專利名稱：癌胚抗原檢測(cè)微粒、其制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥的診斷試劑，具體涉及基于光激化學(xué)發(fā)光原理的癌胚抗原(CEA)檢測(cè)微粒、其制備及應(yīng)用。

背景技術(shù)：
免疫學(xué)檢測(cè)是基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種手段，由于其可以利用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對(duì)被檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大和顯示，因此常被用于檢測(cè)蛋白質(zhì)，激素等微量生物活性物質(zhì)。
我國(guó)免疫學(xué)檢測(cè)基本經(jīng)歷了放射免疫檢測(cè)(興起于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)仍普遍使用于縣級(jí)以上醫(yī)院)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)(興起于20世紀(jì)80年代，各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用)；以化學(xué)發(fā)光為代表的生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測(cè)技術(shù)(20世紀(jì)90年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成長(zhǎng)期)三個(gè)階段。這一衍變過程主要是基于對(duì)檢測(cè)方法的敏感性、準(zhǔn)確性、以及操作簡(jiǎn)捷性的需求的不斷提高而決定的。
化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay)是近十年來在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術(shù)。檢測(cè)原理是以發(fā)光物質(zhì)作為信號(hào)放大系統(tǒng)并籍助其發(fā)光強(qiáng)度直接測(cè)定免疫結(jié)合。由于其高靈敏度，檢測(cè)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，已成為放射性免疫分析與普通酶免疫分析的取代者，是免疫學(xué)檢測(cè)重要的發(fā)展方向。
但目前國(guó)內(nèi)自行研制的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑，大多為非均相反應(yīng)，采用化學(xué)底物直接標(biāo)記，通過化學(xué)反應(yīng)激發(fā)。其分析過程與傳統(tǒng)酶標(biāo)檢測(cè)類似，需反復(fù)清洗與分離，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，自動(dòng)化程度不高。國(guó)外廠家檢測(cè)試劑隨發(fā)光基質(zhì)與檢測(cè)形式而各不相同。以Abbott，Bayer與Chiron等公司為代表的化學(xué)激發(fā)，即以化學(xué)發(fā)光底物直接標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫測(cè)定。最常用的為吖啶酯，在堿性環(huán)境中可被過氧化氫氧化而發(fā)光。BD則以AKP，金鋼脘為基質(zhì)采用酶促化學(xué)發(fā)光。Roche為則采用電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)，發(fā)光底物二價(jià)的三聯(lián)吡啶釕及反應(yīng)參與物三丙胺在電極表面失去電子而被氧化。氧化的三丙胺失去一個(gè)H+而成為強(qiáng)還原劑，將氧化型的三價(jià)釕還原為激發(fā)態(tài)的二價(jià)釕，隨即釋放光子而恢復(fù)為基態(tài)的發(fā)光底物。這一過程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，不斷地發(fā)出光子而常保持底物濃度的恒定。因反應(yīng)過程中牽涉到分離清洗，自動(dòng)化設(shè)計(jì)復(fù)雜，儀器相當(dāng)昂貴。此外，發(fā)光基質(zhì)的穩(wěn)定性也是一大問題。
光激化學(xué)發(fā)光法通過引入激光技術(shù)與納米微球技術(shù)，成功地解決了上述不足。因反應(yīng)在均相中進(jìn)行，既加快了反應(yīng)速度，又避免了反復(fù)分離與清洗步驟，能有效降低檢測(cè)背景值，減少反應(yīng)時(shí)間，并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。目前，PE公司推出了針對(duì)生物研究用的光激化學(xué)發(fā)光試劑Alpha-Screen。但在臨床檢測(cè)領(lǐng)域，還沒有面世的光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑，尤其是用于腫瘤標(biāo)志物與肝炎檢測(cè)項(xiàng)目。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可用于定量檢測(cè)癌胚抗原(CEA)的檢測(cè)微粒，其制備、檢測(cè)條件及應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)原理 本發(fā)明的癌胚抗原(CEA)檢測(cè)試劑及試劑盒與光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)相關(guān)，光激化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是一種利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)發(fā)射的光波進(jìn)行免疫測(cè)定的方法。該技術(shù)主要整合了高分子微粒技術(shù)，有機(jī)合成，蛋白質(zhì)化學(xué)與臨床檢測(cè)相關(guān)領(lǐng)域的研究。
本發(fā)明之所以能檢測(cè)癌胚抗原(CEA)，是由于在均相條件下，將內(nèi)部帶有染料的感光微粒(納米級(jí))以及包被有抗-CEA抗體并且內(nèi)部帶有發(fā)光化合物的發(fā)光微粒(納米級(jí))的混合物作為試劑和檢測(cè)樣品混合。此時(shí)納米感光微粒和包被有抗-CEA抗體的納米發(fā)光微?？裳杆儆行У夭蹲紺EA，在近距離內(nèi)，三者形成免疫夾心復(fù)合物。激發(fā)光照射后，納米感光微粒中的染料被誘導(dǎo)激活，并釋放高能態(tài)的活性氧離子(單線態(tài)氧)。該高能態(tài)的活性氧離子被近距離的納米發(fā)光微粒俘獲，從而傳遞能量以激活所述發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物。數(shù)微秒后，發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物將釋放出高能級(jí)紅光。用光子計(jì)數(shù)器測(cè)定這些高能級(jí)光子，并通過電腦將光子數(shù)換算為目標(biāo)分子濃度，光子數(shù)的多少即精確地反映了目標(biāo)分子的濃度。而當(dāng)樣本不含CEA時(shí)，無法在近距離形成免疫夾心復(fù)合物，活性氧離子也無法傳遞至發(fā)光微粒表面?；钚匝蹼x子在液相中迅速衰減，檢測(cè)時(shí)則無高能級(jí)紅光產(chǎn)生。具體原理參見圖1及圖2。
