專(zhuān)利名稱(chēng)：一種癌胚抗原(cea)熒光定量rt-pcr引物和探針及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)基因的mRNA表達(dá)。

背景技術(shù)：
惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是臨床治療的一大難題，也是惡性腫瘤致死的一個(gè)重要原因。及早發(fā)現(xiàn)并作出診斷，對(duì)腫瘤的臨床治療方案選擇有著很重要的意義，可以極大地提高患者的生存率。目前腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)和確定，主要靠臨床及病理資料，根據(jù)影像學(xué)(如X光片、CT、磁共振、PET等)或病理形態(tài)來(lái)診斷。但要使影像學(xué)檢查中能夠發(fā)現(xiàn)病灶，需要一定大小轉(zhuǎn)移灶的形成、能夠被儀器成像且有效分辨；要使病理形態(tài)上判斷出細(xì)胞惡變與否，則一定要取得合適的檢測(cè)標(biāo)本，且有相當(dāng)數(shù)量的可觀察的腫瘤細(xì)胞存在。從這一點(diǎn)上講，無(wú)論是影像學(xué)診斷還是病理學(xué)診斷，都是腫瘤形成及轉(zhuǎn)移后相當(dāng)晚期、有了大量惡變細(xì)胞積累的階段，如果在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移早期，在病理上可觀察到或轉(zhuǎn)移灶形成前就發(fā)現(xiàn)，并確定轉(zhuǎn)移，則可以指導(dǎo)臨床治療方案的設(shè)計(jì)，并提供有力的預(yù)后依據(jù)。
血道轉(zhuǎn)移是腫瘤擴(kuò)散的主要途徑之一，因此在患者外周血中進(jìn)行腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)檢測(cè)、腫瘤特異性標(biāo)記產(chǎn)物檢測(cè)是了解腫瘤轉(zhuǎn)移情況的一個(gè)有效方式，因此，腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)對(duì)腫瘤形成及轉(zhuǎn)移的具有極大的幫助。但在腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的早期，外周血中的腫瘤細(xì)胞非常小，無(wú)法完成依賴(lài)病理形態(tài)檢查，同時(shí)，腫瘤特異性抗原的含量也很少，也很難通過(guò)常用的酶標(biāo)免疫吸附分析或放射免疫分析等方法檢測(cè)到，因此，對(duì)循環(huán)血中微量腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)和一些特異性產(chǎn)物檢測(cè)的研究已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。
目前腫瘤發(fā)病率和死亡率居高不下，某些惡性腫瘤還有上升的趨勢(shì)。如能對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移患者早期發(fā)現(xiàn)，對(duì)進(jìn)一步治療文案的制定都有非常重要的意義，是提高腫瘤的治愈率重要途徑之一。對(duì)我國(guó)醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展有極重要的初會(huì)意義與經(jīng)濟(jì)意義。因此，我們致力于開(kāi)發(fā)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移早期檢測(cè)及診斷技術(shù)，以解決臨床治療后大難題。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展及其在醫(yī)學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)外周血中微量腫瘤細(xì)胞早已得到應(yīng)用，特別是熒光定量PCR的出現(xiàn)，有著無(wú)法比擬的高靈敏度和特異性。由于熒光定量PCR具有重復(fù)性好，靈敏度高，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)，所以醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面，一些常規(guī)檢測(cè)方法所不能解決的問(wèn)題得到了解決。例如，細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查可直接觀測(cè)到腫瘤細(xì)胞，但由于腫瘤脫落至血循環(huán)中的數(shù)目微小，這種檢查的敏感性和特異性均較差，陽(yáng)性率低。免疫組織化學(xué)方法提高了血循環(huán)中腫瘤細(xì)胞染色的特異性，特別是單克隆抗體的應(yīng)用使染色的特異性和敏感性有了較大的改善，可查出104-105個(gè)有核細(xì)胞中的一個(gè)腫瘤細(xì)胞。但該技術(shù)則需要特異性的抗體，生產(chǎn)相對(duì)復(fù)雜。同時(shí)，假陽(yáng)性限制了此項(xiàng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用。