專利名稱：用雙指示線免疫層析半定量診斷癌胚抗原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)方法，具體是一種用雙指示線免疫層析半定量診斷癌胚抗原的方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤已成為危害人類健康的主要疾病，其中消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病高居首位。據(jù)國(guó)內(nèi)有關(guān)臨床調(diào)查顯示，近年來(lái)大腸癌、結(jié)腸癌、肝癌和胰腺癌等消化系統(tǒng)惡性腫瘤在人群中發(fā)病率有所上升，消化系統(tǒng)惡性腫瘤約占所有腫瘤發(fā)病的60 70%，位居第一， 在死亡率“排行榜”上也是“名列前茅”，且呈年輕化趨勢(shì)，因此開(kāi)展消化系統(tǒng)腫瘤診斷治療研究的重要性不言而喻。這表明，未來(lái)我國(guó)對(duì)于高質(zhì)量的消化系統(tǒng)腫瘤診斷產(chǎn)品，尤其是 CEA診斷產(chǎn)品的需求將越來(lái)越大。大腸癌組織可產(chǎn)生一種糖蛋白，作為抗原引起患者的免疫反應(yīng)。此種抗原稱為癌胚抗原(carcinoembryonic antigen CEA)，可廣泛存在于內(nèi)胚葉起源的消化系統(tǒng)癌。在成年人胃腸道中也有少量合成，但不進(jìn)入血液系統(tǒng)而是通過(guò)胃腸道排出，因此，在正常成年人血清中只有微量的癌胚抗原，濃度小于5ng/mL。在胃腸道腫瘤時(shí)，血清中的癌胚抗原會(huì)明顯升高，如果血清中的癌胚抗原超過(guò)每升血20μ g，提示有胃腸道腫瘤。但是其他的惡性腫瘤如肺癌、胰腺癌、乳腺癌以及一些良性疾病如非特異性結(jié)腸炎、膠原性疾病、心血管疾病等也會(huì)升高。癌胚抗原是一個(gè)廣譜性腫瘤標(biāo)志物，它能向人們反映出多種腫瘤的存在，對(duì)大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測(cè)和預(yù)后估計(jì)，是一個(gè)較好的腫瘤標(biāo)志物。臨床上對(duì)CEA的檢測(cè)常作為結(jié)腸癌、胃癌、直腸癌、食道癌等早期輔助診斷及癌癥術(shù)后有無(wú)復(fù)發(fā)的檢測(cè)指標(biāo)。良性腫瘤，炎癥和退行性疾病，如結(jié)腸息肉，潰瘍性結(jié)腸炎，胰腺炎和酒精性肝硬變病人CEA也有部分升高，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于惡性腫瘤，一般小于20ng/mL，CEA超過(guò)20ng/mL時(shí)往往提示有消化道腫瘤。所以測(cè)定CEA可以作為良性與惡性腫瘤的鑒別診斷依據(jù)。一些腫瘤如早期胃癌70%以上無(wú)明顯癥狀，給早期診斷帶來(lái)了困難，一旦臨床上出現(xiàn)了明顯癥狀，往往已屬于病變的晚期。因此，早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)就診成為提高治愈率的焦點(diǎn)問(wèn)題，而目前，對(duì)于消化系統(tǒng)腫瘤的早期檢測(cè)集中于癌胚抗原CEA這一特異性蛋白。較高的CEA水平意味著癌癥也許會(huì)存在，這時(shí)就需要進(jìn)行活檢來(lái)確認(rèn)診斷。目前，臨床上常用的 CEA檢測(cè)的方法為ELISA，CLIA等方法。上述方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、不利于普及而且費(fèi)用昂貴。開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速的癌胚抗原診斷方法具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。免疫膠體金技術(shù)是20世紀(jì)70年代初期由Faulk和Taylor始創(chuàng)，最初用于免疫電鏡技術(shù)。膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物或顯色劑，于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，現(xiàn)在已成功用于電鏡、流式細(xì)胞儀、免疫印跡、蛋白染色、體外診斷制劑的制造等領(lǐng)域。