基于上述原理，本發(fā)明第一方面提供了一種用于檢測(cè)癌胚抗原(CEA)的檢測(cè)微粒，為抗-CEA抗體包被的發(fā)光微粒。
本發(fā)明第二方面提供了一種癌胚抗原(CEA)的檢測(cè)試劑盒，包括上述抗-CEA抗體包被的發(fā)光微粒，試劑盒中還可包括生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體和/或親和素包被的感光微粒。
在試劑盒中，上述抗-CEA抗體包被的發(fā)光微粒、生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體和親和素包被的感光微粒分別以溶液的形式置于各自獨(dú)立的容器中。上述含有抗-CEA抗體包被的發(fā)光微粒、生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體或親和素包被的感光微粒的溶液的溶劑可以是常規(guī)的適合抗原抗體反應(yīng)的溶劑體系，如HEPES緩沖體系、Tris緩沖體系?？?CEA抗體包被的發(fā)光微粒的溶劑優(yōu)選pH8.0的成分為HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H2O的HEPES緩沖液，生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體的溶劑優(yōu)選pH8.0的成分為Tris、NaCl和EDTA-Na-2H2O的Tris緩沖液，親和素包被的感光微粒的溶劑優(yōu)選成分為HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H2O的HEPES緩沖液，上述各種溶劑中還可添加起封閉和蛋白保護(hù)作用的物質(zhì)如BSA以及防止微粒聚集的穩(wěn)定試劑如Tween20，出于對(duì)試劑防腐以及長(zhǎng)期儲(chǔ)存的考慮還可在溶劑中添加防腐劑，防腐劑優(yōu)選100U/ml慶大霉素和質(zhì)量百分比為萬分之五的Proclin 300作為防腐劑。
試劑盒中還可包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。
在用于定量檢測(cè)癌胚抗原(CEA)時(shí)，上述試劑盒中還可包括含有多種已知癌胚抗原(CEA)濃度的溶液。上述不同癌胚抗原(CEA)濃度的溶液分別獨(dú)立包裝。
上述發(fā)光微粒是指填充有發(fā)光化合物和鑭系元素化合物的高分子微粒。發(fā)光化合物可以是Dioxene(二氧雜環(huán)己烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，鑭系元素化合物可以是Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen等，該微?？捎墒袌?chǎng)上購(gòu)得。
研究發(fā)現(xiàn)，由于最終的檢測(cè)反應(yīng)是均相反應(yīng)，發(fā)光微粒的粒徑(微粒的平均直徑)太大(＞400nm)會(huì)自然沉降，影響檢測(cè)效果，微粒的粒徑太小(＜50nm)，會(huì)使制備過程中的清洗工作比較困難，對(duì)抗體連接工作不利，因此發(fā)光微粒的粒徑范圍應(yīng)在50-400nm之間，較好為100-300nm之間，優(yōu)選250nm。
發(fā)光微粒的表面官能團(tuán)可以是任何能聯(lián)接蛋白質(zhì)的基團(tuán)，但最常用的主要有羧基和醛基表面官能團(tuán)的微粒。使用不同的微粒表面官能團(tuán)，連接抗體的反應(yīng)方式和條件也不相同。
鑒于獲得更好的抗-CEA抗體連接效率，試劑穩(wěn)定性和連接重復(fù)性，在采用之后記載的改進(jìn)方法作為抗體的連接方法時(shí)優(yōu)選羧基表面官能團(tuán)的微粒。
發(fā)光微粒的發(fā)光量會(huì)直接影響最終檢測(cè)的發(fā)光效果。市場(chǎng)提供的發(fā)光微粒發(fā)光量一般會(huì)在50,000-10,000,000光子數(shù)/100ug發(fā)光微粒范圍內(nèi)，優(yōu)選150,000-350,000光子數(shù)/100ug)發(fā)光微粒。
上述生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體中，生物素與抗體的分子比例較佳為(30-50)∶1，優(yōu)選40∶1。
上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。在670-690nm光激發(fā)下，可以產(chǎn)生單線態(tài)氧離子，當(dāng)其與發(fā)光微粒距離足夠近的情況下，單線氧離子傳遞到發(fā)光微粒，與發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物反應(yīng)，產(chǎn)生紫外光，紫外光再進(jìn)一步激發(fā)鑭系元素化合物，產(chǎn)生520-620nm波長(zhǎng)光子。感光化合物可以是酞菁染料等，該微粒也可由市場(chǎng)上購(gòu)得。
上述親和素包被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質(zhì)量比例無特殊限制，較佳為1∶(3-10)，優(yōu)選1∶5。
市售感光微粒均適用于本發(fā)明，微粒粒徑較佳為180-260nm，優(yōu)選220nm。
抗-CEA抗體包被的發(fā)光微?？刹捎肗aBH3CN的還原胺化反應(yīng)法制得，NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)步驟如下 1)混合將發(fā)光微粒與抗-CEA抗體按質(zhì)量比例為10∶(1-4)混合于緩沖液中； 2)反應(yīng)加入緩沖液配制的NaBH3CN溶液混合并反應(yīng)； 3)封閉加入緩沖液配制的Gly及NaBH3CN溶液，混勻反應(yīng)后，再加入BSA(bovineserum albumin)溶液封閉； 4)清洗產(chǎn)物，獲得抗-CEA抗體包被的發(fā)光微粒。
其中，混合步驟中，發(fā)光微粒與抗-CEA抗體的質(zhì)量比例為10∶(1-4)優(yōu)選10∶2。反應(yīng)緩沖液可為MES緩沖液、磷酸緩沖液，優(yōu)選MES沖液，濃度優(yōu)選0.05M，反應(yīng)步驟中，反應(yīng)溶液中發(fā)光微粒的濃度可為10～40mg/ml，優(yōu)選20mg/ml。
改進(jìn)的，抗-CEA抗體包被的發(fā)光微?？刹捎孟率龇椒ㄖ频? 1)混合將發(fā)光微粒與抗-CEA抗體混合于緩沖液中。較佳的，緩沖液為MES緩沖液，發(fā)光微粒與抗-CEA抗體的質(zhì)量比例為(8-15)∶1，優(yōu)選12.5∶1。