與這些技術(shù)相比，熒光定量PCR技術(shù)有著明顯的優(yōu)點(diǎn)，由于大多數(shù)基因的調(diào)節(jié)發(fā)生于轉(zhuǎn)移水平，有些腫瘤可轉(zhuǎn)錄特異性mRNA，但無(wú)相應(yīng)蛋白合成，故熒光定量PCR應(yīng)用范圍較廣；PCR簡(jiǎn)便易行，只要知道待測(cè)基因序列，即可設(shè)計(jì)合成引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增；該方法具有較高的靈敏度及可重復(fù)性，也保證了醫(yī)學(xué)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。所以該技術(shù)的應(yīng)用，將會(huì)對(duì)早期尋找腫瘤患者血循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移，對(duì)于指導(dǎo)臨床治療、改善患者預(yù)后產(chǎn)生極為重要的作用。
癌胚抗原(CEA)是消化道腫瘤特異性較高的腫痛相關(guān)抗原，它來(lái)自于上皮類(lèi)腫瘤細(xì)胞，而在正常人外周血及其它組織、體液中無(wú)CEA mRNA的表達(dá)。因此，檢測(cè)患者的外周血、胸腹水、穿刺液、骨髓等標(biāo)本中有無(wú)CEA mRNA的表達(dá)，可以對(duì)腫瘤的診斷的治療提供有力證據(jù)，還可以對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)情況以及療效觀察提供幫助。以往對(duì)CEA mRNA的檢測(cè)采用的是定性RT-PCR法，其特異性相對(duì)比較差，且無(wú)法精確定量。熒光定量RT-PCR技術(shù)及相應(yīng)的熒光定量PCR儀的推出使得人們可以在利用PCR高靈敏度的情況下，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)精確定量檢測(cè)，不僅解決了PCR的定量問(wèn)題，而且還大大提高了檢測(cè)特異性。


發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問(wèn)題 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR引物和探針及試劑盒，以克服現(xiàn)有技術(shù)對(duì)早期腫瘤患者外周血等癌胚抗原(CEA)mRNA表達(dá)水平的定量檢測(cè)準(zhǔn)確性差、靈敏度低、檢測(cè)速度慢，不利于根據(jù)CEA mRNA表達(dá)及時(shí)治療的缺陷。
技術(shù)方案 本發(fā)明是生物技術(shù)領(lǐng)域的一種通過(guò)對(duì)新鮮抗凝外周血提取總RNA，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄mRNA樣品得到cDNA，再結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，可準(zhǔn)確定量檢測(cè)標(biāo)本中CEA mRNA表達(dá)量。
本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一組癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR引物和探針，包括如下序列 癌胚抗原(CEA)上、下游引物 上游引物為SEQ ID NO15’-AATAAC GGG ACC TAT GCC TGT T-3’ 下游引物為SEQ ID NO25’-GAAACTACA CCA GGG CTG CTA-3’ 癌胚抗原(CEA)檢測(cè)探針為SEQ ID NO4 5’-FAM-AGC AAC CCC AAC CAG CAC TCC AA-TAMRA-3’； 或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長(zhǎng)的序列； 或者與上述序列同源性大于85％的序列； 或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
上述的一組CEA mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物和探針的優(yōu)選技術(shù)方案為，其序列組還包括內(nèi)參基因葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)的引物和探針 G6PDH內(nèi)參基因上、下游引物 上游引物SEQ ID NO45’-GGG CCA GTA CCA GTC TTA CA-3’ 下游引物SEQ ID NO55’-CCA GCG AAG GTT GTC AAT GT-3’ G6PDH內(nèi)參基因檢測(cè)探針 SEQ ID NO65’-FAM-CCG ACC TTC GCA GCC GTC CTAGT-TAM RA-3’ 或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長(zhǎng)的序列； 或者與上述序列同源性大于85％的序列； 或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種含有上述引物和探針序列的CEAmRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其組成為細(xì)胞裂解液、水、含引物序列SEQ ID NO1-2的CEA RT-PCR反應(yīng)液、內(nèi)參G6PDH RT-PCR反應(yīng)液、含探針序列SEQ ID NO3的CEA檢測(cè)探針、G6PDH基因探針、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。