目前金標(biāo)記技術(shù)常與膜載體配合，形成特定的免疫檢測(cè)方式，如免疫滲濾試驗(yàn)和免疫層析試驗(yàn)等。免疫層析試紙條就是此技術(shù)用于體外快速診斷的一個(gè)重要發(fā)展方向， 是在現(xiàn)代單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型檢測(cè)技術(shù)。近年來(lái)該技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)在臨床診斷特別是床邊檢測(cè)(POCT)中得到了廣泛應(yīng)用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測(cè)。利用膠體金的檢測(cè)方 法測(cè)定血清中CEA作為結(jié)腸癌、胃癌、直腸癌、食道癌等早期輔助診斷及癌癥術(shù)后有無(wú)復(fù)發(fā)的檢測(cè)指標(biāo)，已被開(kāi)發(fā)，其檢測(cè)下限為5ng/mL。但是對(duì)于臨床上單獨(dú)使用5ng/mL這一標(biāo)準(zhǔn)不能直接、快速區(qū)分良性與惡性腫瘤，所以開(kāi)發(fā)能夠檢測(cè)CEA 5 20ng/mL這一 CEA診斷灰區(qū)的半定量膠體金試紙也是十分必要的。目前國(guó)內(nèi)外均無(wú)相關(guān)的試紙條出售。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速的癌胚抗原診斷方法具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用膠體金免疫層析法，建立快速檢測(cè)CEA的方法。并且能夠半定量檢測(cè)5ng/mL 20ng/mL這一 CEA灰區(qū)范圍。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記抗CEA單克隆抗體1并均勻涂布于膠金墊上，作為示蹤標(biāo)記物。在硝酸纖維素膜上，兩個(gè)不同濃度的CEA單克隆抗體2固定于兩個(gè)檢測(cè)線(即T線)，羊抗鼠二抗固定于質(zhì)控線(即 C線)。依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙并裝入檢測(cè)卡中。金標(biāo)抗體與相應(yīng)的抗原、抗體發(fā)生特異性結(jié)合被截留而顯色，根據(jù)T線、C線顯色與否來(lái)判斷陰陽(yáng)性結(jié)果。本發(fā)明方法包括如下步驟一、膠體金溶液配制1.配制氯金酸溶液；2.配制2%檸檬酸三鈉溶液；3.將0. 02%的氯金酸溶液加熱至沸騰，迅速加入2%的檸檬酸三鈉2mL ；4.溶液由淺藍(lán)色，深藍(lán)，再加熱出現(xiàn)酒紅色，繼續(xù)煮沸IOmin ；停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫。二、膠體金標(biāo)記物的制備1.取兩個(gè)1. 5mL試管，分別加入ImL膠體金溶液；2.加入適量硼砂緩沖液把pH調(diào)整為8. 8 ；3.加入20μ g/mL CEA單克隆抗體1，使其達(dá)到最小蛋白濃度，混勻，振蕩30min ；
4.加入 20 μ L 的 10 % BSA,混勻，振蕩 30min ；5. 12000rpm離心5min，輕輕吸除上清；6.用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；7.重復(fù)5.步操作；8.重復(fù)6.步操作；9.重復(fù)5.步操作；10.用fix buffer配制在540nm處OD (光密度)值為0. 5 1. 0的膠體金免疫復(fù)合物；11.玻璃纖維素膜點(diǎn)樣，形成膠金墊，真空凍干3小時(shí)。三、在硝酸纖維素膜上劃線