2)反應(yīng)加入緩沖液配制的EDAC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)溶液混合并反應(yīng)。較佳的，緩沖液為MES緩沖液，混合溶液中，發(fā)光微粒與EDAC的質(zhì)量比為(15-40)∶1混合，優(yōu)選質(zhì)量比為25∶1。反應(yīng)條件為37℃旋轉(zhuǎn)反應(yīng)。一般約48小時(shí)反應(yīng)充分。
3)往步驟2獲得的反應(yīng)液中加入緩沖液配制的BSA溶液混勻并反應(yīng)。較佳的，緩沖液為MES緩沖液。BSA溶液與步驟2獲得的反應(yīng)液體積比較佳為1∶1-1∶2。反應(yīng)條件為37℃旋轉(zhuǎn)反應(yīng)。一般約16小時(shí)反應(yīng)充分。
4)清洗產(chǎn)物，獲得抗-CEA抗體包被的發(fā)光微粒。
清洗的方式可以為離心法清洗或透析法清洗。
透析法清洗步驟采用反應(yīng)緩沖液透析，每次4-5小時(shí)，更換緩沖液4次。透析清洗操作時(shí)間較長(zhǎng)，且微粒損失較多，造成收率降低。
離心法清洗步驟包括離心去上清，加入反應(yīng)緩沖液洗滌，超聲處理打開沉淀，如此反復(fù)3-5次。離心法清洗時(shí)離心力會(huì)使發(fā)光微粒暫時(shí)聚集在一起，但經(jīng)過超聲處理可以很容易再次分散打開，此法操作時(shí)間短，且收率較高。因此優(yōu)選采用此種清洗方式。
上述改進(jìn)的制備方法與NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法的主要差別在于主要反應(yīng)試劑NaBH3CN替換成了EDAC，該試劑的替換，不僅使得反應(yīng)時(shí)間與NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法相比縮短了4個(gè)多小時(shí)，而且發(fā)光微粒與抗-CEA抗體的交聯(lián)效率獲得了提高，節(jié)省了抗體用量，此外，試驗(yàn)表明，該方法制得的檢測(cè)微粒與NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法制得的檢測(cè)微粒相比，在相同條件下反應(yīng)信號(hào)更強(qiáng)，靈敏度更高，檢測(cè)范圍也更廣。
親和素包被的感光微?？刹捎肗aBH3CN的還原胺化反應(yīng)法制備。
本發(fā)明第三方面，公開了上述試劑盒的使用方法，包括下列步驟 將待測(cè)樣品與試劑盒中用于檢測(cè)癌胚抗原(CEA)的檢測(cè)微粒、生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體和親和素包被的感光微?；旌戏磻?yīng)，而后用激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光光子量獲得光信號(hào)值。
上述激發(fā)光光源波長(zhǎng)范圍為600-700nm，優(yōu)選640-680nm；反應(yīng)孔發(fā)光的發(fā)射光光源波長(zhǎng)范圍為600-680nm，優(yōu)選610-620nm；發(fā)射光延遲時(shí)間范圍為100ms-1000ms；激發(fā)光光源的功率范圍為5-100mw，優(yōu)選40-60w。
較佳的，上述試劑盒的使用方法具體為 1)在反應(yīng)孔中加入樣品、試劑盒中用于檢測(cè)癌胚抗原(CEA)的檢測(cè)微粒和生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體，獲得初始反應(yīng)溶液，混合反應(yīng)； 2)再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應(yīng)溶液進(jìn)行反應(yīng)； 3)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光光子量獲得光信號(hào)值。
上述步驟1的反應(yīng)條件為37℃溫育10-30分鐘，優(yōu)選20分鐘，步驟2的反應(yīng)條件也為37℃溫育10-30分鐘，優(yōu)選15分鐘。
步驟1中，抗-CEA抗體包被的發(fā)光微粒為混懸液，抗-CEA抗體包被的發(fā)光微粒在混懸液中的濃度無特殊限制，可以為200-400ug/ml，優(yōu)選300ug/ml。
步驟1中，生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體也為混懸液，生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體在混懸液中的濃度無特殊限制，可以為30-50ug/ml，優(yōu)選50ug/ml。
步驟2中，親和素包被的感光微粒為混懸液，親和素包被的感光微粒在混懸液中的濃度一般控制在20-100ug/ml，可以為20-60ug/ml，優(yōu)選40ug/ml。
上述方法中，初始反應(yīng)溶液的體積無特殊限制，可以為45-75ul，優(yōu)選75ul；最終反應(yīng)溶液的體積也無特殊限制，可以為150-250ul，優(yōu)選250ul。
上述樣品包括血清、血漿和全血。
當(dāng)本發(fā)明的檢測(cè)微粒及檢測(cè)試劑盒用于定量檢測(cè)癌胚抗原(CEA)時(shí)，還需根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品CEA含量。
本發(fā)明是采用光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，定量測(cè)定人血清樣品中癌胚抗原(CEA)的體外診斷試劑盒，可以與其它血清和臨床信息聯(lián)合用于癌癥的輔助診斷及癌癥病人治療效果的監(jiān)測(cè)。
本發(fā)明與檢測(cè)對(duì)象相近的癌胚抗原(CEA)酶免法試劑盒在方法學(xué)上比較，酶免法以O(shè)D值體現(xiàn)樣本檢測(cè)值，OD值可檢測(cè)范圍窄，僅可做定性檢測(cè)，且靈敏度低。本發(fā)明的試劑盒采用光激化學(xué)發(fā)光法測(cè)定標(biāo)本中的CEA，具有靈敏度高、檢測(cè)范圍寬等特點(diǎn)，在方法學(xué)上較酶免法能達(dá)到更高的靈敏度和更優(yōu)的檢測(cè)范圍。



圖1光激化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)原理圖微粒結(jié)合形成二聚體，產(chǎn)生光子信號(hào) 圖2光激化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)原理圖未結(jié)合微粒，無光子信號(hào)產(chǎn)生 圖3單線態(tài)氧隨微粒間距離衰減，在大概600nm的距離，基本沒有單線氧的存在，因此也不發(fā)光 FG BEAD發(fā)光微粒，內(nèi)含發(fā)光分子； GG BEAD感光微粒，內(nèi)含感光分子； Singlet Oxygen單線態(tài)氧，活性氧離子； A/B兩者可直接或間接特異結(jié)合的活性分子。如在雙抗夾心檢測(cè)中，A，B為針對(duì)靶分子C不同的表位的單克隆抗體 圖4本發(fā)明的試劑盒與進(jìn)口試劑盒檢測(cè)比較試驗(yàn)結(jié)果