所說(shuō)的CEA RT-PCR反應(yīng)液組成為RT-PCR緩沖液、MgCl2、CEA上、下游引物、dNTPs、無(wú)RNA酶的水。
上述的CEA mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選技術(shù)方案之一為，所說(shuō)的內(nèi)參G6PDH RT-PCR反應(yīng)液中的引物序列為SEQ ID NO4和5，且所說(shuō)的G6PDH基因探針序列為SEQ ID NO6。
所說(shuō)的G6PDH RT-PCR反應(yīng)液組成為RT-PCR緩沖液、MgCl2、管家基因(G6PDH)上、下游引物、dNTPs、無(wú)RNA酶的水。
上述的CEA mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選技術(shù)方案之二為，所說(shuō)的標(biāo)準(zhǔn)品為如下DNA序列SEQ ID NO7 5’-AATAACGGGA CCTATGCCTG TTTTGTCTCT AACTTGGCTACTGGCCGCAA TAATTCCATA GTCAAGAGCA TCACAGTCTCTGCATCTGGA ACTTCTCCTG GTCTCTCAGC TGGGGCCACTGTCGGCATCA TGATTGGAGT GCTGGTTGGG GTTGCTCTGATATAGCAGCC CTGGTGTAGT TTC-3’ 作為特例，標(biāo)準(zhǔn)品是含有插入CEA特異性保守序列的T載體，該載體可在大腸桿菌DH5a中增殖。
上述的CEA mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選技術(shù)方案之三為，所說(shuō)的水為無(wú)RNA酶的水。
一般，無(wú)RNA酶的水獲得方法為向去離子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至終濃度為0.01％(V/V)，室溫(22-25℃)放置10-12小時(shí)后，121℃，20分鐘高壓，室溫放置備用； 上述的CEA mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選技術(shù)方案之四為，所說(shuō)的陰性對(duì)照為正常人mRNA樣本。
上述的CEA mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選技術(shù)方案之五為，所說(shuō)的陽(yáng)性對(duì)照為含有腫瘤患者mRNA樣本。
上述的CEA mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選技術(shù)方案之六為，所說(shuō)的細(xì)胞裂解液由細(xì)胞裂解液I和細(xì)胞裂解液II組成。
作為特例，細(xì)胞裂解液I組成為320mM蔗糖、5mM MgCl2、1％TritonX-100，10mM Tris-HCl[pH7.5]、水； 作為特例，細(xì)胞裂解液II組成為4M硫氰酸胍、0.75M檸檬酸鈉(pH7.0)和10％月桂?；“彼徕c(Sarcosyl 1g/10mL)、14.3M β-巰基乙醇、2M醋酸鈉(pH4.0)和水飽和酚； 上述各方案中所說(shuō)的逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶在試劑盒中的形式可以為混合兩種酶的混合液。一般而言，DNA聚合酶選用耐熱Taq DNA聚合酶。
上述的CEA mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選技術(shù)方案之六為，每盒中各組分的量為細(xì)胞裂解液I 1瓶24mL、細(xì)胞裂解液II 1瓶6mL、無(wú)RNA酶的水1瓶2mL、CEA RT-PCR反應(yīng)液1管210μL、G6PDH RT-PCR反應(yīng)液1管210μL、CEA檢測(cè)探針1管30μL、G6PDH內(nèi)參基因探針30μL、標(biāo)準(zhǔn)品1管10μL、和陰性對(duì)照品1管10μL。
本試劑盒中的細(xì)胞裂解液(即RNA總提取試劑)應(yīng)于4℃保存，RT-PCR試劑保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。
本發(fā)明還提供所說(shuō)的試劑盒的使用方法如下 首先，每次檢測(cè)目的基因(CEA)和管家基因(G6PDH)均應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
樣品要求
1～2mL抗凝的新鮮外周血或骨髓樣本。
采集靜脈血或骨髓1～2mL于含有抗凝劑的無(wú)菌離心管中，或于無(wú)菌離心管中，使用EDTA作抗凝劑(1.44mg/mL全血)。樣本采集后應(yīng)立即使用，若不能立即使用，可以4℃保存1-2小時(shí)，但時(shí)間不宜再過(guò)長(zhǎng)，否則將影響檢測(cè)結(jié)果。全血經(jīng)處理后，得到的有核細(xì)胞可在-80℃或液氮中保存數(shù)月，不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。
操作步驟
一、總RNA提取 1.將新鮮抗凝全血或骨髓1～1.5mL置于1.5mL Beckman離心管中，4℃下3000g離心10min，棄上清液。
2.在下層細(xì)胞中補(bǔ)滿(mǎn)細(xì)胞裂解液I，混勻，冰浴10min其間再次混勻兩次，溶液變清表明紅細(xì)胞已裂解。
3.4℃下3000g離心10min沉淀有核細(xì)胞，完全棄去含有裂解細(xì)胞的上清液。
