專利名稱：：胎兒甲種球蛋白檢測微粒、其制備及應用的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及癌癥的診斷試劑，具體涉及基于光激化學發(fā)光原理的胎兒甲種球蛋白(AFP)檢測顆粒、其制備及應用。
背景技術(shù)：
：免疫學檢測是基于抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種手段，由于其可以利用同位素、酶、化學發(fā)光物質(zhì)等對被檢測信號進行放大和顯示，因此常被用于檢測蛋白質(zhì)，激素等微量生物活性物質(zhì)。我國免疫學檢測基本經(jīng)歷了放射免疫檢測(興起于20世紀70年代，現(xiàn)仍普遍使用于縣級以上醫(yī)院)；酶聯(lián)免疫檢測(興起于20世紀80年代，各臨床機構(gòu)普遍使用)；以化學發(fā)光為代表的生物學標記及免疫檢測技術(shù)(20世紀90年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成長期)三個階段。這一衍變過程主要是基于對檢測方法的敏感性、準確性、以及操作簡捷性的需求的不斷提高而決定的。化學發(fā)光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay)是近十年來在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術(shù)。檢測原理是以發(fā)光物質(zhì)作為信號放大系統(tǒng)并籍助其發(fā)光強度直接測定免疫結(jié)合。由于其高靈敏度，檢測范圍寬等優(yōu)點，已成為放射性免疫分析與普通酶免疫分析的取代者，是免疫學檢測重要的發(fā)展方向。但目前國內(nèi)自行研制的化學發(fā)光檢測試劑，大多為非均相反應，采用化學底物直接標記，通過化學反應激發(fā)。其分析過程與傳統(tǒng)酶標檢測類似，需反復清洗與分離，檢測耗時長，自動化程度不高。國外廠家檢測試劑隨發(fā)光基質(zhì)與檢測形式而各不相同。以Abbott，Bayer與Chiron等公司為代表的化學激發(fā)，即以化學發(fā)光底物直接標記抗原或抗體進行免疫測定。最常用的為吖啶酯，在堿性環(huán)境中可被過氧化氫氧化而發(fā)光。BD則以AKP，金鋼脘為基質(zhì)采用酶促化學發(fā)光。Roche為則采用電化學發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)，發(fā)光底物二價的三聯(lián)吡啶釕及反應參與物三丙胺在電極表面失去電子而被氧化。氧化的三丙胺失去一個H+而成為強還原劑，將氧化型的三價釕還原為激發(fā)態(tài)的二價釕，隨即釋放光子而恢復為基態(tài)的發(fā)光底物。這一過程在電極表面周而復始地進行，不斷地發(fā)出光子而常保持底物濃度的恒定。因反應過程中牽涉到分離清洗，自動化設計復雜，儀器相當昂貴。此外，發(fā)光基質(zhì)的穩(wěn)定性也是一大問題。光激化學發(fā)光法通過引入激光技術(shù)與納米微球技術(shù)，成功地解決了上述不足。因反應在均相中進行，既加快了反應速度，又避免了反復分離與清洗步驟，能有效降低檢測背景值，減少反應時間，并可實現(xiàn)自動化操作。目前，PE公司推出了針對生物研究用的光激化學發(fā)光試劑Alpha-Screen。但在臨床檢測領域，還沒有面世的光激化學發(fā)光檢測試劑，尤其是用于腫瘤標志物與肝炎檢測項目。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可用于定量檢測胎兒甲種球蛋白(AFP)的檢測微粒，其4制備、檢測條件及應用。本發(fā)明的技術(shù)原理本發(fā)明的胎兒甲種球蛋白(AFP)檢測試劑及試劑盒與光激化學發(fā)光檢測技術(shù)相關，光激化學發(fā)光免疫技術(shù)是一種利用化學發(fā)光物質(zhì)發(fā)射的光波進行免疫測定的方法。該技術(shù)主要整合了高分子微粒技術(shù)，有機合成，蛋白質(zhì)化學與臨床檢測相關領域的研究。本發(fā)明之所以能檢測胎兒甲種球蛋白(AFP)，是由于在均相條件下，將內(nèi)部帶有染料的感光微粒(納米級)以及包被有抗-AFP抗體并且內(nèi)部帶有發(fā)光化合物的發(fā)光微粒(納米級)的混合物作為試劑和檢測樣品混合。此時納米感光微粒和包被有抗-AFP抗體的納米發(fā)光微粒可迅速有效地捕捉AFP，在近距離內(nèi)，三者形成免疫夾心復合物。激發(fā)光照射后，納米感光微粒中的染料被誘導激活，并釋放高能態(tài)的活性氧離子(單線態(tài)氧)。該高能態(tài)的活性氧離子被近距離的納米發(fā)光微粒俘獲，從而傳遞能量以激活所述發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物。數(shù)微秒后，發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物將釋放出高能級紅光。用光子計數(shù)器測定這些高能級光子，并通過電腦將光子數(shù)換算為目標分子濃度，光子數(shù)的多少即精確地反映了目標分子的濃度。而當樣本不含AFP時，無法在近距離形成免疫夾心復合物，活性氧離子也無法傳遞至發(fā)光微粒表面。活性氧離子在液相中迅速衰減，檢測時則無高能級紅光產(chǎn)生。具體原理參見圖l及圖2?；谏鲜鲈恚景l(fā)明第一方面提供了一種用于檢測胎兒甲種球蛋白(AFP)的檢測微粒，為抗-AFP抗體包被的發(fā)光微粒。本發(fā)明第二方面提供了一種胎兒甲種球蛋白(AFP)的檢測試劑盒，包括上述抗-AFP抗體包被的發(fā)光微粒，試劑盒中還可包括生物素標記的抗-AFP抗體和/或親和素包被的感光微粒。