具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗(yàn)手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。
實(shí)驗(yàn)中儀器原料來源及試劑配方 原料及試劑 廠家 Biotin-X-X-NHS Sigma TLC≥95％ BSA Equitech/protease free Gly Sigma≥95％ HEPES 華美 TrisSigma NaBH3CN Acros Avidin Pierce EDACSigma 抗-CEA抗體 biospacific 感光微粒美國(guó)PentaTek公司 發(fā)光微粒美國(guó)PentaTek公司 儀器 型號(hào) 廠家 粒徑儀Model 370 Nicomp 酶標(biāo)儀MultiSKAN MK3 labsystem 紫外可見分光光度計(jì)752P 上海光譜有限公司 熒光分光光度計(jì)F95 上海棱光技術(shù)有限公司 光激化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)博陽生物/上海北濱光子 實(shí)施例1癌胚抗原抗體包被的發(fā)光微粒的制備 癌胚抗原抗體包被的發(fā)光微粒改進(jìn)的制備方法如下 1)發(fā)光微?；鞈乙禾幚砦∫欢康聂然l(fā)光微粒于高速冷凍離心機(jī)中離心，棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲破碎至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)光微粒濃度至100mg/ml。
2)抗體處理CEA抗體于0.05M pH6.0的MES緩沖液(以下簡(jiǎn)稱MES緩沖液)透析，透析完成后測(cè)定濃度，并調(diào)節(jié)濃度至8mg/ml。
3)MES緩沖液、100mg/ml的發(fā)光微?；鞈乙?MES緩沖液)和8mg/ml的抗-CEA抗體溶液(MES緩沖液)，以1∶1∶1的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。
4)用MES緩沖液配制40mg/ml的EDAC溶液，按照與發(fā)光微粒100mg/100uL EDAC的比加入，迅速混勻，37℃旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時(shí)。
5)加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應(yīng)液體積比為5∶8，迅速混勻，37℃旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小時(shí)。
6)用MES緩沖液離心清洗四次，最后用發(fā)光試劑緩沖液進(jìn)行懸浮，測(cè)定粒徑和固含量，調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。
將上述方法與采用NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法制得的檢測(cè)微粒進(jìn)行比較。
NaBH3CN還原胺化反應(yīng)法的制備方法 1)發(fā)光微?；鞈乙禾幚砦∫欢康陌l(fā)光微粒于高速冷凍離心機(jī)中離心，棄去上清，加入一定量Mes緩沖液，超聲破碎至微粒重新懸浮，加入磷酸緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)光微粒濃度至100mg/ml。
2)抗體處理抗-CEA抗體于0.02M pH7.0的Mes緩沖液透析，透析完成后測(cè)定濃度，并調(diào)節(jié)濃度至8mg/ml。
3)Mes緩沖液、100mg/ml的發(fā)光微?；鞈乙?Mes緩沖液)和8mg/ml的抗-CEA(Mes緩沖液)，以1∶2∶5的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。
4)用Mes緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液1∶25的體積比加入，迅速混勻，37℃旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時(shí)。
5)Mes緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液2∶1∶10的體積比加入上述溶液中，混勻，37℃旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2小時(shí)。再加入200mg/ml的BSA溶液(Mes緩沖液)，其與反應(yīng)液體積比為5∶8，迅速混勻，37℃旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小時(shí)。
6)用Mes緩沖液離心清洗四次，最后用發(fā)光試劑緩沖液進(jìn)行懸浮，測(cè)定粒徑和固含量，調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。
兩者制得的檢測(cè)微粒的比較 1.節(jié)省了制備時(shí)間 2.提高了抗體交聯(lián)效率，節(jié)省了抗體用量 3.增強(qiáng)了反應(yīng)信號(hào) 4.提高了靈敏度 5.擴(kuò)大了檢測(cè)范圍 參照前述改進(jìn)的制備方法制備抗-CEA抗體包被的發(fā)光微粒，并通過各項(xiàng)性能測(cè)試比較從以下幾方面進(jìn)行了具體工藝條件的選擇研究 1.光信號(hào)檢測(cè)方法 在反應(yīng)孔中分別加入25μl樣品，再依次加入25μl發(fā)光試劑和25μl生物素化抗體試劑。然后放入儀器(光激化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng))，由儀器自動(dòng)按以下步驟操作振動(dòng)，37℃溫育20分鐘，再自動(dòng)加入175μl親和素包被的感光微粒試劑后37℃溫育15分鐘。儀器自動(dòng)產(chǎn)生激光照射微孔計(jì)算每孔發(fā)光光子量。
2.分析靈敏度檢測(cè)方法 檢測(cè)10孔定標(biāo)品1(0ng/ml)，計(jì)算其RLU均值(AVE)和二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，以AVE±2SD反代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的濃度值即為本試劑盒的分析靈敏度。
3.特異性檢測(cè)方法 檢測(cè)AFP與PSA特異性參考品，不得檢出假陽性 AFP(甲胎蛋白)特異性參考品濃度1000ng/mL PSA(前列腺特異抗原)特異性參考品濃度100ng/mL 4.Hook檢測(cè)方法 檢測(cè)CEA濃度分別為10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml的樣本光信號(hào)，結(jié)果應(yīng)大于定標(biāo)品6(1000ng/ml)。