4.用細(xì)胞裂解液I重復(fù)裂解1次后(若沉淀中仍有紅細(xì)胞，需重復(fù)此操作1～2次)，傾去上清，吸干管口。
5.在上述沉淀有核細(xì)胞中加入50μL無(wú)RNA酶水，用槍頭抽吸打散形成清亮不粘的溶液，再加入450μL細(xì)胞裂解液II，用移液器反復(fù)吹打混勻，室溫放置5分鐘。
6.加200μL三氯甲烷，用手來(lái)回振蕩混勻15秒，室溫放置5分鐘，4℃15,000rpm離心10分鐘，將上清移入新的離心管。
7.加入等體積異丙醇，旋渦振蕩5秒，室溫沉淀10分鐘，4℃15,000rpm離心5分鐘，棄上清。
8.加入500μL預(yù)冷的75％乙醇洗滌，上下顛倒10次，4℃10,000rpm離心5分鐘，吸干上清，沉淀室溫干燥10-20分鐘，加入20μL無(wú)RNA酶水稀釋混勻，立即使用或-70℃保存。
二、RT-PCR 將裝有CEA RT-PCR反應(yīng)液、內(nèi)參G6PDH RT-PCR反應(yīng)液、CEA檢測(cè)探針、G6PDH管家基因探針、混合酶、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品的離心管從-20℃中取出，置于冰盒上待其緩慢融化后，低速離心，用移液器將上述試劑分別配制目的基因(CEA)和管家基因(G6PDH)RT-PCR反應(yīng)液，混勻，低速離心，置于冰盒上備有。
按下列組成配制RT-PCR反應(yīng)液(30μL體系)

RT-PCR反應(yīng)條件37℃30分鐘；95℃5分鐘；(95℃10秒，60℃60秒，40個(gè)循環(huán))。
三、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 將標(biāo)準(zhǔn)品貯存液(7.5×107copies/μL)梯度稀釋為7.5×106，7.5×105，7.5×104，7.5×103copies/μL，取4μL為模板，同待測(cè)樣品一同進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)定量曲線(xiàn)。
結(jié)果判斷
1.使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的隨機(jī)軟件進(jìn)行文件保存及閾值的設(shè)定。
2.選中不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用相應(yīng)軟件進(jìn)行分析，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及相關(guān)信息。
3.選中樣品所對(duì)應(yīng)有目的基因和管家基因檢測(cè)孔，應(yīng)用相應(yīng)的軟件進(jìn)行分析，得出待測(cè)樣品目的基因和管家基因的起始拷貝數(shù)(即[Copy]sample和[Copy]IPC)。
4.根據(jù)檢測(cè)樣本目的基因和管家基因的起始拷貝數(shù)，計(jì)算基因表達(dá)率，即Expression Ratio＝[Copy]sample/[Copy]IPC。
有益效果 本發(fā)明的試劑盒通過(guò)對(duì)新鮮抗凝外周血有核細(xì)胞提取總RNA，為了排除不同標(biāo)本以及因提取造成在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量和逆轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別而獲得目標(biāo)基因特異性表達(dá)的真正差異，選擇中等豐度表達(dá)，在細(xì)胞標(biāo)本間變異較低的G6PDH作為內(nèi)參照基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，再結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，可同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)標(biāo)本中CEAmRNA的表達(dá)水平，從而能迅速、準(zhǔn)確檢出CEA，為臨床選擇可行的治療方案、預(yù)后判斷以及療效觀察提供重要的參考依據(jù)。
本發(fā)明建立了利用TaqMan技術(shù)檢測(cè)CEA mRNA表達(dá)的方法，并且經(jīng)過(guò)對(duì)消化道腫瘤患者標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，表明該法切實(shí)可行。由于本方法采用了熒光定量PCR，使得CEA mRNA表達(dá)的檢測(cè)敏感性和特異性大大的提高，降低了常規(guī)PCR擴(kuò)增的假陽(yáng)性率，從而使得本發(fā)明可以在極少量的標(biāo)本中獲得足夠的信息。同時(shí)為了排除不同標(biāo)本以及因提取時(shí)造成在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量和逆轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別而獲得目標(biāo)基因特異性表達(dá)的真正差異，通過(guò)篩選確定以中等豐度表達(dá)，在細(xì)胞標(biāo)本間變異較低的G6PDH作為內(nèi)參照基因(也稱(chēng)管家基因)進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化。