在試劑盒中，上述抗-AFP抗體包被的發(fā)光微粒、生物素標記的抗-AFP抗體和親和素包被的感光微粒分別以溶液的形式置于各自獨立的容器中。上述含有抗-AFP抗體包被的發(fā)光微粒、生物素標記的抗-AFP抗體或親和素包被的感光微粒的溶液的溶劑可以是常規(guī)的適合抗原抗體反應的溶劑體系，如HEPES緩沖體系、Tris緩沖體系?？筥AFP抗體包被的發(fā)光微粒的溶劑優(yōu)選PH8.0的成分為HEPES、NaCl和EDTA-Na_2H20的HEPES緩沖液，生物素標記的抗-AFP抗體的溶劑優(yōu)選pH8.0的成分為Tris、NaCl和EDTA-Na_2H20的Tris緩沖液，親和素包被的感光微粒的溶劑優(yōu)選HEPES、NaCl和EDTA-Na_2H20的HEPES緩沖液，上述各種溶劑中還可添加起封閉和蛋白保護作用的物質(zhì)如BSA以及防止微粒聚集的穩(wěn)定試劑如Tween20，出于對試劑防腐以及長期儲存的考慮還可在溶劑中添加防腐劑，防腐劑優(yōu)選100U/ml慶大霉素和質(zhì)量百分比為萬分之五的Proclin300作為防腐劑。試劑盒中還可包括陽性對照、陰性對照以及參考樣品。參考樣品為含有胎兒甲種球蛋白的溶液，其胎兒甲種球蛋白的濃度為乙型肝炎表面抗原臨床cutoff點對應的濃度。在用于定量檢測胎兒甲種球蛋白(AFP)時，上述試劑盒中還可包括含有多種確定濃度胎兒甲種球蛋白(AFP)的溶液。上述不同胎兒甲種球蛋白(AFP)濃度的溶液分別獨立包裝。上述發(fā)光微粒是指填充有發(fā)光化合物和鑭系元素化合物的高分子微粒。發(fā)光化合物可以是Dioxene(二氧雜環(huán)己烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，鑭系元素化合物可以是Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen等，該微?？捎墒袌錾腺彽?。5研究發(fā)現(xiàn)，由于最終的檢測反應是均相反應，發(fā)光微粒的粒徑(微粒的平均直徑)太大(>400nm)會自然沉降，影響檢測效果，微粒的粒徑太小(<50nm)，會使制備過程中的清洗工作比較困難，對抗體連接工作不利，因此發(fā)光微粒的粒徑范圍應在50-400nm之間，較好為100-300nm之間，優(yōu)選250nm。發(fā)光微粒的表面官能團可以是任何能聯(lián)接蛋白質(zhì)的基團，但最常用的主要有羧基和醛基表面官能團的微粒。使用不同的微粒表面官能團，連接抗體的反應方式和條件也不相同。鑒于獲得更好的抗-AFP抗體連接效率，試劑穩(wěn)定性和連接重復性，在采用之后記載的改進方法作為抗體的連接方法時優(yōu)選羧基表面官能團的微粒。發(fā)光微粒的發(fā)光量會直接影響最終檢測的發(fā)光效果。市場提供的發(fā)光微粒發(fā)光量一般會在50，000-10，000，000光子數(shù)/100ug發(fā)光微粒范圍內(nèi)，優(yōu)選150，000-350，000光子數(shù)/100ug)發(fā)光微粒。上述生物素標記的抗-AFP抗體中，生物素與抗體的分子比例較佳為(10-20):1，優(yōu)選i5:i。上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。在670-690nm光激發(fā)下，可以產(chǎn)生單線態(tài)氧離子，當其與發(fā)光微粒距離足夠近的情況下，單線氧離子傳遞到發(fā)光微粒，與發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物反應，產(chǎn)生紫外光，紫外光再進一步激發(fā)鑭系元素化合物，產(chǎn)生520-620nm波長光子。感光化合物可以是酞菁染料等，該微粒也可由市場上購得。上述親和素包被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質(zhì)量比例無特殊限制，較佳為i:(3-10)，優(yōu)選i:5。市售感光微粒均適用于本發(fā)明，微粒粒徑較佳為180-260nm，優(yōu)選220nm?？?AFP抗體包被的發(fā)光微粒可采用NaBH3CN的還原胺化反應法制得，NaBH3CN的還原胺化反應步驟如下1)混合將發(fā)光微粒與抗-AFP抗體按質(zhì)量比例為lO:(1-3)混合于緩沖液中；2)反應加入緩沖液配制的NaBH3CN溶液混合并反應；3)封閉加入緩沖液配制的Gly及NaBH3CN溶液，混勻反應后，再加入BSA溶液封閉；4)清洗產(chǎn)物，獲得抗-AFP抗體包被的發(fā)光微粒。其中，混合步驟中，發(fā)光微粒與抗-AFP抗體的質(zhì)量比例為10:(1-3)，優(yōu)選10:2反應緩沖液可為MES緩沖液、磷酸緩沖液，優(yōu)選磷酸緩沖液，濃度優(yōu)選0.02M，反應步驟中，反應溶液中發(fā)光微粒的濃度可為10-40mg/ml，優(yōu)選20mg/ml。改進的，抗-AFP抗體包被的發(fā)光微?？刹捎孟率龇椒ㄖ频?)混合將發(fā)光微粒與抗-AFP抗體混合于緩沖液中。較佳的，緩沖液為MES緩沖液，發(fā)光微粒與抗-AFP抗體的質(zhì)量比例為(8-15):1，優(yōu)選12.5:1。2)反應加入緩沖液配制的EDAC(l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)溶液混合并反應。較佳的，緩沖液為MES緩沖液，混合溶液中，發(fā)光微粒與EDAC的質(zhì)量比為(15-40):l混合，優(yōu)選質(zhì)量比為25:1。反應條件為37t:旋轉(zhuǎn)反應。一般約48小時反應充分。3)往步驟2獲得的反應液中加入緩沖液配制的BSA(bovineserumalbumin)溶液混勻并反應。