5.精密性檢測(cè)方法 檢測(cè)CEA濃度分別為7ng/ml和100ng/ml的質(zhì)控品光信號(hào)，每個(gè)濃度做10孔重復(fù)測(cè)定，代入公式，計(jì)算CV值。低濃度的精密性測(cè)定表示為QC L，高濃度的精密性測(cè)定表示為QC H。
6.線性檢測(cè)方法 對(duì)除0值外其他5點(diǎn)定標(biāo)品(實(shí)施例6制備)做線性分析，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)r(r應(yīng)大于0.99) 工藝條件選擇 a.緩沖液及反應(yīng)pH值選擇 其它反應(yīng)條件25mg/ml的發(fā)光微粒反應(yīng)濃度，12.5∶1的發(fā)光微粒與抗-CEA抗體質(zhì)量比，離心法清洗

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，0.05M MES pH6.0緩沖液靈敏度、CV好于0.02M PB pH 7.0緩沖液。故選擇0.05M MES pH 6.0緩沖液作為抗CEA包被發(fā)光微粒的反應(yīng)緩沖液。
b.發(fā)光微粒與抗體的反應(yīng)比例 其它反應(yīng)條件0.05M pH6.0的MES buffer作為反應(yīng)緩沖液，離心法清洗。

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)發(fā)光微粒與抗體反應(yīng)比例為12.5∶1時(shí)，其各項(xiàng)數(shù)值都較好，故發(fā)光微粒與抗體反應(yīng)比例選擇為12.5∶1。
c.清洗方式 其它反應(yīng)條件0.05M pH6.0的MES buffer作為反應(yīng)緩沖液，12.5∶1的發(fā)光微粒與抗-CEA抗體比例。
透析法清洗步驟100倍以上體積透析，每次4小時(shí)以上，更換緩沖液3次。透析清洗操作時(shí)間較長(zhǎng)，透析過程中微粒損失較多。
離心法清洗步驟12000rpm離心30分鐘，清洗4次。離心法清洗的離心力會(huì)使發(fā)光微粒暫時(shí)聚集，但經(jīng)過超聲處理很容易可再次分散打開。且操作時(shí)間短，收率較高?？紤]到生產(chǎn)周期以及生產(chǎn)成本，決定采用此種清洗方式。
最終選擇250nm的粒徑，發(fā)光量為≥250,000光子數(shù)/100ug的發(fā)光微粒，0.05M pH6.0的MES buffer作為反應(yīng)緩沖液，12.5∶1的發(fā)光微粒與抗-CEA抗體比例，透析法清洗作為最優(yōu)制備條件。
實(shí)施例2生物素標(biāo)記抗體的制備 制備方法 1)抗體處理將抗-CEA抗體透析于0.1M NaHCO3溶液，測(cè)定抗體濃度并調(diào)節(jié)至1mg/ml。
2)用DMSO配制16.17mg/ml的Biotin溶液。
3)標(biāo)記取處理好的1mg/ml抗-CEA抗體標(biāo)記抗體與配制好的Biotin溶液，二者按比例進(jìn)行混合，迅速混勻。4℃靜置反應(yīng)12～16小時(shí)。
4)透析將反應(yīng)好的生物素標(biāo)記抗體透析于生物素標(biāo)記透析緩沖液(pH8.0)。
5)將透析好的生物素化抗體吸出轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，取樣測(cè)定抗體濃度。將質(zhì)檢合格的生物素標(biāo)記抗體濃度調(diào)節(jié)至0.5mg/ml。
將抗體與Biotin按照不同比例進(jìn)行反應(yīng)并進(jìn)行檢測(cè)

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)生物素與抗體反應(yīng)比例為40∶1時(shí)，其各項(xiàng)數(shù)值都好于30∶1與50∶1，故生物素與抗體反應(yīng)比例選擇為40∶1。
實(shí)施例3親和素包被的感光微粒的制備 感光微粒采用粒徑為220±40nm的感光微粒(美國(guó)PentaTek公司) 制備方法 a、感光微?；鞈乙禾幚砦∫欢康母泄馕⒘Ｓ诟咚倮鋬鲭x心機(jī)中離心，棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲細(xì)胞破碎儀上超聲至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調(diào)節(jié)感光微粒濃度至100mg/ml。
b、親和素溶液配制稱量一定量Avidin，加MES緩沖液溶解至8mg/ml。
c、混合將處理好的感光微?；鞈乙?、8mg/ml的Avidin以及MES緩沖液，以2∶5∶1的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。
d、反應(yīng)MES緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液1∶25的體積比加入，迅速混勻。37℃旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時(shí)。
e、封閉MES緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液2∶1∶10的體積比加入上述溶液中，混勻，37℃旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2小時(shí)。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應(yīng)液體積比為5∶8，迅速混勻，37℃旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小時(shí)。
f、清洗向反應(yīng)好的溶液中加入MES緩沖液，高速冷凍離心機(jī)離心，棄上清，加入新鮮MES緩沖液超聲法重新懸浮，再次離心，如此清洗3次，最后用少量的感光試劑緩沖液進(jìn)行懸浮，測(cè)定固含量，用感光試劑緩沖液調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。
實(shí)施例4正常參考值的制定 根據(jù)對(duì)414個(gè)正常非癌癥患者血樣進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果，95％的樣品CEA水平小于5.35ng/ml，所以我們可以認(rèn)為0-5.35ng/ml是本試劑的臨床正常參考范圍。
實(shí)施例5定標(biāo)品的制備 定標(biāo)品使用衛(wèi)生部臨檢中心出品的癌胚抗原(CEA)定量參考品，以新生牛血清為稀釋液，按照濃度0ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，40ng/ml，200ng/ml，1000ng/ml配制6個(gè)定標(biāo)品。
實(shí)施例6癌胚抗原(CEA)定量檢測(cè) 首先向反應(yīng)孔中分別加入樣品，再依次加入發(fā)光試劑(抗體包被的發(fā)光微粒)和生物素標(biāo)記抗體。然后放入儀器(光激化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng))，由儀器自動(dòng)按以下步驟操作振動(dòng)，37℃溫育。再自動(dòng)加入親和素包被的感光微粒后37℃再次溫育。溫育結(jié)束后儀器自動(dòng)產(chǎn)生激光照射微孔計(jì)算每孔發(fā)光光子量。
