)選體系（合成路線見說明書附圖1)，所述制備方法的實(shí)施過程如下： 將底物充分溶解在甲醇中，然后加入到緩沖液中，攪拌均勻后，加入重組羰基還原酶，葡萄 糖脫氫酶、氧化型輔酶、葡萄糖，維持在20°C~40°C，TLC或HPLC監(jiān)控，至反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到 99%以上，用甲基叔丁基醚終止反應(yīng)。
[0023] 在反應(yīng)過程中，通過定期監(jiān)測并添加常規(guī)的堿性試劑（例如碳酸鈉和氫氧化鈉） 將反應(yīng)體系的pH值保持在6. 0~8. 0的范圍。
[0024] 反應(yīng)終止后，向反應(yīng)液中加入硅藻土攪拌，過濾，濾液用甲基叔丁基醚萃取，濾餅 返回反應(yīng)釜，加入甲基叔丁基醚攪拌過濾兩次，合并有機(jī)相；用飽和食鹽水洗滌2~3次， 濃縮后得到淺黃色油狀物，加石油醚于淺黃色油狀物中，于45 °C~50 °C下攪拌至均相， 于-10°C~20°C下靜置，過濾后得到（S)-N-叔丁氧羰基-1-羥基哌啶。
[0025] 本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相矛盾 的特征和/或步驟外，均可以以任何方式組合。
[0026] 本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢：
[0027] 本發(fā)明方法采用特定催化劑，成功制備出光學(xué)純度高的（S) -N-叔丁氧羰基-3-羥 基哌啶。該方法反應(yīng)條件溫和，水相反應(yīng)，反應(yīng)效率高，操作簡單。特別的，反應(yīng)底物濃度 可提高至200g/L以上，反應(yīng)時(shí)間3h，轉(zhuǎn)化率>99%，ee值99. 6%，時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到1600g/L/ d以上。且20g的制備級規(guī)模，可實(shí)現(xiàn)回收率88%以上。該生物催化工藝大大提高了制備 (S)-N-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶的效率并大幅降低了生產(chǎn)成本，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià) 值。
【附圖說明】
[0028] 圖1為本發(fā)明的合成路線；
[0029] 圖2為實(shí)施例3中，反應(yīng)lh取樣所得樣品的HPLC圖譜；
[0030] 圖3為實(shí)施例3中，反應(yīng)2. 5h取樣所得樣品的HPLC圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施 例。
[0032] 實(shí)施例1重組羰基還原酶粗酶液的制備
[0033] 本發(fā)明的生物催化劑可采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法來制備。
[0034] 羰基還原酶重組菌的構(gòu)建：將含有羰基還原酶基因的片段及pET28a質(zhì)粒進(jìn)行相 同限制性內(nèi)切酶雙酶切，經(jīng)連接并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coliBL21(DE3)菌株，篩選 得到陽性克隆子，接種到含卡那霉素抗性（50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基活化過夜（37°C， 220rpm)制備種子液。將種子液以1%接種量轉(zhuǎn)接到100mL含卡那霉素抗性（50yg/mL)的 LB液體培養(yǎng)基，37 °C、220rpm振蕩培養(yǎng)至0D6。。介于(λ6~(λ8時(shí)，加入IPTG(0· 5mM)于20°C 繼續(xù)培養(yǎng)過夜。離心收集細(xì)胞，用10mL磷酸鹽緩沖液（0. 1M，pH7.0)懸浮細(xì)胞。細(xì)胞懸浮 液置于冰浴中超聲破碎15分鐘（超聲時(shí)間：4s，間隙時(shí)間：5s，工作次數(shù)：99次）。若大量 制備，可采用高壓均質(zhì)機(jī)破碎。隨后冷凍離心，上清液于液氮中快速冷凍，于_80°C冰箱保存 備用。
[0035] 實(shí)施例2羰基還原酶生物催化
[0036] 在10mL反應(yīng)瓶中加入一定量底物及50μL甲醇，然后依次加入0.lmL的磷酸鉀緩 沖液（1Μ，ρΗ7. 0)，0.lmL重組羰基還原酶粗酶液（30mg/mL，6. 27U/mg)，0. 025mLNADP+溶液 (貯存液濃度40mM)，0·lmL葡萄糖脫氫酶粗酶液（30mg/mL，lOU/mg)，0· 3mL葡萄糖漿（貯存 液濃度100%，w/v)，補(bǔ)足水至lmL，混勻后，在30°C下磁力攪拌反應(yīng)，每15分鐘用1M氫氧 化鈉溶液將反應(yīng)體系pH調(diào)至6. 5~7. 0。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行HPLC分析，檢測結(jié)果如下：