較佳的，緩沖液為MES緩沖液。BSA溶液與步驟2獲得的反應液體積比較佳為l:i-i:2。反應條件為37t:旋轉(zhuǎn)反應。一般約16小時反應充分。4)清洗產(chǎn)物，獲得抗-AFP抗體包被的發(fā)光微粒。清洗的方式可以為離心法清洗或透析法清洗。透析法清洗步驟采用反應緩沖液透析，每次4-5小時，更換緩沖液4次。透析清洗操作時間較長，且微粒損失較多，造成收率降低。離心法清洗步驟包括離心去上清，加入反應緩沖液洗滌，超聲處理打開沉淀，如此反復3-5次。離心法清洗時離心力會使發(fā)光微粒暫時聚集在一起，但經(jīng)過超聲處理可以很容易再次分散打開，此法操作時間短，且收率較高。因此優(yōu)選采用此種清洗方式。上述改進的制備方法與NaBH3CN的還原胺化反應法的主要差別在于主要反應試劑NaBH3CN替換成了EDAC，該試劑的替換，不僅使得反應時間與NaBH3CN的還原胺化反應法相比縮短了4個多小時，而且發(fā)光微粒與抗-AFP抗體的交聯(lián)效率獲得了提高，節(jié)省了抗體用量，此外，試驗表明，該方法制得的檢測微粒與NaBH3CN的還原胺化反應法制得的檢測微粒相比，在相同條件下反應信號更強，靈敏度更高，檢測范圍也更廣。親和素包被的感光微?？刹捎肗aBH3CN的還原胺化反應法制備。本發(fā)明第三方面，公開上述試劑盒的使用方法，包括下列步驟將待測樣品與試劑盒中用于檢測胎兒甲種球蛋白(AFP)的檢測微粒、生物素標記的抗-AFP抗體和親和素包被的感光微粒混合反應，而后用激發(fā)光照射反應孔，測量每個反應孔發(fā)光光子量獲得光信號值。上述激發(fā)光光源波長范圍為600-700nm，優(yōu)選640_680nm;反應孔發(fā)光的發(fā)射光光源波長范圍為600-680nm，優(yōu)選610-620nm;發(fā)射光延遲時間范圍為100ms-1000ms;激發(fā)光光源的功率范圍為5-100mw，優(yōu)選40-60w。較佳的，上述試劑盒的使用方法具體為1)在反應孔中加入樣品、試劑盒中用于檢測胎兒甲種球蛋白(AFP)的檢測微粒和生物素標記的抗-AFP抗體，獲得初始反應溶液，混合反應；2)再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應溶液進行反應；3)激發(fā)光照射反應孔，測量每個反應孔發(fā)光光子量獲得光信號值。上述步驟1)的反應條件為37t:溫育10-30分鐘，優(yōu)選20分鐘，步驟2的反應條件也為37。C溫育10-30分鐘，優(yōu)選15分鐘。步驟1中，抗-AFP抗體包被的發(fā)光微粒為混懸液，抗-AFP抗體包被的發(fā)光微粒在混懸液中的濃度無特殊限制，200-400ug/ml，優(yōu)選300ug/ml。步驟1中，生物素標記的抗-AFP抗體也為混懸液，生物素標記的抗-AFP抗體在混懸液中的濃度無特殊限制，可以為30-40ug/ml，優(yōu)選30ug/ml。步驟2中，親和素包被的感光微粒為混懸液，親和素包被的感光微粒在混懸液中的濃度一般控制在30-100ug/ml，可以為30-50ug/ml，優(yōu)選40ug/ml。上述方法中，初始反應溶液的體積無特殊限制，可以為45-75ul，優(yōu)選75ul;最終反應溶液的體積也無特殊限制，可以為150-250ul，優(yōu)選250ul。上述樣品包括血清、血槳和全血。當本發(fā)明的檢測微粒及檢測試劑盒用于定量檢測胎兒甲種球蛋白(AFP)時，還包括根據(jù)標準曲線計算待測樣品AFP含量。本發(fā)明是采用光激化學發(fā)光檢測技術(shù)，定量測定人血清樣品中胎兒甲種球蛋白(AFP)的體外診斷試劑盒，可以與其它血清和臨床信息聯(lián)合用于癌癥的輔助診斷及癌癥病人治療效果的監(jiān)測。本發(fā)明與檢測對象相近的胎兒甲種球蛋白(AFP)酶免法試劑盒在方法學上比較，酶免法以OD值體現(xiàn)樣本檢測值，OD值可檢測范圍窄，僅可做定性檢測，且靈敏度低。本發(fā)明的試劑盒采用光激化學發(fā)光法測定標本中的AFP，具有靈敏度高、檢測范圍寬等特點，在方法學上較酶免法能達到更高的靈敏度和更優(yōu)的檢測范圍。圖1:光激化學發(fā)光免疫技術(shù)原理圖微粒結(jié)合形成二聚體，產(chǎn)生光子信號圖2:光激化學發(fā)光免疫技術(shù)原理圖未結(jié)合微粒，無光子信號產(chǎn)生圖3:單線態(tài)氧隨微粒間距離衰減，在大概600nm的距離，基本沒有單線氧的存在，因此也不發(fā)光FGBEAD:發(fā)光微粒，內(nèi)含發(fā)光分子；GGBEAD:感光微粒，內(nèi)含感光分子；SingletOxygen:單線態(tài)氧，活性氧離子；A/B:兩者可直接或間接特異結(jié)合的活性分子。如在雙抗夾心檢測中，A，B為針對靶分子C不同的表位的單克隆抗體圖4:本發(fā)明的試劑盒與進口試劑盒檢測比較試驗結(jié)果具體實施例方式下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。實驗中儀器原料來源及試劑配方原料及試劑廠家Biotin-X-X-NHSSigmaTLC>95%BSAEquitech/proteasefreeGlySigma>95%HEPES華美TrisSigmaNaBH3CNAcrosAvidinPierceEDACSigmaEDACSigma抗-AFP抗體biospacific感光微粒美國PentaTek公司美國PentaTek公司型號Model370MultiS薩MK3752PF95廠家Nicomplabsystem上海光譜有限公司上海棱光技術(shù)有限公司博陽生物/上海北濱光子發(fā)光微粒儀器粒徑儀酶標儀紫外可見分光光度計熒光分光光度計光激化學發(fā)光分析系統(tǒng)實施例1抗-AFP抗體包被的發(fā)光微粒的制備抗-AFP抗體包被的發(fā)光微粒改進的制備方法如下1)發(fā)光微粒混懸液處理吸取一定量的羧基發(fā)光微粒于高速冷凍離心機中離心，棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲破碎至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)光微粒濃度至100mg/ml。