按上述方法檢測(cè)各個(gè)定標(biāo)品的發(fā)光光子量，將測(cè)得的光信號(hào)值與相應(yīng)的定標(biāo)品濃度采用cubic spline擬和作圖即得，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性。
在定量測(cè)定中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按樣本實(shí)測(cè)光信號(hào)值計(jì)算每一個(gè)樣本的CEA含量，單位是ng/ml。
檢測(cè)條件的優(yōu)化試驗(yàn) 1.1溫育時(shí)間的確定 試驗(yàn)材料采用抗體包被的300ug/ml的發(fā)光微粒試劑(下簡(jiǎn)稱發(fā)光抗體試劑)和50ug/ml的生物素標(biāo)記抗體試劑，及40ug/ml的親和素包被的感光微粒試劑 檢驗(yàn)樣本定標(biāo)品6和質(zhì)控品QcL，QcH。
初始反應(yīng)條件加樣量為樣品25ul，發(fā)光微粒試劑25ul，生物素標(biāo)記抗體試劑25ul，親和素包被的感光微粒試劑為175ul，兩步溫浴。
1.1.1第一步溫育時(shí)間的確定 第一步溫育時(shí)間分別為10min、15min、20min、30min，第二步溫育時(shí)間為20min對(duì)檢驗(yàn)樣本進(jìn)行檢測(cè)，分別考察分析靈敏度、特異性、HOOK效應(yīng)、精密度、線性等指標(biāo)。結(jié)果見下表
根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在其余條件相同的情況下，第一步溫育時(shí)間為20min結(jié)果已經(jīng)趨于穩(wěn)定，延長(zhǎng)第一步溫育時(shí)間已經(jīng)沒有實(shí)際意義，故將第一步溫育時(shí)間確定為20min。
1.1.2第二步溫育時(shí)間的確定 第一步溫育時(shí)間為15min，第二步溫育時(shí)間分別為10min、15min、20min、30min對(duì)檢驗(yàn)樣本進(jìn)行檢測(cè)，分別考察分析靈敏度、特異性、HOOK效應(yīng)、精密度、線性等指標(biāo)。結(jié)果見下表

對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析比較，在其余條件相同的情況下，第二步溫育時(shí)間為15min結(jié)果已經(jīng)趨于穩(wěn)定，延長(zhǎng)第二步溫育時(shí)間已經(jīng)沒有實(shí)際意義，所以我們將第二步溫育時(shí)間確定為為15min。
1.2加樣模式的考察 試驗(yàn)材料采用抗體包被的300ug/ml的發(fā)光微粒試劑(下簡(jiǎn)稱發(fā)光抗體試劑)和30ug/ml的生物素標(biāo)記抗體試劑，及40ug/ml的親和素包被的感光微粒試劑 檢驗(yàn)樣本定標(biāo)品6和質(zhì)控品QcL，QcH。
初始反應(yīng)條件依次添加樣品、發(fā)光微粒試劑、生物素標(biāo)記抗體試劑、親和素包被的感光微粒，兩步溫浴，其中第一溫浴時(shí)間為20min，第二溫浴時(shí)間為15min。
設(shè)計(jì)了2種加樣模式進(jìn)行考察。
模式125ul樣品+25ul發(fā)光抗體試劑+25ul生物素化抗體試劑+175ul親和素包被的感光微粒試劑； 模式215ul樣品+15ul發(fā)光抗體試劑+15ul生物素化抗體試劑+105ul親和素包被的感光微粒試劑； 在初始條件下相同的情況下，按照以上兩種加樣模式對(duì)內(nèi)控品進(jìn)行檢測(cè)，分別考察分析靈敏度、特異性、HOOK效應(yīng)、精密度、線性等指標(biāo)。結(jié)果見下表
根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，模式1靈敏度、精密性及HOOK效應(yīng)皆好于模式2，故選擇模式1。
1.3發(fā)光抗體、生物素化抗體、親和素包被的感光微粒濃度的篩選 試驗(yàn)材料采用抗體包被的發(fā)光微粒試劑(下簡(jiǎn)稱發(fā)光抗體試劑)和生物素標(biāo)記抗體試劑，及親和素包被的感光微粒試劑 檢驗(yàn)樣本靈敏度參考品和質(zhì)控品QcL，QcH。
初始反應(yīng)條件依次添加25ul樣品、25ul發(fā)光微粒試劑、25ul生物素標(biāo)記抗體試劑、175ul親和素包被的感光微粒，兩步溫浴，其中第一溫浴時(shí)間為20min，第二溫浴時(shí)間為15min。
1.3.1發(fā)光抗體和生物素化抗體濃度的篩選 親和素包被的感光微粒采用40ug/ml的濃度，分別配制濃度為200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml的發(fā)光抗體以及濃度為30ug/ml、40ug/ml、50ug/ml的生物素化抗體交叉配對(duì)進(jìn)行檢測(cè)，在初始條件下結(jié)果分別如下 200ug/ml發(fā)光抗體
300ug/ml發(fā)光抗體

400ug/ml發(fā)光抗體
對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析比較，發(fā)光試劑的濃度在300μg/ml，生物素化抗體的濃度在50μg/ml時(shí)結(jié)果最為理想，故選擇以上濃度為工作濃度。
1.3.2親和素包被的感光微粒濃度篩選 發(fā)光抗體濃度選用300ug/ml，生物素化抗體的濃度選用50ug/ml，親和素包被的感光微粒濃度分別配制為20ug/ml，40ug/ml，60ug/ml，在初始反應(yīng)條件下，結(jié)果如下

根據(jù)信噪比、Hook效應(yīng)比較及Qc L和Qc H的測(cè)定濃度，親和素包被的感光微粒濃度在40ug/ml時(shí)結(jié)果最為理想。
實(shí)施例7評(píng)價(jià)試驗(yàn) 試劑采用發(fā)光抗體試劑(濃度300ug/ml)、生物素標(biāo)記抗體試劑(濃度為50ug/ml)及親和素包被的感光微粒試劑(濃度為40ug/ml)。
檢測(cè)方法在反應(yīng)孔中分別加入25μl樣品，再依次加入25μl發(fā)光試劑和25μl生物素化抗體試劑。然后放入儀器，由儀器自動(dòng)按以下步驟操作振動(dòng)，37℃溫育20分鐘，再自動(dòng)加入親和素包被的感光微粒試劑175μl后37℃溫育15分鐘。儀器自動(dòng)產(chǎn)生激光照射微孔計(jì)算每孔發(fā)光光子量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以推算樣品CEA濃度，單位是ng/ml，最后打印試驗(yàn)報(bào)告。
1.定量模式性能評(píng)價(jià) 1.1分析靈敏度的檢測(cè) 檢測(cè)10孔定標(biāo)品1(0ng/ml)，計(jì)算其RLU均值(AVE)和二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，以AVE±2SD反代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的濃度值即為本試劑盒的分析靈敏度 經(jīng)檢測(cè)，分析靈敏度分別為0.083ng/ml，不高于0.1ng/ml。