1. Tl線用濃度為0. 2mg/mL的CEA單克隆抗體2劃線，用于檢出5ng/mL的CEA ；2. T2線用濃度為0. lmg/mL的CEA單克隆抗體2劃線，用于檢出20ng/mL的CEA ；3. C線用3. 5mg/mL羊抗鼠多克隆抗體劃線；4.將硝酸纖維素膜置于40°C烘箱干燥3天。四、膠體金試紙條的組裝1.將樣品墊、膠金墊、NC膜和吸收墊4部分按順序組裝(見(jiàn)附圖1)；2.將其組裝好后用剪刀剪成4mm/條后進(jìn)行檢測(cè)。五、檢測(cè)試紙平放，將樣品加到檢測(cè)條的樣本墊上，由于毛細(xì)效應(yīng)，液體的層析方向向前， 與固定在τ線、C線上的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合被截留而顯色。5min后，根據(jù)T線、C線的顯色情況判定陰陽(yáng)性結(jié)果。C線與靠近C線的檢測(cè)帶出現(xiàn)紅色為樣本中CEA水平大于5ng/mL(見(jiàn)附圖2)，C線與兩條檢測(cè)帶都出現(xiàn)紅色為樣本中CEA水平大于20ng/mL(見(jiàn)附圖3)，只有C線出現(xiàn)紅色的為陰性(見(jiàn)附圖4)，T線和C線均不顯色則試紙條無(wú)效。本發(fā)明檢測(cè)對(duì)象單一且針對(duì)性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高。檢測(cè)速度快，所需時(shí)間短，只需5min， 不需經(jīng)培訓(xùn)的專業(yè)人員就可使用本發(fā)明方法來(lái)檢測(cè)，滿足醫(yī)院、門診等部門快速、準(zhǔn)確地診斷消化系統(tǒng)腫瘤的要求，并且便于基層推廣和運(yùn)用。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例試紙條的圖示圖2為本發(fā)明實(shí)施例試紙條的陽(yáng)性結(jié)果(CEA水平大于5ng/mL)圖3為本發(fā)明實(shí)施例試紙條的陽(yáng)性結(jié)果(CEA水平大于20ng/mL)圖4為本發(fā)明實(shí)施例試紙條的陰性結(jié)果
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下面實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。本實(shí)例先用2%的檸檬酸三鈉溶液制備20nm的金水，并標(biāo)記CEA單克隆抗體1，按金標(biāo)單克隆抗體、CEA單克隆抗體2、羊抗鼠多克隆抗體噴金標(biāo)墊、檢測(cè)線(T線)、質(zhì)控線(C 線)，然后組裝成試紙條，置37°C烘箱烘干并裁成4mm/條，室溫干燥保存?zhèn)溆谩?shí)施例1.準(zhǔn)備CEA單克隆抗體1和2。并清洗實(shí)驗(yàn)所需的玻璃器皿。2.膠體金的制備先將0. 02 %氯金酸溶液溶液加熱煮沸，迅速加入2 %的檸檬酸三鈉2mL ；溶液顏色由淺藍(lán)色變?yōu)樯钏{(lán)，繼續(xù)加熱出現(xiàn)酒紅色，繼續(xù)煮沸IOmin ；出現(xiàn)透明的酒紅色，停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫。這樣就制備了 20nm的膠體金溶液。然后用電鏡鏡檢， 確保制備的金顆粒盡量使其大小一致、均勻，顆粒直徑在20nm左右，否則重新制作。
3.膠體金標(biāo)記物的制備取兩個(gè)1. 5mL試管，分別加入ImL膠體金溶液；向其中加入適量硼砂緩沖液把pH 調(diào)整為8.8 ；加入20yg/mL CEA單克隆抗體1，使其達(dá)到最小蛋白濃度，混勻，于振蕩儀上快速振蕩30min ；加入20 μ L的10% BSA,混勻，振蕩30min ；于離心機(jī)中12000rpm,離心5min， 輕輕吸除上清；用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；于離心機(jī)中12000rpm， 離心5min，輕輕吸除上清；用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；于離心機(jī)中12000rpm，離心5min，輕輕吸除上清；用fix buffer配制在540nm處OD (光密度)值為 0. 5 1. 0的膠體金免疫復(fù)合物；在玻璃纖維素膜上點(diǎn)樣，形成膠金墊，真空凍干3小時(shí)。4.膠體金試紙條的組裝分別將0. 2mg/mL和0. lmg/mL的CEA單克隆抗體2劃在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線(T 線)上，將3.5mg/mL羊抗鼠多克隆抗體劃在質(zhì)控線(C線)上。然后將硝酸纖維素膜置于烘箱中40°C干燥3天。然后將各個(gè)部分按附圖1組裝成試紙條。5.膠體金試紙條的使用及結(jié)果判讀檢測(cè)前，先提取被檢者的血清樣本。