2)抗體處理AFP抗體于0.05Mp朋.0的MES緩沖液(以下簡稱MES緩沖液)透析，透析完成后測定濃度，并調(diào)節(jié)濃度至8mg/ml。3)MES緩沖液、100mg/ml的發(fā)光微?；鞈乙?MES緩沖液)和8mg/ml的抗-AFP抗體溶液(MES緩沖液)以l:1:1的體積比進行混合，迅速混勻，得到反應液。4)用MES緩沖液配制40mg/ml的EDAC溶液，按照與發(fā)光微粒100mg/100uLEDAC的比加入，迅速混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應48小時。5)加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應液體積比為5:8，迅速混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應16小時。6)用MES緩沖液離心清洗四次，最后用發(fā)光試劑緩沖液進行懸浮，測定粒徑和固含量，調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。將上述方法與采用NaBH3CN的還原胺化反應法制得的檢測微粒進行比較。NaBH^N還原胺化反應法的制備方法1)發(fā)光微粒混懸液處理吸取一定量的發(fā)光微粒于高速冷凍離心機中離心，棄去上清，加入一定量Mes緩沖液，超聲破碎至微粒重新懸浮，加入磷酸緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)光微粒濃度至100mg/ml。2)抗體處理抗-AFP抗體于0.02MpH7.0的Mes緩沖液透析，透析完成后測定濃度，并調(diào)節(jié)濃度至8mg/ml。3)Mes緩沖液、100mg/ml的發(fā)光微?；鞈乙?Mes緩沖液)和8mg/ml的抗-AFP抗體溶液(Mes緩沖液)以l:2:5的體積比進行混合，迅速混勻，得到反應液。4)用Mes緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應液1:25的體積比加入，迅速混勻，37°C旋轉(zhuǎn)反應48小時。5)Mes緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應液2:1:10的體積比加入上述溶液中，混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應2小時。再加入200mg/ml的BSA溶液(Mes緩沖液)，其與反應液體積比為5:8，迅速混勻，37。C旋轉(zhuǎn)反應16小時。6)用Mes緩沖液離心清洗四次，最后用發(fā)光試劑緩沖液進行懸浮，測定粒徑和固含量，調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。兩者制備結(jié)果的比較1.節(jié)省了制備時間<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.提高了抗體交聯(lián)效率，節(jié)省了抗體用量<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3.增強了反應信號<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>5.擴大了檢測范圍Naffl3CN還原胺化反應法的檢測范圍改進的制備工藝檢測范圍300ug/mlAFP抗體的發(fā)光微粒、30ug/ml的生物素化AFP抗體與40ug/ml親和素包被的感光微粒反應0-750ng/ml0-1000ng/ml參照前述改進的制備方法制備抗-AFP抗體包被的發(fā)光微粒，并通過各項性能測試比較從以下幾方面進行了具體工藝條件的選擇研究研究中涉及的各個參數(shù)的檢測方法如下1.光信號檢測方法在反應孔中分別加入25ii1樣品，再依次加入25ii1發(fā)光試劑和25y1生物素化抗體試劑。然后放入儀器(光激化學發(fā)光分析系統(tǒng))，由儀器自動按以下步驟操作振動，37t:溫育20分鐘，再自動加入175ii1親和素包被的感光微粒試劑后37t:溫育15分鐘。儀器自動產(chǎn)生激光照射微孔計算每孔發(fā)光光子量。2.分析靈敏度檢測方法檢測10孔定標品1(Ong/ml)，計算其RLU均值(AVE)和二個標準偏差(SD)，以AVE士2SD反代入標準曲線，得到的濃度值即為本試劑盒的分析靈敏度。3.Hook檢測方法檢測AFP濃度分別為50ug/ml、80ug/ml、100ug/ml、125ug/ml的樣本光信號，結(jié)果應大于定標品6(1000ng/ml)。4.精密性檢測方法檢測AFP濃度分別為10ng/ml和200ng/ml的質(zhì)控品光信號，每個濃度做10孔重復測定，代入公式，計算CV值。低濃度的精密性測定表示為QCL，高濃度的精密性測定表示為QCH。5.線性檢測方法對除0值外其他5點定標品(實施例6制備)做線性分析，計算線性相關系數(shù)r(r應大于O.99)工藝條件選擇a.緩沖液及反應pH值選擇其它反應條件20mg/ml的發(fā)光微粒反應濃度，12.5:1的發(fā)光微粒與抗_AFP抗體質(zhì)量比，離心法清洗11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>根據(jù)以上實驗結(jié)果可知，O.05MMESpH6.0緩沖液靈敏度、CV好于0.02MPBpH7.0緩沖液。