1.2檢測(cè)范圍 在3個(gè)臨床試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)1042個(gè)正常非癌癥患者的血樣進(jìn)行檢測(cè)，99％的樣品CEA水平小于5.35ng/ml。而高濃度CEA水平的病人樣品可導(dǎo)致RLU(相對(duì)光子單位)的反常性下降(即高滴度的鉤帶效應(yīng))。在本測(cè)定方法中，CEA水平高達(dá)100ug/ml的病人樣品的檢測(cè)結(jié)果將大于1000ng/ml。
因此確定檢測(cè)范圍為0.1-1000ng/ml。
1.4特異性檢測(cè) 檢測(cè)AFP與PSA特異性參考品，不得檢出假陽性 1.5線性的檢測(cè) 對(duì)除0值外其他5點(diǎn)定標(biāo)品(實(shí)施例5制備)做線性分析，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)r(r應(yīng)大于0.99)，r＝0.998 1.6精密性的檢測(cè) 分別采用2個(gè)批號(hào)的試劑對(duì)高、低2個(gè)水平的癌胚抗原(CEA)質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)10次，將結(jié)果數(shù)值代入公式，計(jì)算CV值
1.7Hook試驗(yàn) 由上述結(jié)果可知，Hook效應(yīng)在100ug/ml均未見 1.8干擾性試驗(yàn) 在一份已知濃度的臨床標(biāo)本中添加血紅蛋白、甘油三酯及膽紅素制成250mg/dL血紅蛋白的溶血標(biāo)本、500mg/dL甘油三酯的脂血標(biāo)本及10mg/dL膽紅素的黃疸標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定值與原濃度的偏差不得超過10％。
由上述結(jié)果可知，500mg/dL甘油三酯和10mg/dL膽紅素對(duì)本產(chǎn)品無明顯干擾，但250mg/dL血紅蛋白對(duì)本產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果影響超過10％，因此盡量避免樣本嚴(yán)重溶血。
實(shí)施例8比較試驗(yàn) 乩試劑采用發(fā)光抗體試劑(300ug/ml)、生物素標(biāo)記抗體試劑(50ug/ml)及親和素包被的感光微粒試劑(40ug/ml)。
以羅氏公司CEA試劑盒(電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng))為參照進(jìn)行了質(zhì)量水平比較，結(jié)果如下 收集經(jīng)羅氏公司CEA試劑盒檢測(cè)過的臨床標(biāo)本250份，再以本發(fā)明的CEA光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒測(cè)定每份標(biāo)本，作平行比較，結(jié)果如圖4。
結(jié)果表明兩種方法間的相關(guān)性y＝0.7725x+0.5144，r＝0.97。說明本發(fā)明的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒(光激化學(xué)發(fā)光法)跟國(guó)外知名廠家生產(chǎn)的類似產(chǎn)品相比，整個(gè)產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)大致相當(dāng)。且該試劑盒成本底、靈敏度高、精密性好、檢測(cè)范圍寬、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)，適合于向臨床推廣。
實(shí)施例9試劑盒的組配 將實(shí)施例1-3中按照各種方法制備的的三種試劑分別獨(dú)立包裝，組配后獲得基本試劑盒?？捎糜跈z測(cè)待測(cè)樣本的光激化學(xué)反應(yīng)光信號(hào)。
在上述試劑盒中加入獨(dú)立包裝的實(shí)施例5配制的定標(biāo)品后獲得定量檢測(cè)試劑盒。可用于定量檢測(cè)癌胚抗原(CEA)。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)癌胚抗原的檢測(cè)微粒，為抗-CEA抗體包被的發(fā)光微粒。
2.如權(quán)利要求1所述用于檢測(cè)癌胚抗原的檢測(cè)微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒粒徑為50nm到400nm。
3.如權(quán)利要求1所述用于檢測(cè)癌胚抗原的檢測(cè)微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒表面官能團(tuán)選自羧基或醛基。
4.如權(quán)利要求1所述用于檢測(cè)癌胚抗原的檢測(cè)微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒的發(fā)光量為150,000-350,000光子數(shù)/100μg發(fā)光微粒。
5.如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述用于檢測(cè)癌胚抗原的檢測(cè)微粒，其特征在于，所述檢測(cè)微粒經(jīng)如下工藝制得
a)混合將發(fā)光微粒與抗-CEA抗體混合于緩沖液中；
b)反應(yīng)加入緩沖液配制的EDAC溶液混合并反應(yīng)；
c)往步驟b獲得的反應(yīng)液中加入緩沖液配制的BSA溶液混勻并反應(yīng)；
d)清洗產(chǎn)物，獲得抗-CEA抗體包被的發(fā)光微粒。
6.如權(quán)利要求5所述用于檢測(cè)癌胚抗原的檢測(cè)微粒，其特征在于，所述緩沖液為MES緩沖液。
7.如權(quán)利要求5所述用于檢測(cè)癌胚抗原的檢測(cè)微粒，其特征在于，所述步驟a中，發(fā)光微粒與抗-CEA抗體的質(zhì)量比例為(8-15)∶1。
8.如權(quán)利要求7所述用于檢測(cè)癌胚抗原的檢測(cè)微粒，其特征在于，所述，發(fā)光微粒與抗-CEA抗體的質(zhì)量比例為12.5∶1。
9.如權(quán)利要求5所述用于檢測(cè)癌胚抗原的檢測(cè)微粒，其特征在于，所述步驟d的清洗的方式為離心法清洗。
10.一種癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒，包括權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述用于檢測(cè)癌胚抗原的檢測(cè)微粒。
11.如權(quán)利要求10所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體或親和素包被的感光微粒中的一種或兩種。
12.如權(quán)利要求11所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體中，生物素與抗體的分子比例為(30-50)∶1。
13.如權(quán)利要求11所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述親和素包被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質(zhì)量比例為1∶(3-10)。