然后把試紙條試紙平放，將樣品加到檢測(cè)條的樣本墊上，由于毛細(xì)效應(yīng)，液體的層析方向向前，與固定在τ線、C線上的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合被截留而顯色。5min后，根據(jù)T線、C 線的顯色情況判定陰陽(yáng)性結(jié)果。C線與靠近C線的檢測(cè)帶出現(xiàn)紅色為樣本中CEA水平大于 5ng/mL(見(jiàn)附圖2)，C線與兩條檢測(cè)帶都出現(xiàn)紅色為樣本中CEA水平大于20ng/mL(見(jiàn)附圖 3)，只有C線出現(xiàn)紅色的為陰性(見(jiàn)附圖4)，T線和C線均不顯色則試紙條無(wú)效。實(shí)施例可直接檢測(cè)樣品中的CEA，使用方法不需要專業(yè)培訓(xùn)，操作方便、快速，5min 即可獲得結(jié)果，可達(dá)到快速、簡(jiǎn)便、及時(shí)地檢測(cè)CEA的目的。
權(quán)利要求
1.一種用雙指示線免疫層析半定量診斷癌胚抗原的方法，其特征在于，采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記抗CEA單克隆抗體1并均勻涂布于膠體金墊上，作為示蹤標(biāo)記物。在硝酸纖維素膜上，兩個(gè)不同濃度的CEA單克隆抗體2固定于兩個(gè)檢測(cè)線(即T線)， 羊抗鼠二抗固定于質(zhì)控線(即C線)。依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙并裝入檢測(cè)卡中。金標(biāo)抗體與相應(yīng)的抗原、抗體發(fā)生特異性結(jié)合被截留而顯色，根據(jù)T線、C線顯色與否來(lái)判斷陰陽(yáng)性結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用雙指示線免疫層析半定量診斷癌胚抗原的方法，其特征在于，抗體劃線濃度為Tl線用濃度為0. 2mg/mL的CEA單克隆抗體2劃線，用于檢出5ng/mL的CEA ； T2線用濃度為0. lmg/mL的CEA單克隆抗體2劃線，用于檢出20ng/mL的CEA ； C線用3. 5mg/mL羊抗鼠多克隆載體劃線； 將硝酸纖維素膜置于40°C烘箱干燥3天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用雙指示線免疫層析半定量診斷癌胚抗原的方法，其特征在于，運(yùn)用不同濃度的抗體溶液在相同的基質(zhì)上劃線，以膠體金方法檢測(cè)多個(gè)不同濃度水平物質(zhì)的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)方法，具體是一種用雙指示線免疫層析半定量診斷癌胚抗原的方法。癌胚抗原是一個(gè)廣譜性腫瘤標(biāo)志物，它能向人們反映出多種腫瘤的存在，對(duì)大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測(cè)和預(yù)后估計(jì)，是一個(gè)較好的腫瘤標(biāo)志物。臨床上對(duì)CEA的檢測(cè)常作為結(jié)腸癌、胃癌、直腸癌、食道癌等早期輔助診斷及癌癥術(shù)后有無(wú)復(fù)發(fā)的檢測(cè)指標(biāo)。目前，臨床上常用的CEA檢測(cè)的方法為ELISA，CLIA等方法。上述方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、不利于普及而且費(fèi)用昂貴。免疫膠體金技術(shù)近年來(lái)發(fā)展迅速，得到了廣泛應(yīng)用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測(cè)。本發(fā)明采用膠體金免疫層析法，建立快速檢測(cè)CEA的方法，并且能夠半定量檢測(cè)5ng/mL～20ng/mL這一CEA灰區(qū)范圍，測(cè)定CEA可以作為良性與惡性腫瘤的鑒別診斷依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102221612SQ20111015444
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者劉寅, 岳曉燕, 張有青, 王晶, 羅云萍, 霍五奎, 馬雪明 申請(qǐng)人:正元盛邦(天津)生物科技有限公司