故選擇0.05MMESpH6.0緩沖液作為抗AFP包被發(fā)光微粒的反應緩沖液。b.發(fā)光微粒與抗體的反應比例其它反應條件0.05MMESpH6.0緩沖液作為反應緩沖液，離心法清洗。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>抗體加入量與發(fā)光微粒上包被的抗體量基本呈正比關系，但抗體繼續(xù)增加時包被上的抗體達到飽和。綜合考慮QC結(jié)果及成本問題，選擇12.5mg發(fā)光微粒與lmg抗-AFP抗體反應條件。c.清洗方式其它反應條件0.05MMESpH6.0緩沖液作為反應緩沖液，12.5:1的發(fā)光微粒與抗-AFP抗體比例。離心法清洗步驟12000rpm離心30分鐘，清洗3_5次。離心法清洗的離心力會使發(fā)光微粒暫時聚集，但經(jīng)過超聲處理很容易可再次分散打開。且操作時間短，收率較高?？紤]到生產(chǎn)周期以及生產(chǎn)成本，決定采用此種清洗方式。透析法清洗步驟100倍體積透析，每次4-5小時，更換緩沖液2次。透析清洗操作時間較長，透析過程中微粒損失較多。最終選擇250nm的粒徑，發(fā)光量為^250，000光子數(shù)/100ug的發(fā)光微粒，0.05MMESp朋.0緩沖液作為反應緩沖液，12.5:1的發(fā)光微粒與抗-AFP抗體比例，離心法清洗作為最優(yōu)制備條件。實施例2生物素標記抗體的制備制備方法1)抗體處理將抗-AFP抗體透析于0.1MNaHC03溶液，測定抗體濃度并調(diào)節(jié)至lmg/ml。2)用DMSO配制16.17mg/ml的Biotin溶液。3)標記取處理好的lmg/ml抗-AFP抗體標記抗體與配制好的Biotin溶液，二者按比例進行混合，迅速混勻。4t:靜置反應1216小時。4)透析將反應好的生物素標記抗體透析于生物素標記透析緩沖液(pH8.0)。5)將透析好的生物素化抗體吸出轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，取樣測定抗體濃度。將質(zhì)檢合格的生物素標記抗體濃度調(diào)節(jié)至0.5mg/ml。將抗體與Biotin按照不同比例進行反應并進行檢測標記分子比例(生物素抗體)10:115:120:1測定比例4.25:16.75:18.24:1分析靈敏度(ng/ml)0.180.110.13Hook(100ug/ml)光信號比1.111.241.21QCLCV(%)4.933.854.89QCHCV(%)4,894.225.24纟她0.9930.9990.997標記比例越高，與實際測定比例之間的偏差越大。從分析靈敏度及Hook效應等方面進行考慮，最終選擇15:l的比例。實施例3親和素包被的感光微粒的制備感光微粒采用粒徑為220±40nm的感光微粒(美國PentaTek公司)制備方法a、感光微?；鞈乙禾幚砦∫欢康母泄馕⒘Ｓ诟咚倮鋬鲭x心機中離心，棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲細胞破碎儀上超聲至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調(diào)節(jié)感光微粒濃度至100mg/ml。b、親和素溶液配制稱量一定量Avidin，加MES緩沖液溶解至8mg/ml。c、混合將處理好的感光微?；鞈乙?、8mg/ml的Avidin以及MES緩沖液，以2:5:1的體積比進行混合，迅速混勻，得到反應液。d、反應MES緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應液1:25的體積比加入，迅速混勻。37t:旋轉(zhuǎn)反應48小時。13e、封閉MES緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應液2:1:10的體積比加入上述溶液中，混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應2小時。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應液體積比為5:8，迅速混勻，37。C旋轉(zhuǎn)反應16小時。f、清洗向反應好的溶液中加入MES緩沖液，高速冷凍離心機離心，棄上清，加入新鮮MES緩沖液超聲法重新懸浮，再次離心，如此清洗3次，最后用少量的感光試劑緩沖液進行懸浮，測定固含量，用感光試劑緩沖液調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。實施例4正常參考值的制定根據(jù)對438個正常非肝癌患者的血樣進行檢測的結(jié)果，95%的樣品胎兒甲種球蛋白(AFP)水平小于7.0ng/ml，所以我們可以認為0-7.0ng/ml是本試劑的臨床正常參考范圍。實施例5定標品的制備定標品使用衛(wèi)生部臨檢中心出品的胎兒甲種球蛋白(AFP)定量參考品，以新生牛血清為稀釋液，按照濃度0ng/ml，5ng/ml，21ng/ml，97ng/ml，383ng/ml，1000ng/ml配制6個定標品實施例6胎兒甲種球蛋白(AFP)定量檢測首先向反應孔中分別加入樣品，再依次加入發(fā)光試劑(抗體包被的發(fā)光微粒)和生物素標記抗體。然后放入儀器(光激化學發(fā)光分析系統(tǒng))，由儀器自動按以下步驟操作振動，37t:溫育。再自動加入親和素包被的感光微粒后37t:再次溫育。溫育結(jié)束后儀器自動產(chǎn)生激光照射微孔計算每孔發(fā)光光子量。按上述方法檢測各個定標品的發(fā)光光子量，將測得的光信號值與相應的定標品濃度采用cubicspline擬和作圖即得，標準曲線呈線性。