在本檢測(cè)項(xiàng)目中，本發(fā)明采用了目前最為先進(jìn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，在保持高敏感性的前提下，盡量減少假陽(yáng)性的干擾。在實(shí)量熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)出現(xiàn)之前，人們對(duì)PCR模板的定量都要通過(guò)PCR產(chǎn)物電泳，再將電泳結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像處理，根據(jù)電泳條帶的高度來(lái)確定最終PCR產(chǎn)物量的多少，或?qū)?biāo)記的PCR產(chǎn)物以ELISA的方式進(jìn)行檢測(cè)，再由此推測(cè)出起始模板的量，但這些方法實(shí)際上都有屬于半定量水平，因?yàn)榧词筆CR條件已最優(yōu)化，電泳及后續(xù)步驟的操作的不穩(wěn)定性仍會(huì)給結(jié)果的分析帶來(lái)影響，從而影響定量這一目的。隨著本發(fā)明實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用，可以真正地做到對(duì)PCR模板的精確定量，這種定量不僅保持了常規(guī)PCR的高敏靈性，而且由于特異性熒光探針雜交技術(shù)的應(yīng)用，使得被子檢測(cè)基因的特異性大大提高。
本發(fā)明的引物、探針和試劑盒采用熒光定量RT-PCR方法，該方法靈敏、特異、重復(fù)性好，結(jié)果用拷貝數(shù)表示，準(zhǔn)確可靠，利于統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。針對(duì)臨床樣品的檢測(cè)顯示該方法靈敏度好，重組質(zhì)粒定量模板，按10倍梯度稀釋?zhuān)蓹z出10個(gè)拷貝，并由此制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性范圍寬(0～107拷貝)，方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性、相關(guān)性好，相關(guān)系數(shù)為0.997。



圖1為樣本標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)圖。
圖2為樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆操作手冊(cè)，或按照制造廠商所建議的條件。所有無(wú)機(jī)化學(xué)試劑和有機(jī)溶劑購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑廠，Trizol試劑購(gòu)自上海生工公司，限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自上海申能博彩生物公司，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、Oligo(dT)15-18均購(gòu)自美國(guó)Promega公司，引物和探針均由上海生工公司合成。Eppendorf梯度式PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，PE7500熒光PCR儀為ABI公司產(chǎn)品。
實(shí)施例1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)腫瘤患者CEA mRNA的表達(dá)及應(yīng)用 一、引物及探針設(shè)計(jì)與合成 以CEA全長(zhǎng)cDNA序列(GenBank登錄號(hào)NM_004363)為模板，使用Oligo軟件分析TaqMan引物和探針的位點(diǎn)，從中選擇最佳組合。
標(biāo)準(zhǔn)品PCR上游引物序列為5’-ACA CAA GTT CTC TTT ATC GC-3’；下游引物序列為5’-TCA CGA TGT TGG CTA GGA T-3’； 檢測(cè)用PCR上游引物序列為5’-AGG AGC CCC GTC ATA GGA AG-3’和5’-GAC CTC AGC TCT TGC ATC AC-3’；下游引物序列為5’-GTG GTAGCC TGA GGA CTT GT-3’； 熒光探針序列為5’-FAM-CTG AAG AGA TAG TGC CCA GCCCTC-TAM RA-3’； 二、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品制備 取患者新鮮外周血，分離外周血有核細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，離心收集細(xì)胞，用Tri zol試劑提取總RNA，取1μgRNA，在25μL總反應(yīng)體系中用Oligo(dT)15-18為引物對(duì)其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，用標(biāo)準(zhǔn)品上、下游引物在Eppendorf梯度式PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃變性5分鐘，再按95℃20秒、57℃20秒、72℃45秒進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，最后于72℃延伸7分鐘后置于4℃。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后送上海超世生物公司進(jìn)行克隆(質(zhì)粒由該公司提供)，并將陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證(由上海英駿公司測(cè)序)。提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，即為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定其濃度并換算成(拷貝數(shù)/體積)。