14.如權(quán)利要求11所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述用于檢測(cè)癌胚抗原的檢測(cè)微粒、生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體以及親和素包被的感光微粒分別獨(dú)立包裝，且均為混懸液。
15.如權(quán)利要求14所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述混懸液的溶劑選自HEPES緩沖體系或Tris緩沖體系。
16.如權(quán)利要求15所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述用于檢測(cè)癌胚抗原的檢測(cè)微粒混懸液的溶劑為pH8.0的成分為HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H2O的HEPES緩沖液。
17.如權(quán)利要求15所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體混懸液的溶劑為pH8.0的成分為Tris、NaCl和EDTA-Na-2H2O的Tris緩沖液。
18.如權(quán)利要求15所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述親和素包被的感光微粒混懸液的溶劑為成分為HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H2O的HEPES緩沖液。
19.如權(quán)利要求14所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述混懸液中還包括蛋白保護(hù)劑、防止微粒聚集的穩(wěn)定試劑或防腐劑中的一種或多種。
20.如權(quán)利要求10-19中任一權(quán)利要求所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)試劑盒中還包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。
21.如權(quán)利要求10-19中任一權(quán)利要求所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括多種濃度已知的癌胚抗原溶液，不同濃度的癌胚抗原溶液分別獨(dú)立包裝。
22.如權(quán)利要求10-21中任一權(quán)利要求所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括下列步驟
a)在反應(yīng)孔中加入樣品、試劑盒中用于檢測(cè)癌胚抗原的檢測(cè)微粒和生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體，獲得初始反應(yīng)溶液，混合反應(yīng)；
b)再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應(yīng)溶液進(jìn)行反應(yīng)；
c)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光光子量獲得光信號(hào)值。
23.如權(quán)利要求22所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述激發(fā)光光源波長(zhǎng)范圍為600-700nm。
24.如權(quán)利要求22所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述激發(fā)光光源的功率范圍為5-100mw。
25.如權(quán)利要求22所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟a和b的反應(yīng)條件為37℃溫育10-30分鐘。
26.如權(quán)利要求25所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟a的反應(yīng)條件為37℃溫育20分鐘，步驟b的反應(yīng)條件為37℃溫育15分鐘。
27.如權(quán)利要求22所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述用于檢測(cè)癌胚抗原的檢測(cè)微粒為混懸液，用于檢測(cè)癌胚抗原的檢測(cè)微粒在混懸液中的濃度為200-400ug/ml；所述生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體為混懸液，生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體在混懸液中的濃度為30-50ug/ml；所述親和素包被的感光微粒為混懸液，親和素包被的感光微粒在混懸液中的濃度為20-100ug/ml。
28.如權(quán)利要求27所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述用于檢測(cè)癌胚抗原的檢測(cè)微粒在混懸液中的濃度為300ug/ml；所述生物素標(biāo)記的抗-CEA抗體在混懸液中的濃度為50ug/ml；所述親和素包被的感光微粒在混懸液中的濃度為40ug/ml。
29.如權(quán)利要求22所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述初始反應(yīng)溶液的體積為45-75ul；最終反應(yīng)溶液的體積為150-250ul。
30.如權(quán)利要求29所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述初始反應(yīng)溶液的體積為75ul；最終反應(yīng)溶液的體積為250ul。
31.如權(quán)利要求22-30中任一權(quán)利要求所述癌胚抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，還包括根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品CEA的含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及癌胚抗原的診斷試劑，公開了一種癌胚抗原的檢測(cè)微粒，為抗-CEA抗體包被的發(fā)光微粒。本發(fā)明還公開了上述癌胚抗原的檢測(cè)微粒的制備及應(yīng)用。此外，本發(fā)明又進(jìn)一步公開了一種測(cè)定樣品中癌胚抗原的體外檢測(cè)試劑盒，同時(shí)公開了該試劑盒的使用方法。本發(fā)明的試劑盒可定量測(cè)定人血清樣品中癌胚抗原，可以與其它血清和臨床信息聯(lián)合用于癌癥的輔助診斷及癌癥病人治療效果的監(jiān)測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/76GK101769927SQ200810204999
公開日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者趙衛(wèi)國(guó), 王海蛟, 陳晨輝 申請(qǐng)人:博陽生物科技(上海)有限公司