在定量測定中，根據(jù)標準曲線，按樣本實測光信號值計算每一個樣本的AFP含量，單位是ng/ml。檢測條件的優(yōu)化試驗1.l溫育時間的確定試驗材料采用抗體包被的300ug/ml的發(fā)光微粒試劑(下簡稱發(fā)光抗體試劑)和30ug/ml的生物素標記抗體試劑，及40ug/ml的親和素包被的感光微粒試劑檢驗樣本質(zhì)控品QcL，QcH。初始反應條件加樣量為樣品25ul，發(fā)光微粒試劑25ul，生物素標記抗體試劑25ul，親和素包被的感光微粒試劑為175ul，兩步溫浴。1.1.1第一步溫育時間的確定第一步溫育時間分別為10min、15min、20min、30min，第二步溫育時間為20min對檢驗樣本進行檢測，分別考察分析靈敏度、HOOK效應、精密度、線性等指標。結(jié)果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>對上述結(jié)果進行分析比較，在其余條件相同的情況下，第二步溫育時間為15min結(jié)果已經(jīng)趨于穩(wěn)定，延長第二步溫育時間已經(jīng)沒有實際意義，所以我們將第二步溫育時間確定為為15min。1.2加樣模式的考察試驗材料采用抗體包被的300ug/ml的發(fā)光微粒試劑(下簡稱發(fā)光抗體試劑)和30ug/ml的生物素標記抗體試劑，及40ug/ml的親和素包被的感光微粒試劑檢驗樣本質(zhì)控品QcL，QcH。初始反應條件依次添加樣品、發(fā)光微粒試劑、生物素標記抗體試劑、親和素包被的感光微粒，兩步溫浴，其中第一溫浴時間為20min，第二溫浴時間為15min。設計了2種加樣模式進行考察。模式1:25ul樣品+25ul發(fā)光抗體試劑+25ul生物素化抗體試劑+175ul親和素包被的感光微粒試劑；模式2:15ul樣品+15ul發(fā)光抗體試劑+15ul生物素化抗體試劑+105ul親和素包被的感光微粒試劑；在初始條件下相同的情況下，按照以上兩種加樣模式對企業(yè)內(nèi)控品進行檢測，分別考察分析靈敏度、HOOK效應、精密度、線性等指標。結(jié)果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>根據(jù)以上實驗結(jié)果可知，模式1靈敏度、精密性及H00K效應皆好于模式2，故選擇模式l。1.3發(fā)光抗體、生物素化抗體、親和素包被的感光微粒濃度的篩選試驗材料采用抗體包被的發(fā)光微粒試劑(下簡稱發(fā)光抗體試劑)和生物素標記抗體試劑，及親和素包被的感光微粒試劑檢驗樣本靈敏度參考品和質(zhì)控品QcL，QcH。初始反應條件依次添加25ul樣品、25ul發(fā)光微粒試劑、25ul生物素標記抗體試劑、175ul親和素包被的感光微粒，兩步溫浴，其中第一溫浴時間為20min，第二溫浴時間為15min。1.3.1發(fā)光抗體和生物素化抗體濃度的篩選親和素包被的感光微粒采用40ug/ml的濃度，分別配制濃度為200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml的發(fā)光抗體以及濃度為20ug/ml、30ug/ml、40ug/ml的生物素化抗體交叉配對進行檢測，在初始條件下結(jié)果分別如下200ug/ml發(fā)光抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>對上述結(jié)果進行分析比較，發(fā)光試劑的濃度在300g/ml，生物素化抗體的濃度在30iig/ml時結(jié)果最為理想，故選擇以上濃度為工作濃度。1.3.2親和素包被的感光微粒濃度篩選發(fā)光抗體濃度選用300ug/ml，生物素化抗體的濃度選用30ug/ml，親和素包被的感光微粒濃度分別配制為30ug/ml，40ug/ml，50ug/ml，在初始反應條件下，結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>根據(jù)信噪比、Hook效應比較及QcL和QcH的測定濃度，親和素包被的感光微粒濃度在40ug/ml時結(jié)果最為理想。實施例7評價試驗試劑采用發(fā)光抗體試劑(濃度300ug/ml)、生物素標記抗體試劑(濃度為30ug/ml)及親和素包被的感光微粒試劑(濃度為40ug/ml)。檢測方法在反應孔中分別加入25ii1樣品，再依次加入25ii1發(fā)光試劑和25y1生物素化抗體試劑。然后放入儀器，由儀器自動按以下步驟操作振動，37t:溫育20分鐘，再自動加入親和素包被的感光微粒試劑175后37t:溫育15分鐘。儀器自動產(chǎn)生激光照射微孔計算每孔發(fā)光光子量，根據(jù)標準曲線可以推算樣品AFP濃度，單位是ng/ml，最后打印試驗報告。1.定量模式性能評價1.l分析靈敏度的檢測檢測10孔定標品1(Ong/ml)，計算其RLU均值(AVE)和二個標準偏差(SD)，以AVE士2SD反代入標準曲線，得到的濃度值即為本試劑盒的分析靈敏度分析靈敏度(ng/ml)0.395經(jīng)檢測，分析靈敏度分別為0.395ng/ml，不高于0.5ng/ml。1.2檢測范圍在3個臨床試驗點對1042個正常非癌癥患者的血樣進行檢測，99%的樣品AFP水平小于7.Ong/ml。而高濃度AFP水平的病人樣品可導致RLU(相對光子單位)的反常性下降(即高滴度的鉤帶效應)。在本測定方法中，AFP水平高達100ug/ml的病人樣品的檢測結(jié)果將大于1000ng/ml。因此確定檢測范圍為0.5-1000ng/ml。1.3線性的檢測對除0值外其他5點定標品(實施例5制備)做線性分析，計算線性相關系數(shù)r(r應大于0.99)，r=0.9991.4精密性的檢測分別采用2個批號的試劑對高、低2個水平的胎兒甲種球蛋白(AFP)質(zhì)控品進行檢測，重復10次，將結(jié)果數(shù)值代入公式，計算CV值<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>由上述結(jié)果確定雖然本產(chǎn)品在AFP濃度125ug/ml時測定結(jié)果依然大于lOOOng/ml，但結(jié)果已經(jīng)與lOOOng/ml很接近，在AFP濃度lOOug/ml時檢測結(jié)果將大于1000ng/ml。