三、標(biāo)本檢測(cè) 取6例經(jīng)病理確定的消化道腫瘤患者和4例正常人外周血標(biāo)本1.5mL，分離外周外有核細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，離心收集細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA，取4μL RNA提取液，在30μL總反應(yīng)體系中，用檢測(cè)用上、下游引物以及管家基因上、下游引物同時(shí)在PE7500熒光PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件均為37℃保溫30分鐘，94℃變性5分鐘，再按94℃20秒、60℃45秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，同時(shí)加入標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)定結(jié)果經(jīng)儀器處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出檢測(cè)標(biāo)本的CEA mRNA和G6PDH管家基因的拷貝數(shù)，再根據(jù)兩者的拷貝數(shù)計(jì)算CEAmRNA表達(dá)率。
四、結(jié)果 (一)標(biāo)準(zhǔn)品的制備 經(jīng)測(cè)序，上述設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)品完全與預(yù)期相符，回收的標(biāo)準(zhǔn)品片段序列如下 5’-A CACAAGTTCT CTTTATCGCC AAAATCACGC CAAATAATAACGGGACCTAT GCCTGTTTTG TCTCTAACTT GGCTACTGGCCGCAATAATT CCATAGTCAA GAGCATCACA GTCTCTGCATCTGGAACTTC TCCTGGTCTC TCAGCTGGGG CCACTGTCGGCATCATGATT GGAGTGCTGG TTGGGGTTGC TCTGATATAGCAGCCCTGGT GTAGTTTCTT CATTTCAGGA AGACTGACAGTTGTTTTGCT TCTTCCTTAA AGCATTTGCA ACAGCTACAG TCTAAAATTGCTTCTTTACC AAGGATATTT ACAGAAAAGA CTCTGACCAGAGATCGAGAC CATCCTAGCC AACATCGTGA-3’ (二)樣品檢測(cè) 標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。
取6例經(jīng)病理確定的消化道腫瘤患者和4例正常人外周血熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果如下 表達(dá)率(Ratio) 患者編 性年 融合基因 G6PDH 標(biāo)本 (CopyPML/ABL/ 號(hào) 別齡 (copies/mL) (copies/mL) CopyG6PDH) 1 女32外周血1.171*1033.564*102 3.29 2 男47外周血6.142*1025.894*102 1.04 3 女41外周血1.073*1032.149*102 4.99 4 男53外周 2.531*1012.846*101 0.89 5 男38外周 3.719*1024.417*102 0.84 6 女65外周血2.142*1032.782*102 7.70 7 女59外周血-- - 8 男36外周血-- - 9 男29外周血-- - 10 女61外周血-- - 采用同樣的檢測(cè)PCR上、下游引物以及同樣的6例樣本進(jìn)行原位RT-PCR檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)方案如下 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)體系20μL.含200μmol/L dNTPs.1μmoI/L下游引物，RNA酶抑制劑40U和Mo-MLV 20U，反應(yīng)液經(jīng)一個(gè)基因框(GeneFrame，購(gòu)于Advanced Biotechnologies公司)密封在上述玻片中心附有細(xì)胞的區(qū)域，玻片在原位PCR儀(Genius，英國(guó)Techne公司)中42℃反應(yīng)30min，結(jié)束后去除基因框，甩棄反應(yīng)液。
原位PCR反應(yīng)體系25μL，含200μmol/L dNTPs，1μmol/L上、下游引物，4.5mmol/L MgCl2，10μmol/L地高辛標(biāo)記的dUTP和Taq酶5U。反應(yīng)液同樣密封在上述部位，反應(yīng)條件為95℃變性5min后，以94℃變性，58℃退火和72℃延伸各1min，在原位PCR儀上，總共進(jìn)行25循環(huán)。
擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)①洗片2×SSC洗片3次，含0.1％吐溫-20的Buffer I(0.1moI/L Tris-HCI pH7.5，0.15M MgCl2)洗2次，每次5min；含5％牛血清白蛋白(BSA)和3％綿羊血清的Buffer II室溫孵育30min，再用抗地高辛抗體滴片，濕盒內(nèi)37℃孵育2h；②再洗片含0.1％吐溫-20的Buffer I洗3次，BufferII洗1次，BufferIII(0.1mol/L Tris-HCl pH9.5，0.1mol/L NaCl，0.05mol/LMgCl2)洗1次，每次5min；NBT/BCIP避光染色約30min，光鏡下觀察，待顯色適度后水洗終止，蓋上蓋玻片，甘油明膠封片；③結(jié)果判斷細(xì)胞漿中出現(xiàn)藍(lán)紫色顆粒物質(zhì)為陽(yáng)性，陰性者胞漿內(nèi)無(wú)藍(lán)紫色顆粒。
取6例經(jīng)病理確定的消化道腫瘤患者和4例正常人外周血原位RT-PCR檢測(cè)結(jié)果如下 編號(hào) 性別 年齡標(biāo)本 檢測(cè)結(jié)果 1女32 外周血陽(yáng)性 2男47 外周血陽(yáng)性 3女41 外周血陽(yáng)性 4男53 外周血陽(yáng)性 5男38 外周血陽(yáng)性 6女65 外周血陽(yáng)性 7女59 外周血陰性 8 男36外周血陰性 9 男29外周血陰性 10女61外周血陰性 雖然，原位RT-PCR檢測(cè)結(jié)果與熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，但其操作過(guò)程過(guò)余復(fù)雜，結(jié)果判斷受主觀因素的影響，而且只能作定性檢測(cè)，不能迅速、準(zhǔn)確檢出CEA mRNA表達(dá)量，為臨床選擇可行的治療方案、預(yù)后判斷以及療效觀察提供重要的參考依據(jù)。
核苷酸序列表
SEQUENCE LISTING
<110>上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司
上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司
<120>一種癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR引物和探針及試劑盒
<130>5
<140>CN
<141>2008-10-10
<160>7
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>SEQ ID NO1
<222>(1)..(22)
<400>1
aataacggga cctatgcctg tt 22
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gaaactacac cagggct gct a 21
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<223>“n＝FAM”，“y＝TAMRA”
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<400>3
nagcaacccc aaccagcact ccaay 25
<210>4
<211>20
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<213>Homo sapiens
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<221>SEQ ID NO4
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gggccagtac cagtcttaca 20
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ccagcgaagg ttgtcaatgt 20
<210>6
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<213>Homo sapiens
<220>
<221>SEQ ID NO6
<222>(1)..(23)
<223>“n＝FAM”，“y＝TAMRA”
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<400>6
nccgaccttc gcagccgtcc tagty 25
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<211>183
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>SEQ ID NO7
<222>(1)..(183)
<400>7
aataacggga cctatgcctg ttttgtctct aacttggcta ctggccgcaa taattccata 60
gtcaagagca tcacagtctc tgcatctgga acttctcctg gtctctcagc tggggccact 120
gtcggcatca tgattggagt gctggttggg gttgctctga tatagcagcc ctggtgtagt 180
ttc 18權(quán)利要求
1.一組癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-CR引物和探針，包括如下序列
癌胚抗原(CEA)上、下游引物
上游引物為SEQ ID NO15’-AATAAC GGG ACC TAT GCC TGT T-3’
下游引物為SEQ ID NO25’-GAAACT ACA CCA GGG CTG CTA-3’
癌胚抗原(CEA)檢測(cè)探針為SEQ ID NO3
5’-FAM-AGC AAC CCC AAC CAG CAC TCC AA-TAM RA-3’；