[0038] 實(shí)施例3百毫克級制備工藝
[0039] 在10mL反應(yīng)瓶中加入150mg底物及50yL甲醇，然后依次加入0·lmL的磷酸 鉀緩沖液（1M，pH7. 0)，0.lmL重組羰基還原酶ChKRED03粗酶液（30mg/mL，4. 5U/mg)， 0. 025mLNADP+溶液（貯存液濃度40mM)，0.lmL葡萄糖脫氫酶粗酶液（30mg/mL，10U/mg)， 0· 18mL葡萄糖漿（貯存液濃度100%，w/v)，補(bǔ)足水至lmL，混勻后，在30°C下磁力攪拌反 應(yīng)，每15分鐘用1M氫氧化鈉溶液將反應(yīng)體系pH調(diào)至6. 5~7. 0。反應(yīng)lh及2. 5h后取 樣進(jìn)行HPLC分析，圖譜分別見說明書附圖2和圖3。說明書附圖2中保留時(shí)間14. 040min 為（S)-N-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶，保留時(shí)間15. 443為R構(gòu)型，保留時(shí)間28. 235min為 底物；說明書附圖3中保留時(shí)間14. 030min為⑶-N-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶，保留時(shí)間 15. 442min為R構(gòu)型，保留時(shí)間28. 374min為底物。計(jì)算得到最終轉(zhuǎn)化率為98. 4%。
[0040] 實(shí)施例4十克級制備工藝
[0041] 在500mL反應(yīng)瓶中加入20g底物及5mL甲醇，然后依次加入10mL的磷酸鉀緩沖液 (1M，pH7. 0)，10mL重組羰基還原酶ChKRED03 粗酶液（30mg/mL，6. 27U/mg)，2. 5mLNADP+溶 液（貯存液濃度40mM)，lOmL葡萄糖脫氫酶粗酶液（30mg/mL，lOU/mg)，24mL葡萄糖漿（貯 存液濃度l〇〇%，w/v)，補(bǔ)足水至100mL，混勾后，在30°C下磁力攪拌反應(yīng)lh及3h后取樣進(jìn) 行HPLC分析，最終轉(zhuǎn)化率為99. 1 %。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于制備式⑴的化合物的方法：所述方法包括在還原型輔酶或輔酶再生體系存在的情況下，用羰基還原酶還原式（II) 的化合物：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所用羰基還原酶為ChKRED03,其NCBI登 錄號為 KC342003 ;ChKRED08,其 NCBI 登錄號為 KC342008 ;ChKRED23,其 NCBI 登錄號為 KC342023 ;或者 ChKRED26,其 NCBI 登錄號為 KC342026。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于底物先溶解于助溶劑中，所述助溶劑是二 甲亞砜、甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述還原型輔酶NADH或NADPH。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于輔酶再生體系包括氧化型輔酶，氫供體及 偶聯(lián)酶。6. 根據(jù)權(quán)利要求1和5所述的方法，其特征在于輔酶再生體系為葡萄糖脫氫酶GDH、氧 化型輔酶NADP+、葡萄糖。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種羰基還原酶生物催化N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮制備(S)-N-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶的方法。本發(fā)明方法反應(yīng)條件溫和，轉(zhuǎn)化效率高，立體選擇性高，產(chǎn)物ee值99.5％以上。底物的濃度可提高到250g/L，時(shí)空產(chǎn)率最高可達(dá)到1600g/L/d，極大地提高了生產(chǎn)效率，具有重要的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C12P17/12
【公開號】CN105420307
【申請?zhí)枴緾N201510867063
【發(fā)明人】吳中柳, 許光鵬, 劉艷, 裴小瓊
【申請人】中國科學(xué)院成都生物研究所
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月2日