1.6干擾性試驗在一份已知濃度的臨床標本中添加血紅蛋白、甘油三酯及膽紅素制成250mg/dL血紅蛋白的溶血標本、500mg/dL甘油三酯的脂血標本及10mg/dL膽紅素的黃疸標本進行檢測，測定值與原濃度的偏差不得超過10%。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>由上述結(jié)果可知，500mg/dL甘油三酯、250mg/dL血紅蛋白和10mg/dL膽紅素對本產(chǎn)品無明顯干擾實施例8比較試驗試劑采用發(fā)光抗體試劑(300ug/ml)、生物素標記抗體試劑(30ug/ml)及親和素包被的感光微粒試劑(40ug/ml)。以羅氏公司AFP試劑盒(電化學發(fā)光系統(tǒng))為參照進行了質(zhì)量水平比較，結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>收集經(jīng)ROCHE公司AFP試劑盒檢測過的臨床標本332份，再以本發(fā)明的AFP光激化學發(fā)光檢測試劑盒測定每份標本，作平行比較，結(jié)果如圖4。結(jié)果表明兩種方法間的相關性:y=0.8313x+0.8264，r=0.991。說明本發(fā)明的胎兒甲種球蛋白檢測試劑盒(光激化學發(fā)光法)跟國外知名廠家生產(chǎn)的類似產(chǎn)品相比，整個產(chǎn)品的技術(shù)指標大致相當。且該試劑盒成本底、靈敏度高、精密性好、檢測范圍寬、操作簡便、省時，適合于向臨床推廣。實施例9試劑盒的組配將實施例1-3中按照各種方法制備的的三種試劑分別獨立包裝，組配后獲得基本試劑盒。可用于檢測待測樣本的光激化學反應光信號。在上述試劑盒中加入獨立包裝的實施例5配制的定標品后獲得定量檢測試劑盒?？捎糜诙繖z測胎兒甲種球蛋白(AFP)。權(quán)利要求一種用于檢測胎兒甲種球蛋白的檢測微粒，為抗-AFP抗體包被的發(fā)光微粒。2.如權(quán)利要求1所述用于檢測胎兒甲種球蛋白的檢測微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒粒徑為50nm到400nm。3.如權(quán)利要求1所述用于檢測胎兒甲種球蛋白的檢測微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒表面官能團選自羧基或醛基。4.如權(quán)利要求1所述用于檢測胎兒甲種球蛋白的檢測微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒的發(fā)光量為150，000-350，000光子數(shù)/100yg發(fā)光微粒。5.如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述用于檢測胎兒甲種球蛋白的檢測微粒，其特征在于，所述檢測微粒經(jīng)如下工藝制得a)混合將發(fā)光微粒與抗-AFP抗體混合于緩沖液中；b)反應加入緩沖液配制的EDAC溶液混合并反應；c)往步驟b獲得的反應液中加入緩沖液配制的BSA溶液混勻并反應；d)清洗產(chǎn)物，獲得抗-AFP抗體包被的發(fā)光微粒。6.如權(quán)利要求5所述用于檢測胎兒甲種球蛋白的檢測微粒，其特征在于，所述緩沖液為MES緩沖液。7.如權(quán)利要求5所述用于檢測胎兒甲種球蛋白的檢測微粒，其特征在于，所述步驟a中，發(fā)光微粒與抗-AFP抗體的質(zhì)量比例為(8-15):1。8.如權(quán)利要求7所述用于檢測胎兒甲種球蛋白的檢測微粒，其特征在于，所述，發(fā)光微粒與抗-AFP抗體的質(zhì)量比例為12.5:1。9.如權(quán)利要求5所述用于檢測胎兒甲種球蛋白的檢測微粒，其特征在于，所述步驟d的清洗的方式為離心法清洗。10.—種胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒，包括權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述用于檢測胎兒甲種球蛋白的檢測微粒。11.如權(quán)利要求io所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括生物素標記的抗-AFP抗體或親和素包被的感光微粒中的一種或兩種。12.如權(quán)利要求11所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒，其特征在于，所述生物素標記的抗-AFP抗體中，生物素與抗體的分子比例為(10-20):1。13.如權(quán)利要求11所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒，其特征在于，所述親和素包被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質(zhì)量比例為1:(3-10)。14.如權(quán)利要求11所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒，其特征在于，所述用于檢測胎兒甲種球蛋白的檢測微粒、生物素標記的抗-AFP抗體以及親和素包被的感光微粒分別獨立包裝，且均為混懸液。15.如權(quán)利要求14所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒，其特征在于，所述混懸液的溶劑選自HEPES緩沖體系或Tris緩沖體系。