或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長(zhǎng)的序列；
或者與上述序列同源性大于85％的序列；
或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列；
或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一組癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR引物和探針，其序列組還包括內(nèi)參基因葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)的引物和探針
G6PDH內(nèi)參基因上、下游引物
上游引物SEQ ID NO45’-GGG CCA GTACCA GTC TTA CA-3’
下游引物SEQ ID NO55’-CCA GCG AAG GTT GTC AAT GT-3’
G6PDH內(nèi)參基因檢測(cè)探針為SEQ ID NO6
5’-FAM-CCG ACC TTC GCA GCC GTC CTA GT-TAMRA-3’
或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長(zhǎng)的序列；
或者與上述序列同源性大于85％的序列；
或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列；
或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
3.一種含有權(quán)利要求1所述的一種癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其組成為細(xì)胞裂解液、水、含有權(quán)利要求1所述引物序列SEQ IDNO1～2的CEA RT-PCR反應(yīng)液、內(nèi)參G6PDH RT-PCR反應(yīng)液、含有權(quán)利要求1所述探針序列SEQ ID NO3的CEA檢測(cè)探針、G6PDH基因探針、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所說(shuō)的內(nèi)參G6PDH RT-PCR反應(yīng)液中的引物序列為SEQ IDNO4和5，且所說(shuō)的G6PDH基因探針序列為SEQ ID NO6。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所說(shuō)的標(biāo)準(zhǔn)品為如下DNA序列SEQ ID NO7
5’-AATAACGGGA CCTATGCCTG TTTTGTCTCT AACTTGGCTACTGGCCGCAA TAATTCCATA GTCAAGAGCA TCACAGTCTCTGCATCTGGA ACTTCTCCTG GTCTCTCAGC TGGGGCCACTGTCGGCATCA TGATTGGAGT GCTGGTTGGG GTTGCTCTGATATAGCAGCC CTGGTGTAGT TTC-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所說(shuō)的水為無(wú)RNA酶的水。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所說(shuō)的陰性對(duì)照為正常mRNA樣本。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，陽(yáng)性對(duì)照為含有癌胚抗原(CEA)mRNA樣本。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所說(shuō)的細(xì)胞裂解液由細(xì)胞裂解液I和細(xì)胞裂解液II組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，每盒中各組分的量為細(xì)胞裂解液I1瓶24mL、細(xì)胞裂解液II1瓶6mL、無(wú)RNA酶的水1瓶2mL、CEART-PCR反應(yīng)液1管210μL、G6PDHRT-PCR反應(yīng)液1管210μL、CEA檢測(cè)探針1管30μL、G6PDH內(nèi)參基因探針30μL、標(biāo)準(zhǔn)品1管10μL、和陰性對(duì)照品1管10μL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR引物和探針及試劑盒，癌胚抗原(CEA)引物和探針序列為SEQ ID NO1～3，內(nèi)參基因引物和探針序列為SEQ ID NO4～6，試劑盒包含細(xì)胞裂解液、水、RT-PCR反應(yīng)液、內(nèi)參G6PDHRT-PCR反應(yīng)液、CEA探針、G6PDH內(nèi)參基因探針、混合酶、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品?？梢钥焖?、精確定量檢測(cè)樣品中CEA mRNA的表達(dá)量。該試劑盒可用于臨床及科研中檢測(cè)患者的外周血及腫瘤組織中CEA的表達(dá)量，用以輔助診斷、指導(dǎo)治療及提示預(yù)后。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101760521SQ200810201640
公開(kāi)日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日
發(fā)明者沈維祥, 吳大治, 夏懿 申請(qǐng)人:上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司