16.如權(quán)利要求15所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒，其特征在于，所述用于檢測胎兒甲種球蛋白的檢測微?；鞈乙旱娜軇镻H8.0的成分為HEPES、NaCl和EDTA-Na_2H20的HEPES緩沖液。17.如權(quán)利要求15所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒，其特征在于，所述生物素標記的抗-AFP抗體混懸液的溶劑為pH8.0的成分為Tris、NaCl和EDTA-Na_2H20的Tris緩沖液。18.如權(quán)利要求15所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒，其特征在于，所述親和素包被的感光微?；鞈乙旱娜軇槌煞譃镠EPES、NaCl和EDTA-Na_2H20的HEPES緩沖液。19.如權(quán)利要求14所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒，其特征在于，所述混懸液中還包括蛋白保護劑、防止微粒聚集的穩(wěn)定試劑或防腐劑中的一種或多種。20.如權(quán)利要求10-19中任一權(quán)利要求所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒中還包括陽性對照和陰性對照。21.如權(quán)利要求10-19中任一權(quán)利要求所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括多種已知濃度的胎兒甲種球蛋白溶液，不同濃度的胎兒甲種球蛋白溶液分別獨立包裝。22.如權(quán)利要求10-21中任一權(quán)利要求所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒的使用方法，包括下列步驟a)在反應孔中加入樣品、試劑盒中用于檢測胎兒甲種球蛋白的檢測微粒和生物素標記的抗-AFP抗體，獲得初始反應溶液，混合反應；b)再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應溶液進行反應；c)激發(fā)光照射反應孔，測量每個反應孔發(fā)光光子量獲得光信號值。23.如權(quán)利要求22所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述激發(fā)光光源波長范圍為600-700nm。24.如權(quán)利要求22所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述激發(fā)光光源的功率范圍為5-100mw。25.如權(quán)利要求22所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟a和b的反應條件為37t:溫育10-30分鐘。26.如權(quán)利要求25所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟a的反應條件為37t:溫育20分鐘，步驟b的反應條件為37t:溫育15分鐘。27.如權(quán)利要求22所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述用于檢測胎兒甲種球蛋白的檢測微粒為混懸液，用于檢測胎兒甲種球蛋白的檢測微粒在混懸液中的濃度為200-400ug/ml;所述生物素標記的抗-AFP抗體為混懸液，生物素標記的抗-AFP抗體在混懸液中的濃度為30-40ug/ml;所述親和素包被的感光微粒為混懸液，親和素包被的感光微粒在混懸液中的濃度為30-50ug/ml。28.如權(quán)利要求27所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述用于檢測胎兒甲種球蛋白的檢測微粒在混懸液中的濃度為300ug/ml;所述生物素標記的抗-AFP抗體在混懸液中的濃度為30ug/ml;所述親和素包被的感光微粒在混懸液中的濃度為40ug/ml。29.如權(quán)利要求22所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述初始反應溶液的體積為45-75ul;最終反應溶液的體積為150-250ul。30.如權(quán)利要求29所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述初始反應溶液的體積為75ul;最終反應溶液的體積為250ul。31.如權(quán)利要求22-30中任一權(quán)利要求所述胎兒甲種球蛋白的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，還包括根據(jù)標準曲線計算待測樣品AFP含量。全文摘要本發(fā)明涉及胎兒甲種球蛋白的診斷試劑，公開了一種胎兒甲種球蛋白的檢測微粒，為抗-AFP抗體包被的發(fā)光微粒。本發(fā)明還公開了上述胎兒甲種球蛋白的檢測微粒的制備及應用。此外，本發(fā)明又進一步公開了一種測定樣品中胎兒甲種球蛋白的體外檢測試劑盒，同時公開了該試劑盒的使用方法。本發(fā)明的試劑盒可定量測定人血清樣品中胎兒甲種球蛋白，可以與其它血清和臨床信息聯(lián)合用于癌癥的輔助診斷及癌癥病人治療效果的監(jiān)測。文檔編號G01N33/68GK101769931SQ200810204998公開日2010年7月7日申請日期2008年12月30日優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日發(fā)明者王海蛟,趙衛(wèi)國,陳晨輝申請人:博陽生物科技(上海)有限公司